孫慧慧，楊 靖,2，衛(wèi) 笑，付慶云，曹銀萍，茹振鋼，李友勇

(1.河南科技學(xué)院/河南省高等學(xué)校作物分子育種重點(diǎn)學(xué)科開放實(shí)驗(yàn)室/現(xiàn)代生物育種河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南新鄉(xiāng) 453003； 2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，四川成都 611130)

?

小麥BNS雄性不育中國(guó)春恢復(fù)基因的連鎖群檢測(cè)和QTL初步定位

孫慧慧1，楊 靖1,2，衛(wèi) 笑1，付慶云1，曹銀萍1，茹振鋼1，李友勇1

(1.河南科技學(xué)院/河南省高等學(xué)校作物分子育種重點(diǎn)學(xué)科開放實(shí)驗(yàn)室/現(xiàn)代生物育種河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南新鄉(xiāng) 453003； 2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，四川成都 611130)

BNS是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的溫敏小麥雄性不育系，有良好的不育性和自身轉(zhuǎn)換性，在雜交小麥利用和不育資源研究中有重要價(jià)值。為定位BNS的恢復(fù)基因，首先以BNS的高恢復(fù)系中國(guó)春為材料，創(chuàng)建BNS×中國(guó)春F2作圖群體，建立自交結(jié)實(shí)率和花粉可育率兩個(gè)表型BSA池；然后用中國(guó)春缺體-四體系檢測(cè)恢復(fù)相關(guān)連鎖群；最后用這些連鎖群上的SSR分子標(biāo)記篩選BSA池，用檢測(cè)的連鎖標(biāo)記篩選F2作圖群體，進(jìn)一步定位恢復(fù)基因的QTL位點(diǎn)。結(jié)果表明，用BNS與中國(guó)春缺四體雜交，根據(jù)F1不育性檢測(cè)到4個(gè)相關(guān)連鎖群，分別是1A、1B、2B和7B；利用4個(gè)相關(guān)連鎖群和4個(gè)非相關(guān)連鎖群共8個(gè)染色體上的222對(duì)SSR分子標(biāo)記篩選2對(duì)共4個(gè)BSA池，結(jié)果在3個(gè)相關(guān)連鎖群上檢測(cè)到8對(duì)連鎖標(biāo)記；用這8對(duì)連鎖標(biāo)記篩選F2群體210個(gè)個(gè)體植株，檢測(cè)到5個(gè)QTL位點(diǎn)，位于1A、1B和2B染色體上。這些位點(diǎn)中，1個(gè)與自交結(jié)實(shí)率相關(guān)，2個(gè)與兩個(gè)表型均相關(guān)，是主效QTL位點(diǎn)，另2個(gè)與花粉可育率相關(guān)，是微效QTL位點(diǎn)。這些結(jié)果為BNS恢復(fù)基因分子標(biāo)記選擇和精細(xì)定位奠定了基礎(chǔ)。

小麥；BNS雄性不育；恢復(fù)基因；SSR分子標(biāo)記；QTL位點(diǎn)

BNS是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的小麥雄性不育系。多年觀察發(fā)現(xiàn)，當(dāng)該不育系小孢子發(fā)育處于較低溫度時(shí)，花粉發(fā)育敗育，當(dāng)小孢子發(fā)育時(shí)溫度升高，花粉發(fā)育逐步恢復(fù)，因此，BNS是一個(gè)對(duì)溫度敏感的二型雄性不育系[1-3]。觀察還發(fā)現(xiàn)，BNS在生產(chǎn)上不育度高，不育期長(zhǎng)，且年度間穩(wěn)定，一些特殊品種可對(duì)BNS有完全恢復(fù)性[3-7]。因此，BNS既是一個(gè)可應(yīng)用于雜交小麥的優(yōu)良材料，也是一個(gè)有重要研究?jī)r(jià)值的小麥雄性不育種質(zhì)資源。

