馬羽萍 張殿增 郭雅玲 王裕云 吳 超 西安市第八人民醫(yī)院(西安710061 )

?

芪歸四逆散抗大鼠肝纖維化的作用機(jī)制研究*

馬羽萍 張殿增△郭雅玲 王裕云 吳 超 西安市第八人民醫(yī)院(西安710061 )

目的：用肝纖維化大鼠觀察芪歸四逆散對(duì)實(shí)驗(yàn)性肝纖維化的影響。方法：用四氯化碳(CCl4)復(fù)制肝纖維化大鼠模型，設(shè)秋水仙堿為陽(yáng)性對(duì)照，觀察芪歸四逆散對(duì)肝纖維大鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST) 和白蛋白(ALB)水平以及透明質(zhì)酸(HA)、層粘連蛋白(LN)、Ⅲ型前膠原(PCⅢ)、IV型膠原(C-IV)含量及肝臟組織病理學(xué)和超微結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果：與模型對(duì)照組比較，芪歸四逆散組大鼠血清的AST、ALT 以及HA、LN、PCⅢ、C-IV水平明顯降低，但ALB明顯升高。肝臟的組織病理?yè)p害明顯改善，膠原沉積減少，纖維增生顯著減輕。超微結(jié)構(gòu)研究顯示，芪歸四逆散組動(dòng)物的肝竇纖維蛋白沉積明顯減少。結(jié)論：芪歸四逆散可以恢復(fù)肝功能，抑制星狀細(xì)胞的活性，減少肝內(nèi)纖維蛋白的合成與沉積，促進(jìn)膠原降解，改善纖維化肝臟的病理學(xué)超微結(jié)構(gòu)，具有確切的抗大鼠肝纖維化作用。

四逆散為漢·張仲景《傷寒論》中的和解劑，具有調(diào)和肝脾、透邪解郁、疏肝理脾之功效。主治陽(yáng)郁厥逆證。近年來(lái)，在臨床上用加味四逆散治療慢性乙型肝炎性肝纖維化，并獲得了明顯的療效[1]。既往實(shí)驗(yàn)研究也對(duì)加味四逆散拮抗、預(yù)防和逆轉(zhuǎn)肝纖維化的作用進(jìn)行了肯定[2-3]。我們?cè)谂R床上用芪歸四逆散治療肝纖維化，并獲得了顯著的臨床療效。本研究主要觀察了芪歸四逆散對(duì)CCL4大鼠肝纖維化的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料 1.1 動(dòng)物及飼料 清潔級(jí)(SPF)SD大鼠45 只，雄性，體重200± 20g。動(dòng)物使用許可證號(hào)：SCXK(陜)2012-003，由西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 藥物及試劑 芪歸四逆散劑由柴胡、枳殼、白芍、黃芪、當(dāng)歸、紅花、桃仁、川芎、甘草等藥組成。實(shí)驗(yàn)用其濃縮液(含生藥2g/ml)。秋水仙堿，廣東彼迪藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，批號(hào)：20150001。四氯化碳(CCl4)，天津市天力化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品，批號(hào)：20111006。橄欖油，山東魯花集團(tuán)有限公司產(chǎn)品，批號(hào)：20150803LB。大鼠透明質(zhì)酸(HA)、層粘連蛋白(LN)、Ⅲ型前膠原(PCⅢ)、IV型膠原(Collagen IV)Elisa試劑盒均為上海廣銳生物科技有限公司產(chǎn)品，批號(hào)2015012。大鼠肝臟TGF-β1的一抗和二抗為Pioneer Biotechnology，Inc產(chǎn)品。血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)和白蛋白(ALB)試劑為全自動(dòng)生化分析儀專用試劑。

1.3 主要儀器 超薄切片機(jī)、H7650型透射電子顯微鏡(日本日立公司)，圖像采集與分析系統(tǒng)(德國(guó)萊卡公司)，AU5431型全自動(dòng)生化分析儀(美國(guó)貝克曼公司)，POLARstar OPTIMA微板儀(德國(guó)BMG Labtechnologies Pty. Ltd)。

2 實(shí)驗(yàn)方法 2.1 動(dòng)物分組與造模 在適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，對(duì)所有動(dòng)物進(jìn)行編號(hào)并隨機(jī)分為4組：正常對(duì)照組10只，模型對(duì)照組15 只，秋水仙堿組 10只，中藥治療組 10只。除正常組外，其余各組動(dòng)物在第一天皮下注射CCl4原液3 ml/kg，隨后每隔三天皮下注射40% CCl4橄欖油溶液3ml/kg，1次，連續(xù)6周。在末次注射后次日，從模型對(duì)照隨機(jī)殺死一只大鼠行肝臟病理學(xué)檢查，按照2000年中華醫(yī)學(xué)會(huì)傳染病與寄生蟲(chóng)病學(xué)分會(huì)肝病學(xué)分會(huì)聯(lián)合修訂的肝纖維化分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行評(píng)定[4]，直到形成II級(jí)以上肝纖維化，即確定肝纖化模型復(fù)制成功。

