劉巖 劉從容

葡萄胎 (hydatidiform mole)是婦科病理中常見的妊娠滋養(yǎng)細胞疾病 (gestational trophoblastic disease)。盡管組織學(xué)對充分發(fā)育的完全性葡萄胎的診斷基本可靠，但早期完全性葡萄胎常常被臨床和病理醫(yī)生誤診為流產(chǎn)性絨毛水腫或正常妊娠。臨床實踐中，部分性葡萄胎的診斷存在更多問題，低診斷和過診斷的現(xiàn)象同時并存［1］。葡萄胎具有發(fā)展為持續(xù)性滋養(yǎng)細胞疾病 (侵襲性葡萄胎和絨癌等)的危險性，且完全性葡萄胎的進展率 (15%～20%)比部分性葡萄胎 (＜4%)更高，因此鑒別葡萄胎和非葡萄胎水腫性流產(chǎn)、進一步區(qū)分完全性和部分性葡萄胎具有重要的臨床意義［2－3］。此外，葡萄胎的過度診斷會給患者帶來不必要的精神和醫(yī)療上的負擔(dān)和后果，導(dǎo)致有迫切生育需求的高齡孕婦不得不面臨隨著年齡的增長而受孕概率降低的局面。眾所周知，形態(tài)學(xué)鑒別早期葡萄胎缺乏準確性，使用更加準確的葡萄胎診斷方法是進行臨床診斷、流行病學(xué)以及生物學(xué)研究的保證。DNA倍體分析和P57免疫組化染色可以提供一定程度的輔助作用［4－5］，但在醫(yī)學(xué)實踐中會遇到不少的困難和陷阱。因此，臨床迫切需要提高葡萄胎診斷手段的敏感性和特異性。葡萄胎的發(fā)病機理有其獨特的遺傳學(xué)背景，遺傳學(xué)分型被認為是最終診斷葡萄胎的“金標準”。近數(shù)年來STR的多態(tài)性分析被證實為最為準確且實用的葡萄胎診斷和分型手段［6－7］。

一、葡萄胎的病因及發(fā)病機制

1．歷史回顧

葡萄胎是最早被人類描述并認知的疾病之一，最初的文字記載可追溯至2500年前，古希臘的希波克拉底將葡萄胎描述為“因飲用不潔水導(dǎo)致的子宮水腫”。約1500年前，來自美索不達米亞的醫(yī)生Aetius of Amida將這種伴有乳房脹痛和閉經(jīng)的疾病命名為“mola hydatidosa”，分別起源于拉丁語“mole”和希臘語“hydatisia”，意為“充滿水的囊泡”，這也成為目前使用的“水泡狀胎塊” (hydatidiform mole)一詞的由來。公元十七世紀，Samuel Degys對荷蘭女伯爵Margaret of Henneberg傳說的思考展示了當時人們對葡萄胎的進一步了解［8］，女伯爵因羞辱了一個懷有雙胞胎的窮苦女乞丐而受到上帝的懲罰，她誣陷這對雙胞胎是女乞丐與兩個不同的男人所生，因此女伯爵在耶穌受難日產(chǎn)下了365個“孩子”(其實為不計其數(shù)的囊狀水泡)之后隨即死去，而她的孩子中一半為男性，一半為女性。以現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的角度可以判斷，這位女伯爵是一位典型的完全性葡萄胎患者，上帝對她的“懲罰”其實是無核卵子與兩個不同的精子受精而導(dǎo)致的滋養(yǎng)細胞疾病。盡管這個傳說源于700多年以前，反映出當時人類對葡萄胎的認識還處于蒙昧階段，但是它的情節(jié)完全契合了目前公認的葡萄胎發(fā)生的遺傳學(xué)機制。

隨著近代醫(yī)學(xué)的發(fā)展和顯微鏡的使用，人們逐漸認識到葡萄胎中所見到的所謂“葡萄”，事實上是因水腫而膨脹的絨毛膜絨毛，葡萄胎的組織學(xué)基礎(chǔ)是合體滋養(yǎng)細胞和細胞滋養(yǎng)細胞的增生。直至上世紀七十年代，細胞遺傳學(xué)首次證實了完全性葡萄胎具有雄源性本質(zhì)［9］，即完全性葡萄胎只含有父源性基因組，而不含有母源性基因。隨后分子遺傳學(xué)徹底揭示了葡萄胎的病因和發(fā)病機制，即親代基因組在胎盤的發(fā)育過程中扮演不同的角色，基因組印跡異常是導(dǎo)致妊娠滋養(yǎng)細胞疾病，尤其是葡萄胎和絨毛膜癌發(fā)生的重要基礎(chǔ)［10－11］。

