劉翠嫻 熊符

一、引言

出生缺陷可造成胎兒、嬰兒的死亡，人類壽命的縮短，并可導致許多兒童患病和殘疾，因此成為當今各國重視的衛(wèi)生問題。相當一部分出生缺陷是基因及染色體變異導致，而基因組拷貝數(shù)變異就是其中之一［1－2］?；蚪M拷貝數(shù)變異 (copy number variations，CNVs)即染色體片段的重復或缺失，指與已報道的正?；蚪M相比，拷貝數(shù)存在差異且增加或減少的堿基數(shù)目＞1kb，這是一種十分普遍的染色體變異，并且很多染色體數(shù)目的變異都與疾病直接相關［3］。為減少及預防缺陷嬰兒的出生，精準的產(chǎn)前診斷技術及專業(yè)的遺傳咨詢必不可少。目前，主要的產(chǎn)前診斷技術包括核型分析、染色體微陣列分析、熒光原位雜交技術 (fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)、多重連接探針擴增技術、熒光定量PCR、聚合酶鏈式反應及Sanger測序、高通量測序等。其中，染色體微陣列分析是2001年人類基因組計劃完成后衍生的一種新的分子水平染色體分析技術，在進行全基因組掃描時，其高分辨率能夠檢出＜50kb的基因拷貝數(shù)變異。CMA技術主要結合了傳統(tǒng)的比較基因組雜交與基因探針兩種方法，其基本原理是將待測基因組DNA用特定的熒光或生物素進行標記，然后結合到已包埋在固相載體上的探針陣列中，再通過檢測待測基因與探針的雜交信號以實現(xiàn)對海量的基因信息的定量分析，該技術以PCR和分子雜交為基礎，實現(xiàn)對靶基因的快速、有效地檢測，這樣不僅顯著提高了檢測結果的準確度，還大大提高了檢測效率［4］。目前，CMA根據(jù)芯片所使用探針類型的不同分為兩大類，分別是微陣列比較基因組雜交 (array-based comparative genomic hybridization，aCGH)及單核苷酸多態(tài)性微陣列(single nucleotide ploymophism array，SNP array)技術［5－7］。前者探針來源于基因組寡核苷酸序列，其優(yōu)勢在于檢測拷貝數(shù)變異方面，該技術的探針能覆蓋全基因組位點，分辨率可精確到50 bp或以下;而后者是根據(jù)人類基因組單核苷酸多態(tài)性位點設計探針位點，優(yōu)勢在于除了能夠檢出CNV以外，還能夠檢測出大多數(shù)的單親二倍體以及檢測到低水平的嵌合體［8－10］及單基因疾病等，有利于大量樣本關聯(lián)連鎖研究，但不能識別基因組拷貝數(shù)變異［11］。

二、CMA技術的優(yōu)勢

在產(chǎn)前診斷的過程中，對于常規(guī)產(chǎn)前檢查、唐氏篩查、超聲檢查等發(fā)現(xiàn)的可疑征象，往往需要進行細胞和分子層面的更為準確精細的檢測。臨床上常用的手段有細胞培養(yǎng)染色體核型分析、FISH、比較基因組雜交 (comparative genomic hybridization，CGH)等。通過G顯帶染色體核型分析技術可以檢出的基因組拷貝數(shù)變化主要表現(xiàn)形式為較大片段的染色體結構變異如缺失或重復或易位或倒位，對片段較小的拷貝數(shù)變異則存在漏檢。針對染色體的拷貝數(shù)變異，近年來多項研究表明CMA技術能對其進行精準檢測。CMA技術分辨率高，可檢測出低于50kb的微缺失及微重復，且有效地克服或彌補了現(xiàn)有的染色體檢測技術的局限性，將染色體的診斷提高到了亞顯微甚至是基因的水平上，極大地提高了染色體異常的檢出率，而且其具有特異性高、靈敏度強、操作簡單快速等優(yōu)勢，已被廣泛應用于微生物、腫瘤、遺傳性疾病及產(chǎn)前診斷等多個領域［12－13］。

