姜麗媛+臧德奎+李文清

摘要：野生玫瑰中多糖多酚含量較高，DNA提取較為困難，本試驗(yàn)在植物基因組DNA CTAB提取法的基礎(chǔ)上，通過延長水浴時(shí)間、調(diào)整氯仿-異戊醇（24∶1）抽提次數(shù)為2～3次等一系列方法提高野生玫瑰基因組DNA的提取純度。以2×Es Taq MasterMix（含染料）10 μL，40 ng/μL DNA模板1 μL，10 pmol/μL引物 1 μL， ddH2O 8 μL為CDDP-PCR反應(yīng)體系，對(duì)21條CDDP引物進(jìn)行多態(tài)性篩選。結(jié)果表明，用改良的CTAB法提取的野生玫瑰基因組DNA純度較高；21條CDDP引物中有16條對(duì)野生玫瑰品種的鑒別能力較高。本研究為野生玫瑰CDDP分子標(biāo)記及后續(xù)各種分子生物學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：野生玫瑰；改良CTAB法；DNA提取； CDDP分子標(biāo)記

中圖分類號(hào)：S685.120.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2016）11-0013-05

Abstract DNA extraction of Rosa rugosa is difficult for their high contents of polyphenol and polysaccharide. Here a modified CTAB method for Rosa rugosa DNA extraction was presented through extending water-bath time， appropriately adjusting chloroform isoamyl alcohol （24∶1） extraction time to 2～3 times and etc. Twenty-one CDDP polymorphic primers were screened with reaction system containing 10 μL of 2 ×Es Taq MasterMix （including dye）， 1 μL of 40 ng/μL DNA template， 1 μL of 10 pmol/μL primer and 8 μL of ddH2O. The results showed that the genomic DNA of Rosa rugosa extracted with modified CTAB method owned high purity，and 16 CDDP primers had higher discriminating ability on Rosa rugosa. This research provided bases for CDDP molecular markers and subsequent molecular biology researches of Rosa rugosa.

Keywords Rosa rugosa； Modified CTAB method； DNA extraction； CDDP molecular marker

野生玫瑰（Rosa rugosa）是國家二級(jí)瀕危保護(hù)植物，分布在我國吉林圖們江河口、遼寧南部海岸以及山東東部沿海海岸[1]。野生玫瑰內(nèi)含有芬香、抗寒、抗旱等性狀基因，是栽培玫瑰育種資源的依托，因此深入了解野生玫瑰的遺傳變異、保護(hù)野生玫瑰資源具有重要意義。

基因組DNA是文庫構(gòu)建、分子標(biāo)記、基因克隆等分子生物學(xué)研究的基本前提，其提取純度直接影響整個(gè)試驗(yàn)的質(zhì)量。由于不同植物體細(xì)胞內(nèi)各種化學(xué)成分含量存在很大的差異，其DNA提取方法可能不同，甚至相同植物不同部位的 DNA 提取策略也不同[2]。

隨著以PCR為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)的迅速發(fā)展，分子標(biāo)記輔助育種成為當(dāng)前國際植物遺傳育種研究的熱點(diǎn)[3]。來源保守的DNA序列多態(tài)性（conserved DNA-derived polymorphism， CDDP）標(biāo)記是由Collard和Mackill開發(fā)的基于DNA保守序列的新型分子標(biāo)記[4]，它是一種單引物擴(kuò)增反應(yīng)，最先應(yīng)用于水稻，后來迅速在其他植物中得到應(yīng)用[5]。CDDP分子標(biāo)記的開發(fā)利用受益于植物基因組學(xué)和功能基因組學(xué)的快速發(fā)展，其引物序列的設(shè)計(jì)是根據(jù)植物基因組DNA中起重要作用的保守序列。不同植物間DNA保守序列均相當(dāng)保守，所以CDDP分子標(biāo)記技術(shù)能在不同物種間通用。在水稻上的研究表明，CDDP分子標(biāo)記具有操作便捷、應(yīng)用成本低、多態(tài)性豐富、可以有效產(chǎn)生與目標(biāo)性狀有關(guān)的標(biāo)記等優(yōu)點(diǎn)，是對(duì)RAPD、ISSR、TRAP、CoRAP、SCoT等標(biāo)記方法的有效補(bǔ)充，具有較好的應(yīng)用前景[6]。目前，CDDP分子標(biāo)記已經(jīng)應(yīng)用于菊花[7]、牡丹[8，9]等多種植物，但尚未見野生玫瑰種質(zhì)資源上CDDP分子標(biāo)記應(yīng)用的報(bào)道。