近些年來(lái)，圍繞BNS的生物學(xué)特性和遺傳機(jī)理，人們?cè)诓挥院妥陨磙D(zhuǎn)換性方面做了大量的研究，并取得了重要進(jìn)展[1-7]，但在不育和恢復(fù)的遺傳機(jī)理以及基因定位方面報(bào)道較少。該方面的進(jìn)展緩慢，主要原因是BNS的不育也是多基因遺傳[1,8-9]，恢復(fù)規(guī)律不明確，加上小麥基礎(chǔ)研究薄弱，基因組測(cè)序未進(jìn)入應(yīng)用階段，因此全基因組測(cè)序定位缺乏參考基因組。關(guān)于BNS的遺傳機(jī)理，目前報(bào)道的有兩種推測(cè)模式，一種是隱性核不育模式，認(rèn)為有1～3個(gè)隱性核不育基因控制BNS的雄性不育[1,8]，另一種是顯性核不育和非等位恢復(fù)模式，認(rèn)為BNS的不育有顯性特征，因?yàn)槎鄶?shù)品種不能恢復(fù)BNS的育性，因此F1的恢復(fù)應(yīng)是不育基因的非等位基因的作用[10]。關(guān)于BNS雄性不育和恢復(fù)相關(guān)基因的定位，Xing等[11]2003年曾將BNS的早期材料BNY-S的不育隱性核基因定位在2B染色體上，王茂婷[12]以BNS×山農(nóng)055525組合的F2群體為材料，采用QTL方法檢測(cè)到與BNS恢復(fù)性相關(guān)的14個(gè)QTL位點(diǎn)，分布在5個(gè)染色體上。這些研究在BNS的不育和恢復(fù)基因定位方面做了開拓性工作，但他們均認(rèn)為BNS的不育是隱性核不育，因此恢復(fù)基因是不育基因的顯性等位基因。

本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)大量的觀察認(rèn)為BNS的恢復(fù)應(yīng)是非等位恢復(fù)機(jī)制，并檢測(cè)到中國(guó)春是一個(gè)高恢復(fù)系[10]。中國(guó)春是一個(gè)小麥研究的經(jīng)典材料，有一套完整的缺體-四體系，能在形態(tài)水平檢驗(yàn)基因所屬連鎖群，并且目前報(bào)道的SSR分子標(biāo)記工具也多是在中國(guó)春組合中開發(fā)的，因此，本研究在BNS非等位恢復(fù)模式下，選用中國(guó)春為恢復(fù)親本，用中國(guó)春及缺體-四體系檢測(cè)中國(guó)春中BNS恢復(fù)基因的所屬連鎖群，然后用SSR分子標(biāo)記方法篩選與恢復(fù)基因連鎖的分子標(biāo)記，最后用這些連鎖標(biāo)記在BNS×中國(guó)春的F2作圖群體中檢測(cè)QTL位點(diǎn)，旨在初步檢測(cè)中國(guó)春恢復(fù)BNS育性的基因位點(diǎn)和特性。

1 材料與方法

1.1 材 料

BNS不育系是本實(shí)驗(yàn)室保存材料?；謴?fù)系中國(guó)春(Chinase Spring,CS)以及中國(guó)春缺四體由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)劉志勇教授惠贈(zèng)，這些缺四體均經(jīng)SSR分子標(biāo)記鑒定，部分重要材料經(jīng)SSR熒光原位標(biāo)記鑒定。

1.2 材料種植和表型調(diào)查

試驗(yàn)材料在河南輝縣小麥育種基地種植。自2008年以來(lái)BNS于歷年10月1日開始播種，8 d一個(gè)播期。本試驗(yàn)中中國(guó)春、中國(guó)春缺四體、BNS×中國(guó)春缺四體的F1和BNS×中國(guó)春的F1及F2均在2013-2014年10月9日播種，該播種期在研究地區(qū)是小麥正季播種期，也是BNS的不育播期[1-3]。田間種植方式為：行長(zhǎng)2 m，行寬0.23 m，種植2行隔1空行。BNS、中國(guó)春及其缺四體和F1種植株距12～15 cm，F(xiàn)2株距18～20 cm。

