羅石任，王昭，李潔

河南省洛陽正骨醫(yī)院河南省骨科醫(yī)院，河南 鄭州 450000

頑痹清丸HPLC指紋圖譜研究

羅石任，王昭，李潔

河南省洛陽正骨醫(yī)院河南省骨科醫(yī)院，河南 鄭州 450000

目的 建立頑痹清丸高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜評價體系，為頑痹清丸的質(zhì)量控制提供依據(jù)。方法 以Agilent C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）為色譜柱，以乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動相梯度洗脫，流速1.0 mL/min，檢測波長258 nm，進樣量20 μL。對10批頑痹清丸樣品進行測定，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004 A）》建立頑痹清丸的標準指紋譜，并計算各批樣品的相似度。結(jié)果 所建立的頑痹清丸指紋圖譜共確定20個共有峰，相似度不低于0.98，5個峰得到化學確認。結(jié)論 建立的HPLC指紋圖譜方法穩(wěn)定易行，重復性好，可用于頑痹清丸的質(zhì)量評價。

頑痹清丸；高效液相色譜法；指紋圖譜

頑痹清丸為本院醫(yī)院制劑[豫藥制字Z20120245（洛）]，由忍冬藤、絡石藤、桑枝、黃芩等14味藥組成，具有清熱除濕、祛風通絡功效，適用于風濕熱痹阻經(jīng)絡所致風濕性關(guān)節(jié)炎、類風濕關(guān)節(jié)炎、骨性關(guān)節(jié)炎等。中藥指紋圖譜能全面反映中藥內(nèi)在化學成分的種類與數(shù)量，利用指紋圖譜相似度評價結(jié)果可直觀分析不同批次制劑的質(zhì)量差異，指導制劑生產(chǎn)過程中原藥材的選擇及生產(chǎn)工藝的優(yōu)化[1-3]。本研究采用高效液相色譜法（HPLC）建立頑痹清丸指紋圖譜，為全面控制其質(zhì)量及進一步研究提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent 1100高效液相色譜儀（美國），XS205DU型分析天平（梅特勒-托利多有限公司），TP300型超聲波提取器（天鵬電子新技術(shù)北京有限公司），HHS26s型數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市大地自動化儀器廠）。

頑痹清丸（批號20101109、20101220、20110105、20110214、20110321、20110510、20110615、20110723、20110903、20111020），河南省正骨研究所提供；對照品馬錢苷（批號111640-201005）、黃芩苷（批號110715-201016）、蛻皮甾酮（批號110715-201016）、丹皮酚（批號110715-201016）、吳茱萸堿（批號110715-201016）均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈為色譜純，水為雙蒸水，其余所用試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液制備

取馬錢苷對照品、黃芩苷對照品、丹皮酚對照品、吳茱萸對照品、蛻皮甾酮對照品適量，精密稱定，加甲醇制成濃度分別為40.50、138.8、124.3、68.5、118.9 μg/mL的對照品溶液。

2.2 供試品溶液制備

取各批次頑痹清丸適量，研細，取約2.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇40 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率250 W，頻率33 kHz）40 min，放至室溫，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，濾液濃縮并定容至10 mL，用0.45 μm微孔濾膜過濾，作為供試品溶液。

2.3 色譜條件

色譜柱：Agilent C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以乙腈為流動相A，0.1%磷酸水溶液為流動相B，按表1進行梯度洗脫；記錄時間為77 min；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL/min；檢測波長：258 nm；進樣量：20 μL。

表1 流動相梯度洗脫程序（%）

2.4 方法學考察

2.4.1 重復性試驗 分別精密稱取同一批樣品6份，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，分別進樣，記錄指紋圖譜。各共有峰的相對保留時間和相對峰面積積分值RSD均＜3%，符合指紋圖譜要求，表明該方法重復性良好。