2．胎盤部位的“父母利益沖突”

親代基因組，即父源性基因組和母源性基因組，在胎兒和胎盤的發(fā)育過程中扮演不同的角色。在進化過程中，父源性基因組力圖操縱母體，使其子代獲得更多的資源和絕對的生長優(yōu)勢，與之相反，母源性基因組則力求對子代的基因資源分配保持平衡，為她所有的孩子提供等量的營養(yǎng)，并且阻止子代中的父源性基因?qū)δ阁w的絕對操控和傷害［12］。研究結(jié)果表明，母源性基因組對于胚胎的發(fā)育是重要的，而父源性基因組對于胚胎外組織，即胎盤的發(fā)育是必需的，只有在父母的基因型以正確形式互相平衡時，才會有胎兒的正常發(fā)育。哺乳動物的發(fā)育需要父母兩方的基因組進行精細協(xié)調(diào)才能達成，走錯一步，一切都前功盡棄。正如一場拔河比賽 (tug-ofwar)，如果一方丟掉繩子，雙方就都會栽倒。這一觀點促進了基因組印跡 (genomic imprinting)理論的創(chuàng)立，該理論解釋了為何某些特定基因會根據(jù)來自于你的父親還是母親而獲得不同的表達。在此理論的助力之下，我們便能看清父母之間那些基因利益的爭斗是怎樣在其后代的基因組中進行到底的?！案改咐鏇_突”假說認為，在胎盤部位，父源性印跡基因組促進滋養(yǎng)細胞的增殖和侵襲，而母源性印跡基因相對抑制滋養(yǎng)細胞的生長［13］。因此若干父源性基因在正常胎盤中受基因印跡而歸于沉默，而母源性等位基因得以表達，兩者形成平衡，既不妨礙胎兒的正常發(fā)育又保證了母體的生命安全。在妊娠期，一個正常的、平衡的基因組印跡過程被破壞，母源性等位基因的缺乏或父源性印跡基因的表達相對過剩，可能引發(fā)異常的滋養(yǎng)細胞增生和侵襲，進而導(dǎo)致葡萄胎等妊娠滋養(yǎng)細胞疾病的發(fā)生

3．葡萄胎的發(fā)病機制和遺傳學(xué)基礎(chǔ)

在遺傳學(xué)水平，葡萄胎妊娠具有異常的父源染色體成分，存在過剩的父源性基因組是完全性和部分性葡萄胎發(fā)病機制的關(guān)鍵遺傳因素。

與正常的單卵、單精子二倍體 (46，XX或XY)妊娠不同，幾乎所有的完全性葡萄胎(complete hydatidiform mole)是僅含父源染色體的雙精子二倍體［1，14］:它們多數(shù)是一個空卵與一個精子受精后再復(fù)制的46，XX二倍體核型 (單精純合子，占80%)，或者是一個空卵與一個減數(shù)分裂失敗的精子或兩個不同的精子同時受精的46，XX或46，XY二倍體核型 (雙精雜合子，占20%)。值得注意的是，雙精雜合子比雙精純合子的完全性葡萄胎更容易發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，進展為持續(xù)性滋養(yǎng)細胞疾病。卵子丟失母源性單倍體基因組的原因尚未完全清晰，可能因為卵子不成熟或老化而不能保有自身的核物質(zhì)，或者在受精過程中母源性核被當做極體而排出細胞外，這種假設(shè)與葡萄胎的年齡危險因素(＜20歲或＞40歲)不謀而合。還有一類極為特殊的雙親源性完全性葡萄胎，具有正常比例的雙親基因組，但由于基因印跡調(diào)控相關(guān)的特定基因 (NALP7或KHDC3L基因)發(fā)生了遺傳性突變，導(dǎo)致母源性基因被異常滅活而發(fā)生完全性葡萄胎。在這種家系中，超過一個以上的女性 (母女或姐妹)在多次妊娠中反復(fù)發(fā)生完全性葡萄胎，目前見于文獻報道的僅有 30 余個家系［15］。