本研究主要著力于優(yōu)化野生玫瑰基因組DNA的提取方法和在CDDP引物中篩選出對(duì)野生玫瑰品種鑒別力較高、多態(tài)性豐富的引物，為后續(xù)進(jìn)行野生玫瑰的CDDP分子標(biāo)記研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料來源

以吉林琿春、遼寧莊河以及山東牟平、威海等地的野生玫瑰為研究材料，在2015年5月和7月采集新鮮幼葉，共120個(gè)樣品，用硅膠保存于-20℃。

1.2 試劑

液氮；PVP；提取介質(zhì)（4℃保存）；2×CTAB提取緩沖液；β-巰基乙醇；Tris-酚；氯仿-異戊醇（24∶1）；3 mol/L NaAc；無水乙醇；70%乙醇；1×TE；雙蒸水（ddH2O）。

1.3 儀器

電子天平；研缽；研棒；藥匙；冰盒；水浴鍋；低溫離心機(jī)；移液槍。

1.4 改良CTAB法提取野生玫瑰基因組DNA

1.4.1 準(zhǔn)備工作 ①將水浴鍋升溫至65℃；②將無水乙醇放入-20℃的冰箱內(nèi)預(yù)冷；③配制提取介質(zhì)（表1）和2×CTAB提取緩沖液（表2）；④將槍頭、CTAB提取緩沖液、提取介質(zhì)滅菌；⑤將藥匙放在液氮中預(yù)冷。

1.4.2 提取方法 ①用移液槍取1 mL提取介質(zhì)于2 mL離心管中，置于冰盒內(nèi)，標(biāo)好標(biāo)號(hào)。

②用電子天平稱取0.12～0.20 g幼嫩葉片于干燥研缽中，在研缽內(nèi)加入少許PVP，倒入約35 mL液氮，將葉片搗碎，待液氮即將揮發(fā)完時(shí)，快速研磨葉片，重復(fù)加入液氮2～3次，反復(fù)研磨直至葉片成細(xì)小的粉末狀（研磨的越細(xì)越好）。用泡在液氮中提前預(yù)冷的小匙快速將研缽中的葉片粉末轉(zhuǎn)移至已加好提取介質(zhì)的離心管內(nèi)，混勻，冰盒內(nèi)放置10 min， 7 000 r/min、4℃離心10 min，棄上清液。離心結(jié)束時(shí)把CTAB放入65℃水浴鍋內(nèi)預(yù)熱。

③加提取介質(zhì)，重復(fù)上述步驟，離心后棄上清液，向沉淀中加入40 μL β-巰基乙醇、800 μL CTAB，搖離心管至沉淀散開，放入65℃水浴鍋內(nèi)1 h，15 min搖勻一次。

④將離心管從水浴鍋中取出，冷卻5～6 min至室溫，搖勻加入400 μL Tris-酚、400 μL氯仿-異戊醇（24∶1），緩慢搖動(dòng)10 min，放入低溫離心機(jī)內(nèi)，12 000 r/min、4℃離心10 min。

⑤準(zhǔn)備新的2 mL離心管，寫好編號(hào)。從離心機(jī)內(nèi)取出離心管，取上清液800 μL（每次取200 μL ，最多取800 μL，若上清液較少也可以取600 μL）于新的2 mL離心管內(nèi)，加入等體積的氯仿-異戊醇（24∶1），輕輕緩慢搖動(dòng)10 min，使其充分混勻至上下不分層。

⑥將離心管放入離心機(jī)內(nèi)，12 000 r/min、4℃離心10 min，離心后觀察離心管內(nèi)中間的蛋白層，若中間蛋白質(zhì)較多，重復(fù)上述步驟（取上清液600 μL左右）。

⑦準(zhǔn)備新的1.5 mL離心管，寫好編號(hào)。用黃色平底槍頭取上清液400 μL（每次取100 μL）于1.5 mL離心管中，先加入上清液1/10體積的3 mol/L NaAc試劑，然后加入上清液2倍體積的-20℃無水乙醇，放入冰箱-20℃保存20 min。取出離心管，12 000 r/min、4℃離心3 min。

⑧棄上清液，用1 000 μL的70%乙醇洗滌5 min，重復(fù)2～3次，倒出乙醇，放置3～4 h晾干。

⑨用50 μL的1×TE溶解沉淀， 4℃冰箱內(nèi)保存（-20℃長期保存）。

1.4.3 DNA質(zhì)量檢測 向提取的DNA樣品中加入1 μL RNAase，37℃水浴鍋內(nèi)放置1 h，去除DNA內(nèi)的RNA。

瓊脂糖凝膠電泳檢測：配制0.8%瓊脂糖凝膠，取5 μL提取的DNA樣品加入2 μL loading buffer，混勻，點(diǎn)入瓊脂糖凝膠內(nèi)，在120 V電壓下電泳30 min，電泳結(jié)束后將瓊脂糖凝膠放于EB中染色30 min，最后在凝膠成像系統(tǒng)中觀察、拍照[10]。