抽穗后取主莖和高位分蘗穗套羊皮紙帶，每行植株依次套袋，每株套2穗，單穗套，父本每品種套袋20株以上，F(xiàn)1每個(gè)組合套袋30株以上，BNS不育系各播期套袋50株以上，F(xiàn)2全部套袋。成熟后收取套袋穗，統(tǒng)計(jì)每穗小穗數(shù)和結(jié)實(shí)粒數(shù)，每株取2穗的平均數(shù)。采用第1、第2小花結(jié)實(shí)粒數(shù)計(jì)算法[1-3,6-9](國(guó)內(nèi)法)計(jì)算自交結(jié)實(shí)率，即自交結(jié)實(shí)率=第1、第2小花結(jié)實(shí)粒數(shù)/(2×總小穗數(shù))×100%。

開花當(dāng)天取單株的主莖穗上、中、下3個(gè)部位小穗各1個(gè)，隨即固定，后在室內(nèi)取每個(gè)小穗第一小花的3枚花藥，擠出花粉粒，I2-KI染色，參照水稻和小麥的計(jì)數(shù)方法[3,13]統(tǒng)計(jì)完全黑色的可育花粉粒數(shù)和花粉粒總數(shù)，每個(gè)片子取3個(gè)視野，共9個(gè)觀察值，得出平均數(shù)，然后計(jì)算花粉可育率?；ǚ劭捎?可育花粉粒數(shù)目/花粉?？倲?shù)×100%。

不育度和恢復(fù)度是雜交組合后代的套袋不育率或可育率與親本套袋的不育率或可育率的比率。

1.3 基因組DNA的提取及不育、可育池建立

田間依次標(biāo)記BNS×CS的F2單株240個(gè)，于雌雄蕊分化期取各單株幼穗，采用CTAB法提取基因組DNA[10-11,14]，1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA純度和濃度。群體集團(tuán)分離法(Bulked segregant analysis,BSA)池[15]的建立用2個(gè)表型性狀，即自交結(jié)實(shí)率和花粉可育率，方法是在F2群體中取表型最低株系和最高株系各10株，各自DNA等量混合，形成自交結(jié)實(shí)率不育池(A1)和可育池(B1)，花粉可育率不育池(A2)和可育池(B2)。

1.4 SSR引物的選擇及合成

SSR分子標(biāo)記在Daryl的SSR圖譜上選擇[16-17]，從染色體的短臂端開始，按順序每3～5 cM選1個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)，首先選單擴(kuò)增產(chǎn)物標(biāo)記，若長(zhǎng)距離無(wú)單擴(kuò)增產(chǎn)物標(biāo)記，選二產(chǎn)物擴(kuò)增標(biāo)記。在總數(shù)222對(duì)引物中，其中184對(duì)是單擴(kuò)增產(chǎn)物標(biāo)記，38對(duì)是二產(chǎn)物擴(kuò)增標(biāo)記。引物序列在小麥網(wǎng)站(http://wheat.pw.usda.gov/cgi-bin/graingenes/browse.cgi?class=marker/)上獲得，由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

1.5 引物的多態(tài)性檢測(cè)

以P1(BNS)、P2(中國(guó)春)、F1及由F2建立的兩套不育和可育池DNA(見1.3)為模板，參考Somers等[11,17-18]的方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系(25 μL)：ddH2O 18.2 μL，10×Buffer(Mg2+)2.5 μL，dNTP Mix(2.5 mmol·L-1)2 μL，TaqDNA Polymerase(5 U· μL-1)0.3 μL，模板DNA(50 ng· μL-1)1 μL，引物(10 μmol·L-1)1 μL。引物Xgwm、Xwmc和Xbarc的反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，45個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；12 ℃保存。引物Cfd的反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，12 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用2.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，恒壓100 V，電泳50 min。電泳結(jié)束后，UVItec-FireReader凝膠成像分析儀觀察并記錄圖像。