2.4.2 精密度試驗 精密吸取同一對照品溶液20 μL，按“2.2”項下色譜條件進樣，連續(xù)進樣5次，記錄指紋圖譜，結(jié)果顯示，共有峰的相對保留時間和相對峰面積積分值的RSD均＜3%，表明該方法精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗 取同一批供試品溶液，分別于0、4、6、8、12、24 h測定結(jié)果，記錄指紋圖譜，共有峰的相對保留時間和相對峰面積積分值RSD均＜3%，符合指紋圖譜要求，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 頑痹清丸高效液相色譜指紋圖譜

2.5.1 指紋圖譜的建立 按“2.2”項下方法制備10批頑痹清丸樣品，按“2.3”項下色譜條件進樣，得到10批頑痹清丸HPLC指紋圖譜，將其導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004 A）》，進行色譜法匹配，結(jié)果見圖1。所得指紋圖譜共有模式見圖2。以15號峰作為參照，計算各共有峰相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果見表2、表3。

圖110 批頑痹清丸樣品HPLC指紋圖譜

圖2 頑痹清丸樣品指紋圖譜共有模式

表210 批頑痹清丸樣品相對保留時間

表310 批頑痹清丸樣品相對峰面積

2.5.2 指紋圖譜相似度測定 采用國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004 A）》軟件，采用相關(guān)系數(shù)法對10批頑痹清丸進行相似度計算，結(jié)果見表4。結(jié)果表明，10批樣品相似度良好。

2.5.3 各峰歸屬的判斷 通過與對照品保留時間進行對照，確認了其中5個指紋峰：5號峰為馬錢苷，7號峰為蛻皮甾酮，10號峰為黃芩苷，15號峰為丹皮酚，19號峰為吳茱萸堿。對照品色譜圖見圖3。

批號 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 對照S1 1 0.987 0.996 0.994 0.996 0.997 0.995 0.993 0.994 0.994 0.997 S2 0.987 1 0.984 0.982 0.985 0.987 0.986 0.990 0.988 0.988 0.991 S3 0.996 0.984 1 0.991 0.992 0.999 0.997 0.994 0.995 0.995 0.997 S4 0.994 0.982 0.991 1 0.999 0.991 0.993 0.993 0.993 0.993 0.995 S5 0.996 0.985 0.992 0.999 1 0.992 0.994 0.995 0.995 0.995 0.997 S6 0.997 0.987 0.999 0.991 0.992 1 0.998 0.995 0.996 0.996 0.998 S7 0.995 0.986 0.997 0.993 0.994 0.998 1 0.997 0.998 0.998 0.999 S8 0.993 0.990 0.994 0.993 0.995 0.995 0.997 1 0.998 0.999 0.998 S9 0.994 0.988 0.995 0.993 0.995 0.996 0.998 0.998 1 0.988 0.999 S10 0.994 0.988 0.995 0.993 0.995 0.996 0.998 0.999 0.988 1 0.999對照 0.997 0.991 0.997 0.995 0.997 0.998 0.999 0.998 0.999 0.999 1

3 討論

本試驗考察了甲醇、50%甲醇、70%甲醇3種提取溶劑的提取效果[4-6]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以50%甲醇作為提取溶劑的樣品溶液所得峰數(shù)較多，但雜質(zhì)也很多，很難使每個色譜峰完全分離，且所得色譜圖特征不明顯；甲醇為提取溶劑比70%甲醇和50%甲醇提取所得的樣品溶液色譜峰少；70%甲醇作為提取溶劑的樣品溶液所得的供試品峰數(shù)較多，且色譜峰分離度較好。因此選用70%甲醇作為提取溶劑。試驗還考察了以70%甲醇為提取溶劑超聲和水浴回流2種提取方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)超聲提取所得色譜峰比回流所得色譜峰多，因此采用超聲提取法作為供試品溶液的提取方法。

