曹麗霞，楊玉梅

(包頭醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭014060)

缺血性腦損傷神經(jīng)細胞凋亡及其相關(guān)基因的表達*

曹麗霞，楊玉梅

(包頭醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭014060)

缺血性腦損傷后神經(jīng)元的死亡包括凋亡和壞死，近年來，缺血性腦損傷的研究中主要集中在缺血后的細胞凋亡過程。細胞凋亡又稱程序性細胞死亡，是指在某些生理或病理刺激誘導(dǎo)下，機體為維護內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，通過多種調(diào)控因子相互激活和表達，激活DNA內(nèi)切酶，從而使細胞正常死亡的過程。細胞凋亡主要發(fā)生在缺血周圍區(qū)，是一種涉及多種基因及其蛋白相互作用的自主死亡的過程。因此，對腦缺血后神經(jīng)元損傷的作用靶點和作用機制進行系統(tǒng)深入的研究具有重要意義。

1 細胞凋亡通路

1.1 Caspase依賴性凋亡通路

1.1.1 內(nèi)源性線粒體通路 缺血性腦損傷后，由于線粒體通透性轉(zhuǎn)位孔(mitochondrial permeability transition pore，MPTP)在各種凋亡誘導(dǎo)因素刺激下不可逆地過度開放，導(dǎo)致細胞色素C、絲氨酸蛋白酶(high temperature requirement protein A2，HtrA2)、第二線粒體衍生的天冬氨酸蛋白水解酶激活劑(second mitochondria-derived activator of caspase，Smac)等從線粒體膜間隙釋放至胞漿內(nèi)［1］。細胞色素C與凋亡蛋白酶活化因子-1(apoptotic protease activating factor-1，Apaf-1)結(jié)合形成凋亡小體，活化Procaspase-9，導(dǎo)致Caspase-3激活，介導(dǎo)細胞凋亡［2］;此外，當(dāng)神經(jīng)細胞發(fā)生凋亡時，SmacDIABLO能通過和凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein，IAP)結(jié)合抑制活化的Caspase-9，促進Caspase-3的激活，引起細胞凋亡［3］。

1.1.2 外源性死亡受體通路 死亡受體(death receptor，DR)屬于腫瘤壞死因子受體超家族中的一個亞家族。Fas、TNFR1、DR3、DR4是目前研究比較清楚的死亡受體。由Fas-Fas-L和TNFR為代表介導(dǎo)的細胞凋亡通路研究最多。

腦缺血后神經(jīng)細胞受到缺血等一系列刺激后，細胞表面的Fas配體(Fas ligand，F(xiàn)asL)、TNF配體(tumor necrosis factor α，TNFα)分別與相應(yīng)的受體(FasR，TNFR1)結(jié)合，使受體相互交聯(lián)形成三聚體并激活，通過死亡效應(yīng)域(death effect domain，DED)結(jié)合Fas相關(guān)死亡域蛋白(Fas -associated protein with death domain，F(xiàn)ADD)和 Procaspase-8形成死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物(death-inducing signaling complex，DISC)，該死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物導(dǎo)致Caspase-8被活化，激活的Caspase-8啟動蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)，從而活化下游的效應(yīng)酶Caspase，誘導(dǎo)Fas介導(dǎo)的細胞凋亡［4］。

1.2 Caspase非依賴性凋亡通路 腦缺血后，DNA發(fā)生損傷，大量表達多聚ADP核糖聚合酶-1(poly ADP-ribose polymerase-1，PARP-1)，PARP-1催化生成多聚ADP核糖(Poly ADP-ribose，PAR)，PAR進入線粒體使線粒體釋放凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis inducing factor，AIF)并轉(zhuǎn)位進入核內(nèi)，導(dǎo)致染色質(zhì)濃縮和DNA降解，形成PARP-1過度表達的惡性循環(huán);當(dāng)細胞接受凋亡信號刺激后，Bcl 2/腺病毒E1B 19kDa相互作用蛋白3(Bcl-2/ adenovirus E1B 19 kDa-interacting protein 3，BNIP 3)同源二聚體和線粒體外膜結(jié)合，使MPTP開放，導(dǎo)致線粒體內(nèi)的核酸內(nèi)切酶G(endonuclease G，EndoG)被釋放并轉(zhuǎn)移至核內(nèi)。同時，在細胞核內(nèi)AIF和Endo G相互作用，導(dǎo)致DNA斷裂和染色質(zhì)凝聚，從而導(dǎo)致不依賴Caspase的細胞凋亡［5］。總之，這 3條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路都是通過caspase-3完成最終的激活。其中線粒體介導(dǎo)的細胞凋亡通路作為經(jīng)典的凋亡通路，近年來受到人們的廣泛關(guān)注。