1.6 遺傳圖譜的構(gòu)建

以F2作圖群體各單株總DNA為模板，利用BSA池篩選得到的多態(tài)性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，方法同1.5。用Mapmaker/Exp 3.0b[19]軟件處理標(biāo)記的F2群體中的基因型，計(jì)算標(biāo)記遺傳距離；用WinQTLCart 2.5[20]軟件檢測(cè)QTL位點(diǎn)；用Mapdraw繪制連鎖標(biāo)記和QTL位點(diǎn)合并連鎖圖[21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 BNS和中國(guó)春的自交結(jié)實(shí)率

從表1可以看出，中國(guó)春自交結(jié)實(shí)為59.33%～78.09%，BNS的套袋自交結(jié)實(shí)率為0.7%～3.54%，該結(jié)果也用作同年同期播種的F1、F2代不育和可育的劃分界限。

2.2 BNS與中國(guó)春缺四體雜交F1的自交結(jié)實(shí)率和恢復(fù)基因所屬連鎖群

2013年和2014年共做32個(gè)BNS與中國(guó)春缺四體雜交組合，包含小麥21個(gè)連鎖群，2015年是部分相關(guān)連鎖群的重復(fù)驗(yàn)證，3年調(diào)查的BNS與中國(guó)春及其缺四體雜交F1的自交結(jié)實(shí)率見表2。從表2可以看出，2013年和2014年BNS×中國(guó)春F1套袋自交結(jié)實(shí)率分別為48.24%和60.68%，而中國(guó)春本身套袋自交結(jié)實(shí)率分別為59.33%和70.43%，與父本相比較，F(xiàn)1可恢復(fù)的程度達(dá)81.31%和86.16%，但32個(gè)BNS與中國(guó)春缺四體雜交組合的F1自交結(jié)實(shí)率均下降，部分組合下降顯著，甚至達(dá)到BNS的高不育程度，如N1B-T1A和N2B-T2D與中國(guó)春缺四體雜交組合的F1，這應(yīng)是缺失了恢復(fù)基因的緣故。根據(jù)F1自交結(jié)實(shí)率及其連續(xù)3年不育性的穩(wěn)定性，可知N1A-T1D、N1B-T1A、N1B-T1D、N2B-T2D、N7B-T7A和N7B-T7D為BNS與中國(guó)春缺四體雜交高不育組合的父本，說(shuō)明BNS恢復(fù)基因位于1A、1B、2B和7B染色體上。以2A缺四體為父本的組合有兩個(gè)，但兩個(gè)組合表現(xiàn)不同，即以N2A-T2D為父本的F1表現(xiàn)不育，以N2A-T2B為父本的F1表現(xiàn)可育，雖然3年結(jié)果一致，但不能確定是恢復(fù)相關(guān)連鎖群。還有一些組合，也有高不育現(xiàn)象出現(xiàn)，但年份間表現(xiàn)不穩(wěn)定，因此也不認(rèn)為是恢復(fù)相關(guān)連鎖群。

表1 不育期(10月9日)播種的BNS和中國(guó)春套袋與自然結(jié)實(shí)率

表2 BNS與中國(guó)春缺四體雜交F1及其父本缺四體的自交結(jié)實(shí)率

“-”代表無(wú)調(diào)查數(shù)據(jù)。

“-” represents missing data.