本試驗曾采用甲醇-水、乙腈-水不同比例變化的流動相梯度洗脫系統(tǒng)進行洗脫[7-8]，結(jié)果乙腈-水作為流動相時色譜峰分離效果比甲醇-水作為流動相峰的分離效果好，且基線較為平穩(wěn)，但個別峰的分離效果不佳，在水相中加入0.1%磷酸進行調(diào)節(jié)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)效果改善明顯，各色譜峰的分離效果較好，最后確定流動相洗脫系統(tǒng)為乙腈-0.1%磷酸水溶液梯度洗脫[9]。試驗曾采用236、258、265、274、280 nm波長進行測定[10]，經(jīng)比較后發(fā)現(xiàn)，258 nm波長處基線平穩(wěn)、出峰穩(wěn)定，故確定258 nm為檢測波長。選用Agilent C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）和Diamonsil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱進行測定，結(jié)果表明，Agilent C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）的分離效果較好，保留時間適宜，因此本試驗選擇Agilent C18柱為檢測色譜柱。

[1] 程紅,姚志紅,戴毅,等.中藥復方制劑仙靈骨葆膠囊HPLC指紋圖譜研究[J].中國藥學雜志,2013,48(10)：772-776.

[2] 李文博,韓建平,高鈞,等.養(yǎng)血清腦顆粒的高效液相色譜指紋圖譜研究[J].分析化學研究簡報,2011,39(3)：387-391.

[3] 孫國祥,王建會.雙黃連膠囊HPLC指紋圖譜的不確定度和可靠度研究[J].時珍國醫(yī)國藥,2011,22(12)：2831-2834.

[4] 唐云,劉漢清,唐海濤,等.蒲參膠囊的HPLC指紋圖譜研究[J].中國實驗方劑學雜志,2013,19(4)：133-137.

[5] 劉偉,楊艷玲,劉乃強,等.柴胡口服液HPLC指紋圖譜及柴胡皂苷b2的含量測定[J].中國實驗方劑學雜志,2013,19(8)：134-137.

[6] 張嫻,徐英宏.乳腺增生丸高效液相色譜指紋圖譜研究[J].醫(yī)藥導報, 2013,32(8)：1093-1097.

[7] 李潔,羅石任,王秀真,等.桃仁膝康丸HPLC指紋圖譜研究[J].中國中醫(yī)藥信息雜志,2013,20(10)：59-62.

[8] 王文燕,趙強,張鐵軍,等.決明子的HPLC指紋圖譜及模式識別研究[J].中草藥,2009,40(10)：1638-1641.

[9] 段天璇,于密密,劉春生,等.HPLC法同時測定甘草指紋圖譜暨甘草苷、甘草酸含量[J].中成藥,2006,28(2)：161-165.

[10] 劉艷華,趙陸華,黃劍,等.丹參HPLC指紋圖譜的研究[J].中國藥科大學學報,2002,33(2)：127-130.

Study on HPLC Fingerprint of Wanbiqing Pills

LUO Shi-ren, WANG Zhao, LI Jie (Luoyang

Orthopedic Hospital of Henan Province, Orthopedic Hospital of Henan Province, Zhengzhou 450000, China)

Objective To establish an evaluation system of HPLC fingerprint of Wanbiqing Pills; To provide references for the quality control of Wanbiqing Pills. Methods Wanbiqing Pills were analyzed with HPLC method. Analysis was performed on Agilent C18column (4.6 mm×250 mm, 5 μm) with the mobile phase of acetonitrile-0.1%H3PO4water gradient elution at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was 258 nm. Sample injection was 20 μL. Standard fingerprint of Wanbiqing Pills was established based on Similarity Evaluation System for Chromatographic Fingerprint of TCM (Version 2004 A). The similarity of Wanbiqing Pills from different batches was computed. Results A standard HPLC fingerprint procedure was developed for Wanbiqing Pills with 20 common peaks. The similarity of 10 batches of Wanbiqing Pills was not lower than 0.98. Five peaks received chemical confirmation. Conclusion The HPLC method is stable and feasible and with good repeatability, which can be used for the quality control of Wanbiqing Pills.

Wanbiqing Pills; HPLC; fingerprint

10.3969/j.issn.1005-5304.2016.01.023

R284.1

A

1005-5304(2016)01-0096-04

2015-03-20）

（

2015-04-10；編輯：陳靜）

王昭，E-mail：18337960862@163.com