2.2 給藥方法 實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)，正常對(duì)照組和模型對(duì)照組大鼠灌胃給予生理鹽水，每次2 ml，1次/d；給藥組灌胃給予芪歸四逆散溶液7.8ml/kg(15.6g/kg)，1次/d，陽(yáng)性組灌胃給予秋水仙堿溶液0.01 mg/kg，1次/d，連續(xù)6周。

2.3 標(biāo)本采集 于造模和給藥結(jié)束后，動(dòng)物用25%烏來(lái)糖(20ml/kg)麻醉，經(jīng)腹主動(dòng)脈采血，分離血清，用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清ALT、AST水平和ALB含量，用Elisa法測(cè)定血清HA、LN、PC-Ⅲ、C-IV水平。同時(shí)剪取近肝門(mén)處的新鮮肝組織兩份。一份切成1mm3的小塊，用2.5%戊二醛(pH 7.3-7.4)固定，供電子顯微鏡檢測(cè)用，另一份用10%甲醛固定，用于病理學(xué)和免疫組化檢測(cè)。

3 結(jié) 果 3.1 對(duì)血清轉(zhuǎn)氨酶與白蛋白水平的影響 于實(shí)驗(yàn)?zāi)?，?dòng)物用25%烏來(lái)糖(20ml/kg)麻醉，經(jīng)腹主動(dòng)脈采血，分離血清，用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清ALT、AST水平和ALB含量，結(jié)果如表1所示。

表1 芪歸四逆散對(duì)肝纖維化大鼠血清轉(zhuǎn)氨酶、白蛋白的影響

表1中的結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組動(dòng)物的ALT和AST水平均明顯提高(P<0.01)，ALB則明顯降低(P<0.01)。與模型對(duì)照組比較，芪歸四逆散給藥組和秋水仙堿陽(yáng)性對(duì)照組的ALT、AST水平均明顯降低(P<0.01)，而ALB明顯提高(P<0.05)。

3.2 血清纖維化指標(biāo)的影響 用Elisa法測(cè)定血清HA、LN、PC-Ⅲ、C-IV水平，結(jié)果如表2所示。

表2 芪歸四逆散對(duì)肝纖維化大鼠血清HA、LN、C-IV和PCⅢ水平的影響

表2中的結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組動(dòng)物的血清HA、LN、C-IV和PcⅢ水平均明顯提高(P<0.01)。與模型對(duì)照組比較，芪歸四逆散給藥組和秋水仙堿陽(yáng)性對(duì)照組的血清HA、LN、C-IV和PcⅢ水平均明顯降低(P<0.01)。

3.3 肝臟病理學(xué)的影響 于實(shí)驗(yàn)?zāi)?，剪取肝臟組織，10%多聚甲醛固定，經(jīng)脫水、石蠟包埋、切片后，分別用HE和Masson染色，在光鏡下觀察肝臟的組織病理學(xué)。

在光鏡下發(fā)現(xiàn)，正常對(duì)照組動(dòng)物HE染色時(shí)的肝組織結(jié)構(gòu)清晰，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝索排列整齊；Masson染色僅見(jiàn)中央靜脈和匯管區(qū)有少量藍(lán)染。HE染色發(fā)現(xiàn)，模型組肝板結(jié)構(gòu)紊亂，有假小葉形成，肝細(xì)胞水腫，匯管區(qū)和小葉內(nèi)可見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)，并見(jiàn)橋接樣壞死；Masson染色見(jiàn)纖維間隔形成，匯管區(qū)明顯擴(kuò)大，界板破壞，中央靜脈及竇周大量膠原沉積。芪歸四逆散給藥組和秋水仙堿陽(yáng)性對(duì)照組的肝組織病變程度明顯比模型對(duì)照組輕，Masson染色見(jiàn)結(jié)締組織增生程度明顯減輕，有些形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)斷裂或消失。這些結(jié)果說(shuō)明芪歸四逆散有抗肝纖維化的作用。

3.4 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)β1表達(dá)水平的影響 免疫組化的陽(yáng)性結(jié)果是細(xì)胞的漿膜出現(xiàn)棕黃色顆粒。檢測(cè)時(shí)每個(gè)圖片取5個(gè)視野，計(jì)算出陽(yáng)性染色面積占總面積的百分比，結(jié)果如表3所示。