2.3 BNS×中國(guó)春F2作圖群體特征、BSA池建立和基因?qū)?shù)估計(jì)

為了檢測(cè)恢復(fù)基因位點(diǎn)，本研究構(gòu)建了F2作圖群體。田間標(biāo)記和取樣樣本數(shù)240，到分子標(biāo)記篩選后數(shù)據(jù)完整的有效樣本數(shù)210，該210個(gè)樣本的表型(花粉可育率和自交結(jié)實(shí)率)分布見表3。表3的第一和第二區(qū)間設(shè)為0～3.54%和3.55%～9.89%，其中，3.54%和9.89%分別是BNS不育系10月9日播期的自交結(jié)實(shí)率和花粉可育率。從表3可以看出，自交結(jié)實(shí)率在不育性水平3.54%及以下是一個(gè)多數(shù)組，3.54%到99.99%呈連續(xù)分布，平均數(shù)為52.34%，眾數(shù)在50%～80%區(qū)間；從花粉可育率表型看，完全不育株較少，但高花粉可育率個(gè)體較多，平均數(shù)為59.29%，眾數(shù)在60%～90%區(qū)間。這些結(jié)果說(shuō)明，一是花粉可育率大于自交結(jié)實(shí)率，二是兩個(gè)表型分布區(qū)間0～95%，適宜作定位群體。利用兩個(gè)表型的極端個(gè)體建BSA池，樣品均為10株，育性分組中3.54%和9.89%是指與F2同年同期播種的BNS的自交結(jié)實(shí)率和花粉可育率。

表3 BNS×中國(guó)春F2代自交結(jié)實(shí)率和花粉可育率分布(2014年)

Both 3.54% and 9.89% in fertility group represent the self-seedsetting rate and fertile pollen rate of BNS that were sown at the same time as F2.

自交結(jié)實(shí)率不育池結(jié)實(shí)率為0，可育池結(jié)實(shí)率為84.89%～92.9%；花粉可育率不育池可育率平均數(shù)<10%，且3個(gè)小花中有2個(gè)<2%，可育池花粉可育率>88%。

從F2群體分布可以看出，兩個(gè)表型的遺傳方式均是多基因遺傳。以同年BNS不育系表型值為臨界值，2014年自交結(jié)實(shí)率為3.54%，花粉可育率為9.89%，F(xiàn)2群體中自交結(jié)實(shí)率和花粉可育率不育個(gè)體數(shù)分別是19個(gè)和9個(gè)，分別占F2群體的1/11.05和1/23.3，該比值的數(shù)量遺傳學(xué)含義是，從自交結(jié)實(shí)率角度，恢復(fù)不育性有2個(gè)主效基因，從花粉可育率角度，涉及到3個(gè)基因。

2.4 BSA池篩選出8對(duì)多態(tài)性SSR分子標(biāo)記

中國(guó)春缺四體檢測(cè)到恢復(fù)基因與4個(gè)染色體相關(guān)，因此，理論上在相關(guān)染色體上篩選連鎖標(biāo)記即可。但為了提高可靠性，除了用1B、2B、1A和7B染色體外，還增加了4個(gè)對(duì)照染色體，其中，2個(gè)是F1組合育性表現(xiàn)不穩(wěn)定的染色體2A和5D，另2個(gè)是隨機(jī)選取的非相關(guān)染色體3A和7D。沿著該8個(gè)染色體，在Somers的SSR圖譜上[17]順序選取SSR位點(diǎn)222個(gè)，引物在P1、P2、F1、自交結(jié)實(shí)率BSA池和花粉可育率BSA池總DNA中做多態(tài)性檢測(cè)，最后擴(kuò)增的有效引物218對(duì)，篩選出親本間有明顯差異的引物58對(duì)，在該58對(duì)引物中，同時(shí)在不育池和可育池之間也存在相同多態(tài)性的引物8對(duì)，該8對(duì)引物的編號(hào)及所在染色體信息見表4。從表4可看出，檢測(cè)到的多態(tài)性SSR標(biāo)記所在的染色體正是缺四體方法檢測(cè)的連鎖群，用作對(duì)照的非連鎖染色體，沒(méi)有檢測(cè)到連鎖標(biāo)記，5D染色體也沒(méi)有篩選到連鎖標(biāo)記，2A染色體上在花粉可育率池中檢測(cè)到1對(duì)連鎖標(biāo)記。還有一個(gè)例外是7B染色體，缺四體檢測(cè)是連鎖染色體，但該染色體上用33對(duì)引物擴(kuò)增，結(jié)果沒(méi)有檢測(cè)到連鎖標(biāo)記。