分光光度計(jì)檢測DNA純度，高純度DNA的A260/280值應(yīng)在1.8～2.0之間，當(dāng)A260/280小于1.8時(shí)，DNA樣品中可能存在蛋白質(zhì)污染，當(dāng)A260/280大于2.0時(shí)，DNA樣品中RNA的含量較高[11]。

1.5 CDDP分子標(biāo)記引物篩選

從吉林琿春、遼寧莊河、山東威海、山東牟平四個(gè)地區(qū)的高質(zhì)量野生玫瑰基因組DNA中各挑選一個(gè)樣品，利用21條CDDP引物對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增。經(jīng)多次反應(yīng)體系試驗(yàn)，確定穩(wěn)定性良好的PCR擴(kuò)增體系：2×Es Taq MasterMix（含染料）10 μL，40 ng/μL DNA模板1 μL，10 pmol/μL引物1 μL，ddH2O 8 μL。PCR反應(yīng)程序設(shè)為94℃預(yù)變性3 min；94℃變性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)；72℃后延伸5 min，4℃保存。

CDDP-PCR擴(kuò)增結(jié)果檢測：取6 μL擴(kuò)增產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分離，電壓5 V/cm，電泳1.5～2 h，EB染色10 min后，在凝膠成像分析儀上進(jìn)行觀察并采集圖像。

本試驗(yàn)所用的21條CDDP引物都是由上海生工生物工程有限公司合成，引物編號(hào)及序列見表3。

2 結(jié)果與分析

2.1 野生玫瑰基因組DNA提取

本研究在植物基因組DNA CTAB提取法的基礎(chǔ)上，延長水浴時(shí)間至1 h，調(diào)整氯仿-異戊醇（24∶1）的抽提次數(shù)為2～3次，用此方法提取野生玫瑰基因組DNA。瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果（圖1）表明，DNA條帶明顯清晰、拖尾較輕，無明顯降解現(xiàn)象、完整性較好，說明改良CTAB法可以高效、便捷地提取野生玫瑰基因組DNA。

提取的野生玫瑰基因組DNA的A260/280值在1.60～1.85之間，提取的DNA濃度在1 200～2 500 ng/μL之間，DNA得率較高，因此改良CTAB法能有效提取出較高質(zhì)量的野生玫瑰基因組DNA。

2.2 CDDP分子標(biāo)記引物篩選

用21條CDDP引物對(duì)4個(gè)不同地區(qū)的野生玫瑰基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果（圖2，表4）表明，Pr11和Pr12沒有擴(kuò)增出任何條帶，其他引物均能擴(kuò)增出有效條帶；Pr5和Pr15可以對(duì)其中三個(gè)樣品進(jìn)行有效擴(kuò)增；引物Pr13的擴(kuò)增結(jié)果中僅有威海和牟平兩個(gè)地區(qū)出現(xiàn)條帶，且條帶數(shù)量較少；其余16條引物對(duì)四個(gè)不同地域的野生玫瑰基因組DNA均有理想的擴(kuò)增效果，其中引物Pr3、Pr8、Pr9和Pr19的擴(kuò)增總條帶數(shù)多且條帶清晰易辨。不同引物對(duì)不同地域的野生玫瑰基因組DNA的擴(kuò)增情況不同，體現(xiàn)了不同地域間的野生玫瑰資源存在遺傳差異。從表4可知，多態(tài)性比率達(dá)到100%的有Pr6、Pr10和Pr18 三條引物，最低的是Pr1為69.23%，其他引物的多態(tài)性條帶比例均較高。綜合考慮每個(gè)引物的鑒別能力和擴(kuò)增效果等情況，篩選出16條（Pr1、Pr2、Pr3、Pr4、Pr6、Pr7、Pr8、Pr9、Pr10、Pr14、Pr16、Pr17、Pr18、Pr19、Pr20、Pr21）CDDP引物，可作為核心引物用于野生玫瑰的鑒定與識(shí)別及遺傳多樣性分析等研究。