部分性葡萄胎 (partial hydatidiform mole)的遺傳學(xué)本質(zhì)是具有雙雄單雌性基因組的三倍體，它們來自一個具有單倍體核的卵子同時與兩個精子受精(雙精雜合子，占90%)，或是由一個具有單倍體核的卵子與一個精子受精，隨后由于減數(shù)分裂失敗而發(fā)生父源性染色體倍增 (單精純合子，占10%)，由此產(chǎn)生二倍父源和單倍母源 (69，XXX或69，XXY核型)的三倍體妊娠［1，14］。值得注意的是，并非所有的三倍體妊娠都表現(xiàn)為部分性葡萄胎。三倍體核型是最常見的人類染色體異常，三分之二為雙倍的父源性雄性基因組并且與部分性葡萄胎表型相關(guān)，其余則是由于減數(shù)分裂過程中母體染色體未分離而形成的雙雌單雄性基因組，并非葡萄胎妊娠，這種非葡萄胎型三倍體，額外擁有一組來自于母體的染色體基因組，因此并不會表現(xiàn)出雙雄單雌性部分性葡萄胎的生物學(xué)和臨床特征。有趣的是，在那些能夠形成完整胎兒并出現(xiàn)胎死宮內(nèi)的病例中，雙雌性三倍體的比例更高。但由于妊娠早期流產(chǎn)的絨毛發(fā)育尚不充分，組織學(xué)形態(tài)特征不明顯，只依據(jù)常規(guī)的病理檢查而不使用其他輔助檢測方法，大量病例可能會被漏診。因此，明確一個三倍體妊娠中父源性染色體的倍數(shù)對診斷部分性葡萄胎十分重要。

二、葡萄胎診斷中輔助技術(shù)的應(yīng)用

為了提高葡萄胎診斷的準確性，人們探索了多種針對葡萄胎遺傳學(xué)變化的分子檢測手段。其中包括傳統(tǒng)的流式DNA倍體分析、常用的P57免疫組化染色和新興的基因多態(tài)性分析 (STR基因分型)。

1．流式DNA倍體分析

流式DNA倍體分析曾經(jīng)是葡萄胎診斷的主要輔助技術(shù)。通過顯示三倍體的核型，流式倍體分析常用于從完全性葡萄胎和非葡萄胎性水腫性流產(chǎn)中鑒別部分性葡萄胎［16］。但此方法不能明確妊娠絨毛組織中染色體的親本來源，因此無法區(qū)分均為二倍體核型的完全性葡萄胎和非葡萄胎性水腫性流產(chǎn)，也無法區(qū)分均為三倍體的部分性葡萄胎和雙雌單雄性非葡萄胎三倍體流產(chǎn)。如前所述，雙雄單雌的部分性葡萄胎僅占所有三倍體流產(chǎn)的三分之二，因此流式分析檢測出的三倍體核型只能協(xié)助、但不能確診部分性葡萄胎，更不可能分辨出究竟是單精純合型還是雙精雜合型部分性葡萄胎［17］。此外，倍體分析組織標本常遇到技術(shù)困難和解讀錯誤。尤其是石蠟包埋組織容易出現(xiàn)細胞碎片和倍體直方圖峰值增寬，并伴有系數(shù)波動等技術(shù)上的人工假象，不同的固定劑和固定條件也對DNA倍體分析具有明顯影響，這些都會造成結(jié)果偏差而導(dǎo)致葡萄胎的誤診［18］。