2 細胞凋亡相關(guān)基因的表達

細胞凋亡受多種基因調(diào)控，包括Bcl-2家族基因、Caspase-3基因、p53基因、Fas基因、熱休克蛋白(heat stock protein，HSP)基因、即早基因(immediate-early genes，IEGs)等［6］。

2.1 Bcl－2基因家族在缺血性腦損傷中的表達

2.1.1 Bcl-2在缺血性腦損傷中的表達 B細胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/leukemia 2，Bcl-2)是從濾泡性淋巴瘤中分離出來的細胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中最重要的凋亡抑制基因。凋亡抑制基因Bcl-2高表達能抑制MPTP的開放，阻止細胞色素C及促凋亡相關(guān)蛋白釋放到線粒體膜外，從而抑制caspase-3的激活，導(dǎo)致各種因素誘導(dǎo)的細胞凋亡。Bcl-2還能通過抑制氧自由基結(jié)合Bax蛋白，從而抑制細胞凋亡。

崔芳琴等［7］通過建立腦缺血再灌注模型，觀察不同缺血時間的小鼠腦組織免疫組織化學(xué)染色切片，證實了在腦缺血早期受損神經(jīng)元內(nèi)，Bcl-2表達上調(diào)。但是隨著缺血時間進一步延長，Bcl-2表達進一步減少，為臨床上使用Bcl-2激動劑治療腦缺血提供依據(jù)。

2.1.2 Bax在缺血性腦損傷中的表達 Bax是最早發(fā)現(xiàn)的促凋亡基因，正常情況下，胞質(zhì)中的Bax以單體形式存在。在凋亡信號誘導(dǎo)下，胞質(zhì)中的Bax以無活性的單體形式轉(zhuǎn)移至線粒體，與線粒體膜結(jié)合使其構(gòu)型發(fā)生改變，形成異源二聚體復(fù)合物，使線粒體通透性發(fā)生改變，開放線粒體通透轉(zhuǎn)換孔，釋放凋亡因子如細胞色素C等，細胞色素C與AIF及procaspase-9結(jié)合形成“凋亡小體”，從而啟動細胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)［8］。

高紅莉等［9］通過建立大鼠腦缺血再灌注模型，研究血府逐瘀湯對腦缺血再灌注大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細胞凋亡的影響。結(jié)果顯示，模型組與假手術(shù)組比較，大鼠腦組織中Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA表達顯著增加，血府逐瘀湯大、中、小劑量給藥組大鼠腦組織中Bax、Caspase-3 mRNA的表達量較模型組明顯降低，而Bcl-2 mRNA表達較模型組明顯升高。提示血府逐瘀湯可能通過下調(diào)神經(jīng)細胞Bax、Caspase-3 mRNA的表達，上調(diào)Bcl-2 mRNA的表達，抑制細胞凋亡。

2.2 Caspase在缺血性腦損傷中的表達 Caspase-3是細胞凋亡信號通路中最關(guān)鍵的效應(yīng)酶，在神經(jīng)細胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)中處于核心位置。各種因素引起的細胞凋亡都是通過 caspase-3完成最終激活的。在正常細胞中Caspase-3合成后以酶原和無活性的形式存在，當(dāng)細胞發(fā)生凋亡時，激活的Caspase-3可以使一系列NF-κB、結(jié)構(gòu)蛋白及多聚ADP核糖聚合酶活化，形成凋亡小體和DNA片段化，從而介導(dǎo)細胞凋亡。

有研究發(fā)現(xiàn)，在腦缺血再灌注模型組 Caspase-3 mRNA表達明顯高于假手術(shù)組，凋亡細胞顯著增多;與模型組比較，天麻素大、中、小劑量組和尼莫地平組Caspase -3 mRNA表達明顯降低，提示天麻素可通過下調(diào)Caspase-3 mRNA的表達，抑制神經(jīng)細胞凋亡，從而有效地保護腦缺血。張曼等［10］研究結(jié)果顯示，缺血再灌注模型組Caspase-3蛋白表達較假手術(shù)組顯著增加;菟絲子黃酮50mg/kg、l00mg/kg劑量組和尼莫地平組Caspase-3蛋白的表達較缺血再灌注模型組顯著減少。提示菟絲子黃酮可以通過下調(diào)Caspase-3蛋白的表達，從而抑制神經(jīng)細胞凋亡。