3 討論與結(jié)論

基因組DNA的提取是分子標(biāo)記研究的重要前提，DNA的質(zhì)量影響著試驗(yàn)的成敗。不同的植CDDP分子標(biāo)記是一種新型的標(biāo)記技術(shù)，引物設(shè)計(jì)的錨定位點(diǎn)在功能蛋白質(zhì)或功能基因序列中的保守區(qū)域，可以有效地產(chǎn)生其他性狀的連鎖標(biāo)記。本研究利用21條CDDP引物對(duì)吉林琿春、遼寧莊河以及山東牟平、山東威海四個(gè)地區(qū)的野生玫瑰基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，以2×Es Taq MasterMix（含染料）10 μL，40 ng/μL DNA模板1 μL，10 pmol/μL引物1 μL，ddH2O 8 μL為反應(yīng)體系，多態(tài)性比率達(dá)到100%的有Pr6、Pr10和Pr18三條引物，最低的是Pr1為69.23%，其他引物的多態(tài)性條帶比例均較高，有16條引物對(duì)野生玫瑰具有較高的鑒別能力。由于不同植物間的種質(zhì)資源遺傳多樣性較大，相同CDDP引物對(duì)不同植物的鑒別能力有所差異，如李瑩瑩[8]用同樣的21條引物進(jìn)行牡丹的CDDP分子標(biāo)記研究，最終有20條引物得到擴(kuò)增條帶；李田等[7]將此21條CDDP引物用于菊花，得到19條有效引物。但另一方面也證明了CDDP引物具有通用性、操作簡單、成本較低、易得到遺傳信息等優(yōu)勢[14]，更有利于反映物種遺傳變異的多樣性。

本研究結(jié)果證明了CDDP引物在野生玫瑰種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析和品種鑒定等方面具有應(yīng)用的可行性，為以后利用CDDP-PCR這一新型目的分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行野生玫瑰遺傳變異的深入研究提供一定的應(yīng)用基礎(chǔ)，也為此標(biāo)記在其它植物上的應(yīng)用研究提供了經(jīng)驗(yàn)與借鑒。

參 考 文 獻(xiàn)：

[1]傅立國， 金鑒明. 中國植物紅皮書——稀有瀕危植物（第一冊）[M].北京：科學(xué)出版社， 1992：558-559.

[2] Matasyoh L G， Wachira F N， Kinyua M G， et al. Leaf storage conditions and genomic DNA isolation efficiency in Ocimum gratissimum from Kenya[J]. African Journal of Biotechnology， 2008， 7（5）： 557-564.

[3] 王書珍， 張傳進(jìn)， 程華， 等. 杜鵑花表達(dá)序列標(biāo)簽資源中的微衛(wèi)星信息分析[J]. 湖北林業(yè)科技，2014， 43（2）：7-10.

[4] 熊發(fā)前， 蔣菁， 鐘瑞春， 等. 兩種新型目標(biāo)分子標(biāo)記技術(shù)——CDDP與 PAA[J]. 植物生理學(xué)通訊，2010（9）：871-879.

[5] 熊發(fā)前， 蔣菁， 鐘瑞春， 等. 分子標(biāo)記技術(shù)的兩種新分類思路及目標(biāo)分子標(biāo)記技術(shù)的提出[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2010， 26 （10）： 60-64.

[6] Collard B C Y， Mackill D J. Conserverd DNA-derived polymorphism （CDDP）： a simple and novel method for generating DNA markers in plants[J]. Plant Cell Reports， 2012， 31： 299-310.

[7] 李田， 郭俊娥， 鄭成淑， 等. 菊花品種的遺傳多樣性分析及CDDP指紋圖譜構(gòu)建[J].北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2014， 36（4）： 95-101.

[8] 李瑩瑩. 牡丹CDDP分子標(biāo)記引物篩選及多態(tài)性分析[J].核農(nóng)學(xué)報(bào)，2013，27（8）：1099-1105.

[9] 李瑩瑩， 鄭成淑. 利用CDDP標(biāo)記的菏澤牡丹品種資源的遺傳多樣性[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，46（13）： 2739-2750.

[10]李強(qiáng)， 高聚林， 蘇二虎， 等. 基于單因素試驗(yàn)的大豆CDDP-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2015， 43（3）：32-34，43.

[11]吳艷艷， 代德艷， 蔡春梅， 等. 一種改良的大豆DNA提取方法[J].大豆科學(xué)，2015，34（1）：113-115.

[12]王書珍， 張傳進(jìn)， 查三省， 等. 杜鵑基因組DNA提取方法的研究及應(yīng)用[J].林業(yè)科技通訊， 2015（2）：5-8.

[13]李承哲， 劉占林， 楊紅超， 等. 改良CTAB法提取鳶尾屬植物DNA[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2011（8）：31-34.

[14]王小文. 基于CDDP標(biāo)記的不同花色牡丹的遺傳關(guān)系分析[D]. 泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2015.