在光鏡下可見(jiàn)，正常對(duì)照組的TGFβ1的表達(dá)很少，且呈散在性分布，主要見(jiàn)于匯管區(qū)、門(mén)靜脈以及中央靜脈周圍的結(jié)締組織。與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組的TGFβ1分布明顯增多，而且廣泛(P<0.01)，除了匯管區(qū)、門(mén)靜脈和中央靜脈外，在纖維間隔以及一些不規(guī)則細(xì)胞也有分布。而給藥組和秋水仙堿組TGFβ1的表達(dá)明顯低于模型對(duì)照組(P<0.01)，結(jié)果與病理學(xué)檢查結(jié)果一致。說(shuō)明芪歸四逆散可以減少肝纖維化大鼠肝組織TGFβ1的表達(dá)。

表3 芪歸四逆散對(duì)肝纖維化大鼠TGFβ1表達(dá)的影響

3.5 對(duì)超微結(jié)構(gòu)的影響 在透射電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，正常組大鼠的肝細(xì)胞呈多邊形，核圓，位于細(xì)胞中間，血竇面微絨毛密集而豐富；肝竇內(nèi)皮細(xì)胞(SEC)呈扁平狀，遠(yuǎn)側(cè)胞質(zhì)不連續(xù)，細(xì)胞間有許多窗孔；庫(kù)佛細(xì)胞(KC)和肝星狀細(xì)胞(HSC)形狀不規(guī)則，Diss間隙正常，肝臟內(nèi)毛細(xì)血管通暢。模型對(duì)照組動(dòng)物的肝細(xì)胞有壞死表現(xiàn)，吞噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞聚集，多數(shù)肝細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)空泡和脂肪滴；血竇面微絨毛稀疏、紊亂；毛細(xì)血管內(nèi)有微血栓形成；SEC增多，細(xì)胞間窗孔減少或消失，顯示肝竇出現(xiàn)毛細(xì)管化改變；KC染色淺。Diss間隙狹窄，且部分內(nèi)有膠原纖維沉積；HSC較多。秋水仙堿組動(dòng)物的肝細(xì)胞壞死不明顯，細(xì)胞內(nèi)有少量空泡和脂肪滴，部分細(xì)胞結(jié)構(gòu)出現(xiàn)紊亂，少數(shù)SEC腫脹，胞漿內(nèi)有大量的胞飲小泡，胞間有間斷性窗孔。Diss腔和竇周間隙仍然可見(jiàn)有少量膠原纖維。芪歸四逆散組的超微結(jié)構(gòu)改變較病理模型組明顯減輕，結(jié)果與秋水仙堿組類似。這些結(jié)果與病理學(xué)結(jié)果一致說(shuō)明，芪歸四逆散有明顯的抗肝纖維化作用。

A. 正常的對(duì)照組 B. 模型對(duì)照組 C. 芪歸四逆散組 D. 秋水仙堿陽(yáng)性對(duì)照組

4 討 論 肝纖維化是一種主動(dòng)進(jìn)展的、可逆的基質(zhì)代謝失衡和肝臟結(jié)締組織重構(gòu)的過(guò)程，是肝星狀細(xì)胞在各種損肝因素持續(xù)刺激下被激活，大量合成細(xì)胞外基質(zhì)在肝內(nèi)沉積引起肝小葉結(jié)構(gòu)改變的病理過(guò)程[5]。當(dāng)肝纖維形成之后，肝臟功能即會(huì)異常，轉(zhuǎn)氨酶水平會(huì)升高，白蛋白會(huì)下降，當(dāng)肝星狀細(xì)胞被激活時(shí)，肝細(xì)胞外基質(zhì)的成分、降解產(chǎn)物及其參與代謝的酶的水平也會(huì)明顯升高。

大量研究證明，在肝纖維化形成過(guò)程中，肝星狀細(xì)胞(HSC)被活化，演變?yōu)槌衫w維細(xì)胞而迅速增殖和分泌大量的膠原纖維蛋白[6]。此外，HSC活化后還分泌TGFβ、血小板衍生因子等以維持自身的活化狀態(tài)。所以，肝組織中的TGFβ含量是星狀細(xì)胞活化的標(biāo)志。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組動(dòng)物比較，模型對(duì)照組動(dòng)物的血清ALT、AST、ALB與HA、LN、C-IV和PcⅢ水平均明顯升高，肝纖維化的病理學(xué)改變明顯，說(shuō)明肝纖維化模型建造成功。加味四逆散處理組動(dòng)物的血清ALT、AST與HA、LN、C-IV和PcⅢ水平明顯降低，ALB明顯升高，肝臟的組織病理學(xué)改變得到明顯地改善,說(shuō)明芪歸四逆散具有明顯的抗肝纖維化作用。另外，模型對(duì)照組動(dòng)物血清的TGFβ水平明顯高于正常對(duì)照組，芪歸四逆散組動(dòng)物的TGFβ水平明顯降低,說(shuō)明芪歸四逆散可能是通過(guò)抑制星狀細(xì)胞活化產(chǎn)生抗肝纖維化作用的。