2.3 p53在缺血性腦損傷中的表達 p53是一種與腫瘤密切相關(guān)的抑癌基因，包括野生型p53和突變型p53。野生型p53是促凋亡基因，它可以直接導(dǎo)致細胞凋亡，也可以通過激活一系列下游基因間接導(dǎo)致細胞凋亡。當(dāng)細胞發(fā)生凋亡時，p53能通過上調(diào)促凋亡基因，下調(diào)抗凋亡基因，在缺血性腦損傷中發(fā)揮重要作用。

許妍妍等［11］發(fā)現(xiàn)在缺血再灌注后2 h，p53表達的陽性細胞數(shù)微量增多，3 h后略有增多，6 h后顯著增多，并持續(xù)增多至12 h。RT-PCR結(jié)果顯示，假手術(shù)組中p53 mRNA僅有微量表達，在缺血2～3 h大鼠腦組織中p53 mRNA僅有微量表達，6 h表達顯著增多，并持續(xù)增多至12 h。

2.4 IEGs在缺血性腦損傷中的表達 即早基因(immediate-early genes，IEGs)是一類對外界刺激信號傳入數(shù)分鐘內(nèi)即刻作出反應(yīng)進行表達的基因。在正常情況下，c -fos低水平表達。當(dāng)細胞發(fā)生凋亡時，F(xiàn)os蛋白由胞質(zhì)轉(zhuǎn)入細胞核內(nèi)，通過和Jun蛋白相互作用形成異源二聚體轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物(activator protein 1，AP-l)，使其與DNA結(jié)合位點特異性結(jié)合，從而調(diào)控靶基因快速而短暫的表達［12］。

陳江君等［13］通過觀察不同缺血時間的大鼠腦組織免疫組織化學(xué)染色切片發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組陽性細胞數(shù)僅有微量表達;模型組海馬CA1區(qū)c-fos陽性細胞數(shù)在缺血灌注3 h表達顯著增加，48 h達高峰，72 h仍有表達;紅景天干預(yù)組c-fos陽性細胞數(shù)較同時相模型組比較明顯降低。

2.5 Fas在缺血性腦損傷中的表達 Fas是重要的促調(diào)亡基因。一方面，F(xiàn)asL與Fas兩者結(jié)合，使Fas死亡區(qū)交聯(lián)，產(chǎn)生神經(jīng)酰胺，通過某種途徑，激活內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶，引起凋亡。另一方面，F(xiàn)asL與FasR結(jié)合，使受體相互交聯(lián)形成三聚體并激活，通過DED結(jié)合Fas相關(guān)死亡域蛋白(Fas-associated protein with death domain，F(xiàn)ADD)和Procaspase-8形成死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物，該死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物導(dǎo)致Caspase-8被活化，從而活化下游的效應(yīng)酶Caspase，誘導(dǎo)Fas介導(dǎo)細胞凋亡。

實驗發(fā)現(xiàn)川芎嗪可通過下調(diào)腦缺血再灌注誘導(dǎo)的Fas-L蛋白表達，從而抑制神經(jīng)細胞凋亡。通過觀察不同缺血時相大鼠腦組織免疫組織化學(xué)染色切片發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注組大鼠腦組織神經(jīng)細胞凋亡數(shù)目及Fas蛋白陽性細胞數(shù)目較假手術(shù)組顯著增多;Fas蛋白陽性細胞數(shù)目在缺血再灌注后6 h達高峰，24 h開始下降，細胞凋亡數(shù)目在缺血再灌注6 h顯著增加，24 h達高峰，36 h略有下降［14］。

2.6 HSP在缺血性腦損傷中的表達 熱休克蛋白(heat stock protein，HSP)是一組進化上高度保守的細胞內(nèi)可溶性蛋白。HSP70在腦缺血損傷研究中備受關(guān)注。正常情況下，HSP70 mRNA在腦內(nèi)表達穩(wěn)定，但很快被降解;應(yīng)激狀態(tài)下，其他蛋白合成受到抑制，HSP70表達反而增強，敲除HSP基因后，HSP表達下降，細胞凋亡增多。

研究發(fā)現(xiàn)，模型組與假手術(shù)組比較，大鼠腦組織中HSP70 mRNA及其蛋白表達明顯增多，通心絡(luò)治療組HSP70 mRNA表達較模型組顯著增多。提示通心絡(luò)可以促進應(yīng)激保護性蛋白 HSP70表達，從而抑制細胞凋亡［15］。