8對(duì)多態(tài)性標(biāo)記的擴(kuò)增帶型清晰，區(qū)分明顯(圖1)，擴(kuò)增產(chǎn)物分子量在100～300 bp之間，其中序號(hào)1～7號(hào)(表4)標(biāo)記是共顯性標(biāo)記，8號(hào)是顯父顯性標(biāo)記。這些多態(tài)性標(biāo)記中，Xwmc619是在自交結(jié)實(shí)率BSA池中檢測(cè)到的，Xgwm311在兩個(gè)表型池中均檢測(cè)出多態(tài)性，其余6對(duì)均是在花粉可育率BSA池中檢測(cè)到的。

表4 親本和BSA池DNA中檢測(cè)的共分離SSR分子標(biāo)記

a～h分別表示分子標(biāo)記引物Xwmc24、Xbarc14、Xwmc312、Xgwm124、Xwmc619、Xgwm311、Xwmc154和Xwmc770的擴(kuò)增結(jié)果；M：DL1000；P1：BNS；P2：中國(guó)春；F1:BNS與中國(guó)春雜交F1代；A1：自交結(jié)實(shí)率不育池；B1：自交結(jié)實(shí)率可育池；A2：花粉可育率不育池；B2：花粉可育率可育池。

a-h indicate the amplication results of molecular marker Xwmc24,Xbarc14,Xwmc312,Xgwm124,Xwmc619,Xgwm311,Xwmc154 and Xwmc770，respectively;M:DL1000; P1:BNS; P2:Chinese Spring; F1:F1generation of BNS×CS; A1:Sterile pool of self seedsetting rate; B1:Fertile pool of self seedsetting rate; A2:Sterile pool of pollen fertility rate; B2:Fertile pool of pollen fertility rate.

圖1 8對(duì)多態(tài)性SSR標(biāo)記引物在親本與BSA池中擴(kuò)增的瓊脂糖凝膠電泳圖

Fig.1 Eight agarose gel electrophoresis of screening SSR molecular marker among BNS,Chinese Spring and BSA pools

2.5 恢復(fù)基因QTL檢測(cè)和初步定位

用具有多態(tài)性的8對(duì)SSR標(biāo)記對(duì)F2群體總DNA擴(kuò)增，結(jié)果顯示，標(biāo)記的帶型保持清晰，產(chǎn)物分子量與BSA池篩選時(shí)保持一致，部分帶型圖譜見圖2。從圖譜上讀出的多態(tài)性標(biāo)記基因型在Mapmaker/Exp 3.0b軟件上運(yùn)行，結(jié)果是，1A染色體上Xwmc24和Xwmc312連鎖，2B染色體上Xwmc154和Xwmc770連鎖，與Somers的SSR圖譜連鎖關(guān)系[17]一致，但Xbarc148未檢測(cè)到與1A連鎖，1B上兩個(gè)標(biāo)記Xgwm124和Xgwm311也未檢測(cè)到連鎖，這可能是標(biāo)記間相距較遠(yuǎn)的緣故。按照Somers的SSR圖譜連鎖關(guān)系，將Xbarc148添加到1A染色體上，Xgwm124與Xgwm311添加在1B染色體上，計(jì)算出相互間的遺傳距離，結(jié)果見表5。然后用WinQTLChart 2.5軟件處理表5遺傳距離數(shù)據(jù)，采用區(qū)間分析法檢測(cè)QTL位點(diǎn)，結(jié)果共發(fā)現(xiàn)5個(gè)QTL位點(diǎn)，1A染色體上2個(gè)，標(biāo)記為 QTL1和 QTL2；1B染色體上2個(gè)，標(biāo)記為 QTL3和 QTL4；2B染色體上1個(gè)，標(biāo)記為 QTL5，其中， QTL1僅與自交結(jié)實(shí)率相關(guān)， QTL2和 QTL3僅與花粉可育率相關(guān)， QTL4和 QTL5與兩個(gè)表型性狀均相關(guān)，說(shuō)明 QTL1是與授粉相關(guān)的位點(diǎn)， QTL2和 QTL3是與花粉發(fā)育相關(guān)的位點(diǎn)， QTL4和 QTL5與花粉發(fā)育和授粉均相關(guān)。這些QTL位點(diǎn)的遺傳特性參數(shù)見表6，從表6可看出，LOD值最小也為3.8, QTL1和 QTL4達(dá)10以上， QTL5是9.9,說(shuō)明QTL的真實(shí)性很高。 QTL1、3、4、5均是加性和顯性效應(yīng)，與張寶雷[8]測(cè)定的效應(yīng)一致。根據(jù)這些位點(diǎn)的LOD值和遺傳效應(yīng)，分析認(rèn)為， QTL1、 QTL4和 QTL5應(yīng)是主效QTL， QTL2和 QTL3是微效QTL。5個(gè)QTL位點(diǎn)和8個(gè)連鎖標(biāo)記的連鎖圖見圖3。2A染色體上的連鎖標(biāo)記Xgwm311沒(méi)有檢測(cè)到QTL位點(diǎn)。