中醫(yī)認(rèn)為將肝纖維化歸屬于 “積聚”或“積證”的范疇更為準(zhǔn)確[7]。在肝纖維化發(fā)生后，中醫(yī)學(xué)上認(rèn)為的肝藏血、主疏泄的功能失常，出現(xiàn)積聚、積證等癥候。在治療上多采用活血化瘀、散結(jié)解聚的方藥[8]。本實(shí)驗(yàn)所用的芪歸四逆散中就是在四逆散和解藥的基礎(chǔ)上添加了黃芪、當(dāng)歸、紅花、桃仁、川芎等活血化瘀的藥物，減少了肝纖維化大鼠肝細(xì)胞損傷、SEC水腫以及內(nèi)皮側(cè)基底膜形成，改善了肝竇毛細(xì)血管化，減少了RER膜上的多聚核蛋白體解聚及脫粒和SER膜增生，減少了微循環(huán)內(nèi)的血栓，從超微結(jié)構(gòu)上證明了芪歸四逆散的抗肝纖維化的作用。

[1] 孫守才，劉光煒. 加味四逆散治療慢性乙型肝炎肝纖維化的初步研究[J].陜西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2001,24(1)：46-47.

[2] 鄭旭銳，葉建紅，周新穎,等. 加味四逆散對(duì)肝纖維化大鼠肝組織轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子mRNA影響的研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2009,20(10)：2597-2598.

[3] 鄭旭銳，孫守才，李長(zhǎng)秦. 加味四逆散治療肝纖維化量效關(guān)系實(shí)驗(yàn)研究[J]. 吉林中醫(yī)藥，2008,28(5)：377-378.

[4] 中華醫(yī)學(xué)會(huì)傳染病與寄生蟲(chóng)病學(xué)分會(huì)肝病學(xué)分會(huì)．病毒性肝炎防治方案[S]．中華肝臟病雜志，2000，8(6)：324-329．

[5] 王 臺(tái).恩替卡韋聯(lián)合復(fù)方鱉甲軟肝片治療慢性乙型肝炎肝纖維化36例[J].陜西中醫(yī)，2011,32(9):1115-1116.

[6]WilasrusmeeC,SiritheptaweeS,KanchanapanjaponS,etal.Ultrastructuralchangesincirrhoticandnoncirrhoticpatientsduetohepatectomy[J].JHepatobiliaryPancreatSurg,2004,11(4) :266-271.

[7] 馬羽萍. 薛泱洪抗肝纖維化治療經(jīng)驗(yàn)[J].陜西中醫(yī),2014,35(2):214-215.

[8] 雷 娜，鄭仕中，陸 茵. 活血化瘀類中藥防治肝纖維化的機(jī)制及研究進(jìn)展[J]. 中華中醫(yī)藥雜志，2010,25(2): 265-268.

(收稿2016-06-28；修回2016-08-03)

The Effects and mechanism of astragalus& angelica Qigui Sinisan against hepatic fibrosis of rats

Xi’an Eighth People's Hospital(Xi’an710061) Ma Yuping Zhang Dianzeng Guo Yaling et al

Objectives: To observe the effects of Qigui Sinisan against experimental hepatic fibrosis via in rats. Methods: To establish the rat hepatic fibrosis model with CCl4,colchicine as the positive control,and observe the effect of Qigui Sinisan on rats with hepatic fibrosis,in terms of the levels of serum ALT,AST and ALB,the contents of HA,LN,PCⅢ and C-IV,as well as liver-tissue pathology & ultrastructure. Results: Compared with the model group,in the Qigui Sinisan group,the levels of serum AST,ALT,but ALB,as well as HA,LN,PCⅢ,C-IV lowered significantly, the pathological damage on liver tissue significantly repaired,the collagen deposition significantly reduced,and the fibroplasia significantly relieved. According to ultrastructure studies,hepatic-sinusoid fibrin deposition of animals decreases significantly in Qigui Sinisan group. Conclusion: Qigui Sinisan can restore liver function,inhibit the activity of stellate cell,reduce synthesis and deposition of liver fibrin,promote collagen degradation,and improve pathological ultrastructure of hepatic fibrosis,having the definite effect against hepatic fibrosis in rats.

Liver fibrosis/traditional Chinese medicine therapy @Qigui Sinisan Carbon tetrachloride Rats Animal experimentation

*西安市衛(wèi)生局重點(diǎn)學(xué)科優(yōu)勢(shì)?？平ㄔO(shè)項(xiàng)目(2015228)

肝纖維化/中醫(yī)藥療法 @芪歸四逆散 四氯化碳 大鼠 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

R575.2

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2016.11.053

△西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部 (西安710061)