綜上所述，腦組織缺血缺氧后會引發(fā)一系列的病理改變，其中有關(guān)缺血所引發(fā)的神經(jīng)細胞凋亡在近些年來的研究中備受關(guān)注。腦缺血后的神經(jīng)細胞凋亡是一個復(fù)雜的瀑布式級聯(lián)反應(yīng)，這些凋亡調(diào)控因子之間相互協(xié)同或相互制約，共同構(gòu)成一種復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)共同完成對細胞凋亡的調(diào)控。然而細胞凋亡所涉及的傳導(dǎo)通路和分子機制尚不清楚，因此，對這些凋亡調(diào)控因子進行系統(tǒng)深入的研究，將利于我們進一步探索神經(jīng)元損傷的作用靶點和作用機制，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

［1］ Elmore S.Apoptosis:a review of programmed cell death［J］. Toxicol Pathol，2007，35(9):495-516.

［2］ Sims NR，Muyderman H.Mitochondria，oxidative metabolism and cell death in stroke［J］.Biochim Biophys Acta，2010，1802(1):80-91.

［3］ Ekert PG，Silke J，Hawkins CJ，et al.DIABLO promotes apoptosis by removing MIHA/XIAP from processed Caspase-9［J］.J Cell Biol，2001，152(3):483-490.

［4］ Tang W，Wang W，Zhang Y，et al.Tumor necrosis factor related apoptosis-inducing ligand(TRAIL)-induced chemokine release in both TRAIL resistant and TRAIL-sensitive cells via nuclear factor kappa B［J］.FEBS Lett，2009，276 (2):581-593.

［5］ Lee BI，Lee DJ，Cho KJ，et al.Early nuclear translocation of endonuclease G and subsequent DNA fragmentation after transient focal cerebral ischemia in mice［J］.Neurosci Lett，2005，386(1):23-27.

［6］ Markus HS.Cerebral perfusion and stroke［J］.J Neurol Neurosurq Psychiatry，2004，75(3):353-361.

［7］ 崔芳琴，楊衛(wèi)東，陳前芬，等.不同時間腦缺血傅灌注損傷小鼠大腦Bcl-2和Caspase-3表達的變化［J］.中國老年學(xué)雜志，2014，34(10):2765-2767.

［8］ Wu C，F(xiàn)ujihara H，Yao J，et al.Different Expression Patterns of Bcl-2，Bcl-xl，and Bax Proteins after sublethal forebrain ischemia in C57Black/Crj6 mouse striatum［J］. Stroke，2003，34(7):1803-1808.

［9］ 高紅莉，葉文靜，曲曉蘭，等.血府逐瘀湯對大鼠局灶性腦缺血損傷的保護作用及其作用機制［J］.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2014，34(13):1052-1056.

［10］ 張曼，王桂敏.菟絲子黃酮對大鼠腦缺血再灌注損傷后細胞凋亡及Bcl-2、Bax、Caspase-3表達的影響［J］.中藥藥理與臨床，2014，30(5):78-81.

［11］ 許妍妍，劉麗莉，劉春春，等.缺血再灌注大鼠腦皮質(zhì)Bcl -2、Bax、和P53的動態(tài)表達［J］.2012，38(4):697-700.

［12］ Stacey MO，Rosemary AK，F(xiàn)rederick AM，et al.Ischemia preconditioning protects against gut dysfunction and mucosal injury after ischemia/reperfusion injury［J］.Shock，2005，23(3):258-263.

［13］ 陳江君，劉寧，陳軍，等.紅景天對大鼠腦缺血再灌注c -Fos表達及神經(jīng)細胞凋亡的影響［J］.中國康復(fù)理論與實踐，2014，20(3):233-235.

［14］ 曲友直，趙燕玲，秦懷洲，等.川芎嗪對腦缺血再灌注后神經(jīng)細胞凋亡及其相關(guān)蛋白Fas-L表達的影響［J］.中國中醫(yī)急癥，2007，16(5):581-582.

［15］ 吳以嶺，袁國強，賈振華，等.通心絡(luò)對大腦中動脈栓塞模型大鼠腦缺血后腦組織caspase-3、P53和HSP70的影響［J］.中國神經(jīng)免疫學(xué)和神經(jīng)病學(xué)雜志，2007，14 (5):284-288.

2015-11-10)

國家自然科學(xué)基金(81160560)

楊玉梅