a～c分別表示標(biāo)記Xwmc24、Xwmc312和Xwmc154的擴(kuò)增結(jié)果； M：DL1000；P1：BNS；P2：中國(guó)春；F1:BNS與中國(guó)春雜交F1代；A1：自交結(jié)實(shí)率不育池；B1：自交結(jié)實(shí)率可育池；A2：花粉可育率不育池；B2：花粉可育率可育池；1～12:F2群體部分單株。

a-c indicate the amplication results of molecular marker Xwmc24,Xwmc312 and Xwmc154,respectively; M:DL1000; P1:BNS; P2:Chinese Spring; F1:F1generation of BNS×CS; A1:Sterile pool of self seedsetting rate; B1:Fertile pool of self seedsetting rate; A2:Sterile pool of pollen fertility rate; B2:Fertile pool of pollen fertility rate; 1-12：Part plants in F2population.

圖2 部分多態(tài)性標(biāo)記在部分F2群體中的擴(kuò)增結(jié)果

Fig.2 Amplication results of part polymorphic markers in part F2population

表5 8個(gè)連鎖標(biāo)記的Mapmaker/EXP 3.0b連鎖圖距

表6 WinQTLCart 2.5檢測(cè)的5個(gè)QTL及遺傳特性參數(shù)

連鎖性狀列中，P指花粉可育率，S指自交結(jié)實(shí)率。

In the column of linkage character,P refers to the pollen fertility rate,and S refers to the self seedsetting rate.

圖3 中國(guó)春恢復(fù)BNS育性基因的QTL位點(diǎn)和連鎖標(biāo)記位點(diǎn)遺傳圖譜

3 討 論

3.1 關(guān)于在中國(guó)春缺四體檢測(cè)到的4個(gè)與恢復(fù)相關(guān)的連鎖群

關(guān)于BNS的不育和恢復(fù)機(jī)制，如果看作是隱性核不育，那么恢復(fù)基因應(yīng)是不育的等位基因，但大多數(shù)可育的小麥品種不能恢復(fù)BNS的育性，因此非等位恢復(fù)的推斷更加合理[10]。中國(guó)春是BNS的高恢復(fù)系，應(yīng)具有恢復(fù)BNS育性的主效基因，因此中國(guó)春的缺四體能夠檢測(cè)出恢復(fù)基因所在的染色體。從本研究結(jié)果可以看出，中國(guó)春的缺四體本身自交結(jié)實(shí)率，除N5D-T5A、N4A-T4B和N4A-T4D較低，分別為39.00%、54.29%和44.51%外，其余缺四體均在60.00%以上，但F1的組合自交結(jié)實(shí)率顯著下降，一些如以N1B-T1A、N2B-T2D為父本的組合，不育性達(dá)到BNS的水平，顯然結(jié)實(shí)率的下降是由于缺失染色體引起的，因此可以推測(cè)，缺失的染色體上攜帶有恢復(fù)的相關(guān)基因。根據(jù)結(jié)果，從該途徑檢測(cè)的4個(gè)染色體1B、2B、1A和7B缺四體與BNS雜交F1自交結(jié)實(shí)率低，3年表現(xiàn)穩(wěn)定，因此認(rèn)為這些染色體上載荷有BNS的恢復(fù)基因或重要相關(guān)基因。