CMA作為一種新的檢測技術，相對于傳統(tǒng)的檢測方法有不可比擬的優(yōu)點［14］。傳統(tǒng)的G顯帶染色體核型分析是產(chǎn)前細胞遺傳診斷的“金標準”，其優(yōu)點是可以檢測到染色體的平衡異位，該技術需要培養(yǎng)足夠量的細胞才能進行人工鏡檢，而且只能分辨大于10Mb的染色體變異，存在較高的人為偏差。而FISH作為針對核型分析缺陷而發(fā)展的一項更為精細的技術，具有比核型分析更高的分辨率并且可以檢測到平衡及不平衡易位以及融合基因，但其一次只能檢測一到數(shù)個異常染色體片段，而且不能檢測雜合子缺失 (loss of heterozygosity，LOH)/單親二倍體 (uniparental disomy，UPD)。而且，F(xiàn)ISH的檢測依賴探針，目前所制備的探針類型及數(shù)目比較單一，不能作為全基因篩查的一種方法。相較于G顯帶及FISH檢測方法，CMA分辨率高，能夠全基因組范圍內(nèi)檢測到細微的缺失及重復;同時，SNP array利用高密度的單核苷酸芯片檢測基因組基因的多態(tài)性，可以進行 LOH、UPD 以及多倍體的檢測等［15－17］。而且，CMA的檢測無需進行羊水細胞培養(yǎng)，整個實驗周期只需兩天，可縮短患者的心理焦慮時間，而且實驗的流程經(jīng)標準化處理，其結果運用軟件分析，代替了以往的主觀判斷，降低了人為偏差［18－19］。但是，CMA也存在一定的缺點，例如不能檢測平衡異位、倒位。更為重要的是，CMA目前最大問題是對結果的正確解讀，其原因在于該技術能找出約1%的不確定性的拷貝數(shù)變異，這會給遺傳咨詢帶來一定的困擾［20－21］。即使CMA存在上述一些缺點，但其對拷貝數(shù)變異檢測具有顯著優(yōu)勢，其臨床應用價值不可低估。

隨著科學的進步，產(chǎn)前篩查技術也是日新月異。近幾年發(fā)展比較快的無創(chuàng)產(chǎn)前診斷即孕婦外周血高通量測序就是其中之一，其特點是對胎兒沒有創(chuàng)傷，并且敏感性及特異性高，適合胎兒染色體非整倍體篩查［22－23］。高通量測序即深度測序，是在人類基因組測序順利完成的基礎上發(fā)展起來的第二代測序技術，該技術能較好地檢測到13、18、21號染色體的整體變化情況，但對于更細微的基因組拷貝數(shù)變異，則需要提高測序的深度才能檢測成功，該技術對生物信息分析要求比較高，要處理大量的測序數(shù)據(jù)。而且，無創(chuàng)產(chǎn)前高通量測序在染色體非整倍體檢測中會出現(xiàn)假陽性及假陰性結果，可能原因包括母體細胞嵌合、母體的癌細胞、消失的雙胎以及母體的拷貝數(shù)變異、游離在母體外周血的胎兒遺傳片段少等。所以，無創(chuàng)產(chǎn)前高通量測序結果陽性的孕婦都需要進一步做有創(chuàng)的CMA或核型檢測，結合CMA或核型結果對孕婦胎兒情況進行判斷。同時，CMA技術在嵌合體檢測方面亦優(yōu)于高通量測序技術，其能根據(jù)樣本DNA與探針雜交信號的比對，甚至可以精確地檢測到嵌合比例。并且，高通量測序也存在不能檢測染色體平衡異位、費用高、檢測出的數(shù)據(jù)量大，難以分析等特點［24］。更重要的是，無創(chuàng)高通量測序的假陽性結果風險將會在極大程度上導致孕婦做出終止妊娠的錯誤決定。所以，無創(chuàng)產(chǎn)前高通量技術亦離不開CMA技術，前者做篩查，后者做驗證，才能得出一個準確的產(chǎn)前診斷結果。

三、CMA技術在產(chǎn)前診斷的臨床應用

CMA作為一線技術早已應用于臨床，2010年國際細胞遺傳學協(xié)會認定CMA為發(fā)育障礙或先天畸形患者的染色體突變檢測的首選臨床診斷檢測技術［25］。此外，2009年美國醫(yī)學遺傳學學會亦推薦aCGH作為一線技術應用于智力障礙、自閉癥和先天性異?；颊叩娜旧w檢測［26］。美國婦產(chǎn)科學大會則認為對全部妊娠婦女提供有創(chuàng)取樣微芯片檢測是合適的，推薦無論風險如何，所有的孕婦都應有機會選擇有創(chuàng)的產(chǎn)前診斷芯片技術檢測技術［27］。2009年美國婦產(chǎn)科學醫(yī)師協(xié)會提出建議對于超聲檢查證實胎兒攜帶一個或者多個結構異常并正在接受侵入性產(chǎn)前診斷的患者，建議進行CMA代替?zhèn)鹘y(tǒng)的胎兒核型分析檢測，而且若胎兒出現(xiàn)宮內(nèi)死亡或死產(chǎn)的情況，需要進一步進行細胞遺傳學分析時，建議對胎兒組織 (即羊水，胎盤或妊娠物)進行染色體微陣列分析，因為該技術可以增加獲得結果的可能性，提高致病畸形的檢測率［28］。此外，2010年加拿大醫(yī)學遺傳學學會同樣推薦CMA作為研究發(fā)育遲緩/精神發(fā)育遲滯、自閉癥、多種先天性異常或畸形等患者的第一線實驗室檢測技術;當超聲或胎兒磁共振成像技術檢測胎兒存在結構異常，或當進行非整倍體快速掃描的結果是陰性時，建議aCGH可以代替染色體核型分析，作為一個適當?shù)脑\斷檢查［29］。鑒于CMA技術在醫(yī)療領域得到的高度評價，接下來簡要地介紹CMA技術在產(chǎn)前診斷中的臨床應用。