2．P57免疫組化染色

P57是細胞周期素依賴性激酶抑制蛋白，負性調(diào)節(jié)細胞周期和抑制增殖。在胎盤部位，父源性P57屬于印跡基因而不能表達，僅有母源性P57等位基因得以表達，因此細胞核表達P57蛋白可作為胎盤部位有無母源性基因的標志物［19］。作為胎盤絨毛生長的源動力，細胞滋養(yǎng)細胞和絨毛間質(zhì)細胞常常是父源性基因印跡的代表，也是評判P57陽性與否的評判對象。母體蛻膜細胞持續(xù)性表達母源性基因，可作為P57染色的陽性內(nèi)對照。絨毛表面的合體滋養(yǎng)細胞屬于終末分化細胞，不再具有增殖和分裂能力，因此不表達P57等細胞周期相關(guān)蛋白，可作為P57染色的陰性內(nèi)對照。對于完全性葡萄胎，細胞滋養(yǎng)細胞和絨毛間質(zhì)細胞不表達P57，有助于將完全性葡萄胎與表達P57的正常妊娠胎盤、水腫性流產(chǎn)和部分性葡萄胎中區(qū)分出來。

盡管P57免疫組化染色已在絕大多數(shù)病理科得到了廣泛應(yīng)用，但其對于葡萄胎的診斷仍然具有不可避免的局限性［5］。首先，P57染色無法鑒別部分性葡萄胎和包含有母源性基因的其他水腫性妊娠(如水腫性流產(chǎn)、三體病、雙雌三倍體以及胎盤間質(zhì)細胞發(fā)育不良)。其次，即使P57可以用于診斷完全性葡萄胎，但是無法鑒別雙精雜合型和單精純合型完全性葡萄胎，而此兩者的生物學(xué)行為截然不同，雙精雜合型完全性葡萄胎進展為持續(xù)性滋養(yǎng)細胞疾病的危險度更高。再次，不完全印跡、人工輔助生殖后的雙胎妊娠、罕見的基因嵌合體以及病理醫(yī)生判讀中的主觀性偏差都有可能導(dǎo)致P57判讀的不確定性而對葡萄胎的診斷造成誤差［20］。

3．STR基因分型

STR是人類基因組中長度僅有2～7個核苷酸的DNA重復(fù)序列，在基因組非編碼區(qū)非常豐富并具有高度的遺傳穩(wěn)定性［6］。STR多態(tài)性是指個體之間在相應(yīng)位置的STR位點內(nèi)重復(fù)片段數(shù)目有所不同。通過分析多個特異位點STR的數(shù)目，可以確認個體的遺傳特點而達到個體識別和鑒定的目的。STR多態(tài)性分析已經(jīng)是法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域進行個體鑒定最精準的方法?；谕瑯拥脑恚治鋈焉锝M織和相應(yīng)母體組織的STR多態(tài)性，可獲得葡萄胎中雙親的遺傳成份而有助于明確葡萄胎診斷及分型。使用商品化的STR遺傳學(xué)分析試劑盒，如 AmpFlSTR Identifiler PCR Amplification和Promega Powerplex 16HS，能夠在一個多重PCR擴增反應(yīng)中同時擴增15個STR位點及一個性別識別位點，成為一個極其強大的基因組STR多態(tài)性分析平臺［21］。同時，STR分析所需的DNA模板量極其微小 (少到1.5～2.5ng，相當于150～250個人體細胞)，其擴增片段較短，僅為100～350個堿基對，非常適合分析從福爾馬林固定、石蠟包埋組織中提取的DNA樣本，其準確性已經(jīng)分別在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的身份鑒定和臨床移植鑲嵌體的檢測中得到了很好的驗證。

葡萄胎的遺傳學(xué)背景是其異常的父源性染色體成分。盡管已知很久，直到最近這樣的“金標準”才能夠用于葡萄胎的常規(guī)診斷。因為STR基因分型可以測定同一物種不同成員之間的遺傳學(xué)差異，所以可鑒定葡萄胎中每一個單倍體基因組是來自于父親還是來自于母親。因此，隨著商品化STR遺傳學(xué)分析檢測試劑盒的出現(xiàn)和多重STR分析方法性價比的提高，STR基因分型已被公認為是一種準確的和高性價比的葡萄胎診斷和分類的檢測方法。

葡萄胎妊娠的STR基因分型需要對絨毛和母體組織 (如子宮內(nèi)膜)的STR圖譜進行對比［22］。鑒別每個STR基因座中有無父源性等位基因以及它的拷貝數(shù)是得到準確分析結(jié)果的關(guān)鍵，即通過比較每一個STR位點的等位基因，識別出絨毛組織中異常的父源等位基因。如果絨毛組織的STR圖譜至少在兩個位點全部為父源性等位基因，即為完全性葡萄胎。如果在每個STR位點均出現(xiàn)兩個父源性和一個母源性等位基因，即為部分性葡萄胎［23］。具有來自于雙親的平衡性雙等位基因表型 (即“一父一母”)屬于非葡萄胎妊娠 (二倍體水腫性流產(chǎn))。而在平衡性雙等位基因表型基礎(chǔ)上，如在某一個STR位點出現(xiàn)了額外的母源性等位基因，則符合三體病的診斷。

極其少見的雙親源性 (單精單卵)完全性葡萄胎是葡萄胎STR基因檢測面臨的一個潛在陷阱。盡管有母源性染色體的存在，異常的基因印跡使其組織學(xué)表現(xiàn)與完全性葡萄胎非常近似。但由于此種葡萄胎同時具有父源和母源性染色體，STR基因分型顯示為平衡性雙等位基因表型。此時，P57免疫組化檢測常常提示母源性基因的異常印跡 (即細胞滋養(yǎng)細胞和絨毛間質(zhì)細胞無P57的核表達)，結(jié)合患者病史、臨床表現(xiàn)和進一步的遺傳性突變檢測有助于此類罕見遺傳性疾病的確診［5］。發(fā)生于雙胎妊娠的葡萄胎、基因嵌合體等可能使STR的分析變得復(fù)雜，產(chǎn)生難以解讀的結(jié)果，此時STR基因分型僅可排除葡萄胎，但無法進一步解讀上述復(fù)雜的遺傳學(xué)改變［6］。

完整的葡萄胎STR基因型分析流程包括靶組織的選擇與分離、DNA提取、STR位點多重PCR、毛細管電泳片段分析以及數(shù)據(jù)解析與判讀。由于絨毛和母體組織的STR多態(tài)對比分析是診斷葡萄胎的關(guān)鍵，組織分離和純化就顯得非常重要，尤其是部分性葡萄胎的診斷。在大多數(shù)流產(chǎn)刮宮樣本中，絨毛和蛻膜組織的界限比較清楚，可輕易辨識而分別裝入試管進入提取過程。但一些標本中母體血液、子宮內(nèi)膜組織或細胞可能會與絨毛組織密切混合，所以評估組織交叉污染的程度是STR基因多態(tài)性分析的前提。對于希望用于STR分析的絨毛樣本，建議使用生理鹽水漂浮的方法做好絨毛和蛻膜的前期分離，病理取材醫(yī)生將兩種組織分別包埋制片，最后由診斷醫(yī)生進行顯微鏡下進行確認和精確分離。如前期處理不當或使用存檔蠟塊，導(dǎo)致不能獲得純凈的蛻膜組織，建議使用母體外周血中的白細胞作為母體基因組的來源，用于判斷絨毛組織中是否存在過量的父源性基因。

三、展望

隨著血清hCG監(jiān)測和早期超聲檢查的飛速發(fā)展，盡管大多數(shù)葡萄胎往往在妊娠的極早期階段即被終止，但是繼葡萄胎之后發(fā)生妊娠滋養(yǎng)細胞腫瘤的危險性并未發(fā)生改變，而且不同基因型的葡萄胎繼發(fā)持續(xù)性滋養(yǎng)細胞疾病的危險度也有所不同。因此，葡萄胎的精準診斷和分型對于患者的臨床處置和預(yù)后具有重要意義。目前，單純形態(tài)學(xué)診斷的準確性明顯不足，病理學(xué)家，甚至是婦產(chǎn)科病理學(xué)專家在診斷葡萄胎存在著相當?shù)牟灰恢滦?。如果病理醫(yī)生對水腫性絨毛組織有診斷疑問，則應(yīng)該進行包括STR基因分型和/或免疫組化在內(nèi)的輔助診斷以排除葡萄胎妊娠。STR基因分型為葡萄胎的準確診斷和遺傳學(xué)分型提供了一種極其有效的分子手段，該方法比傳統(tǒng)的流式倍體分析和免疫組化染色具有更大的優(yōu)越性。隨著大多數(shù)醫(yī)院病理科分子診斷能力的逐步提高，STR基因分型將成為葡萄胎常規(guī)診斷中必不可缺少的一項應(yīng)用技術(shù)。

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