1．多發(fā)性自然流產(chǎn)的原因排查:2012年，Wapner等［27］人曾對3 822例核型正常的樣本進行檢測，發(fā)現(xiàn)96例 (2.5%)存在或可能存在致病的染色體拷貝數(shù)變化。而有研究顯示，核型分析正常的群體中依然能檢測出6%的染色體異常，而這部分人發(fā)生流產(chǎn)的風險更高。而5%的流產(chǎn)原因已經(jīng)明確是由于染色體的微缺失、微重復導致，而這種畸變無法被傳統(tǒng)檢測方法所識別。2013年有研究對一例多發(fā)性流產(chǎn)患者進行染色體核型分析，利用SNP array確定了該患者外周血所有有核細胞的染色體核型均為47，XX，+8，找到造成患者習慣性流產(chǎn)的原因［30］。

2．產(chǎn)前胎兒染色體檢測:由于染色體變異能導致多種遺傳性疾病的發(fā)生，所以，應用CMA技術進行胎兒產(chǎn)前診斷尤為必要。該技術的產(chǎn)前診斷適應證包括:分娩時年齡達到或超過35歲的孕婦;孕期超聲檢查發(fā)現(xiàn)胎兒結構異?；蜍浌侵笜岁栃缘脑袐D;曾生育過染色體異常患兒的孕婦;夫婦之一是染色體平衡異位、羅氏異位、倒位攜帶者的夫婦;可能攜帶某種X連鎖遺傳病基因的孕婦;曾有不明原因的自然流產(chǎn)史、不明原因胎兒停止發(fā)育、死產(chǎn)的孕婦;或新生兒死亡的孕婦等;妊娠期接觸了致癌物質(zhì)的孕婦;宮內(nèi)發(fā)育遲緩的胎兒及其父母。其中，對超聲結果顯示結構異常而傳統(tǒng)核型分析結果正常的胎兒，進行CMA技術檢測尤為必要。利用CMA技術進行以上適應證的產(chǎn)前診斷，可以為患者提供有效的遺傳咨詢所需要的信息，更好地控制出生人口的身體素質(zhì)。

3．胚胎植入前遺傳學診斷:2006年，Le Caignec等［31］證實了aCGH應用于染色體平衡易位攜帶者進行第三代試管嬰兒即植入前遺傳學診斷 (preimplantation genetic diagnosis，PGD) 的 可 行 性。Fiorentino等［32－33］也進一步地利用aCGH技術檢測了18種不同易位產(chǎn)生的68類非平衡，并檢測到了最小為2.5 Mb的非平衡片段及可以檢測出低至10%水平的嵌合體。上述研究結果表明，aCGH技術應用于胚胎植入前染色體易位遺傳學診斷具有令人滿意的效果。aCGH用于IVF可以獲得較高的臨床妊娠率［34］，且可以應用于復雜易位和全基因組異倍體篩查［35］。隨著科技的發(fā)展，aCGH有望成為輔助生殖領域中經(jīng)濟而可靠的胚胎全基因組診斷技術。

4．“二孩”的孕前遺傳咨詢及產(chǎn)前診斷:“二孩”政策開放使許多家庭再生育的愿望得以實現(xiàn)，但已生育過一個表型異?；蛘J知障礙孩子的家庭對此望而卻步。而染色體微陣列分析能幫這些患者家庭找出病因，是產(chǎn)后及新生兒表型異常以及認知功能障礙等的一個主要的遺傳評估手段。已有許多研究表明CMA技術能對不明原因的智力障礙、多發(fā)先天畸形及自閉癥等進行分子診斷［36－38］。大約有12%～19%的此類患者能被CMA檢測出攜帶染色體異常，而傳統(tǒng)的G顯帶核型分析的檢出率只有2%～3%，脆性X試驗的檢出率則是0.46%［39］。由此，美國兒科學會推薦CMA成為這些疾病的分子檢測技術的第一道防線［6］。所以，可以通過CMA找出導致患者表型或認知異常的分子機制，然后給患者家庭提供相應的遺傳咨詢及下一胎的產(chǎn)前診斷，減少患兒出生的可能性。國內(nèi)外的研究表明，應用CMA技術進行產(chǎn)前、產(chǎn)后遺傳病診斷是提高染色體患兒檢出率、查明病因并指導家庭二次生育的有效措施。

綜上所述，CMA是當前針對基因拷貝數(shù)變異及致病基因多態(tài)性的最好的一種高通量掃描及基因分型技術，可以用于多種疾病的產(chǎn)前診斷，提高出生人口的身體素質(zhì)。隨著基因致病數(shù)據(jù)庫的完善及芯片技術的改進，CMA這項技術還將繼續(xù)迅速發(fā)展，并在醫(yī)學領域發(fā)揮更多重要的作用。

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