3.2 關(guān)于BSA池篩選出的8對(duì)連鎖分子標(biāo)記

為了進(jìn)一步定位恢復(fù)基因，檢測(cè)和發(fā)現(xiàn)連鎖標(biāo)記是有效途徑。用該4個(gè)相關(guān)連鎖群染色體，加上育性不穩(wěn)定的2個(gè)連鎖群染色體，以及2個(gè)對(duì)照染色體共8個(gè)染色體，222對(duì)SSR引物，在2對(duì)共4個(gè)BSA池篩選，結(jié)果在3個(gè)相關(guān)的連鎖群上篩選到8對(duì)連鎖標(biāo)記，這些標(biāo)記，既是進(jìn)一步檢測(cè)QTL的連鎖標(biāo)記位點(diǎn)，也是恢復(fù)性選擇時(shí)可利用的連鎖標(biāo)記。

篩選到的8對(duì)連鎖標(biāo)記，其中7對(duì)位于3個(gè)相關(guān)連鎖群上，1對(duì)位于育性不穩(wěn)定的2A染色體上，其余染色體，包括育性不穩(wěn)定的5D染色體和非相關(guān)染色體，均未篩選到連鎖標(biāo)記，這一方面說(shuō)明缺四體檢測(cè)的可信性，另一方面也說(shuō)明表型不穩(wěn)定的材料也有遺傳基礎(chǔ)，但該遺傳基礎(chǔ)是否是真正的恢復(fù)基因，需要F2群體分離來(lái)證實(shí)。另外，缺四體檢測(cè)的相關(guān)染色體7B上沒(méi)有檢測(cè)到連鎖標(biāo)記，該現(xiàn)象的出現(xiàn)有些意外，該現(xiàn)象是由于檢測(cè)的SSR分子標(biāo)記密度不夠，還是缺四體檢測(cè)環(huán)節(jié)出現(xiàn)假陽(yáng)性，需后續(xù)進(jìn)一步研究。

在篩選連鎖標(biāo)記時(shí)，建立了兩種類型BSA池，這是因?yàn)樵诒硇驼{(diào)查時(shí)，發(fā)現(xiàn)群體中部分個(gè)體自交結(jié)實(shí)率和花粉可育率兩個(gè)表型不一致。自交結(jié)實(shí)率和花粉可育率不是同一概念[22]，但都是雄性不育的重要指標(biāo)。從結(jié)果也可看出，在兩種類型BSA池中分別篩選到不同連鎖標(biāo)記，在自交結(jié)實(shí)率池中檢測(cè)到Xwmc619/1B和Xgwm311/2A 2對(duì)連鎖標(biāo)記，在花粉可育率池中，除Xwmc619/1B標(biāo)記外，7對(duì)標(biāo)記均被檢測(cè)出來(lái)，這說(shuō)明花粉可育率池靈敏度更高，但也有重大缺陷，它沒(méi)有檢測(cè)出重要的Xwmc619/1B標(biāo)記，因此，對(duì)恢復(fù)基因分子標(biāo)記的篩選來(lái)說(shuō)，兩種類型BSA池都是必需的。

3.3 關(guān)于F2作圖群體檢測(cè)到的5個(gè)QTL位點(diǎn)

8對(duì)連鎖SSR標(biāo)記在F2群體中檢測(cè)到5個(gè)QTL位點(diǎn)，其中， QTL1、 QTL4和 QTL5與自交結(jié)實(shí)率相關(guān)，認(rèn)為是主效恢復(fù)基因位點(diǎn)，4個(gè)與花粉可育率相關(guān)的位點(diǎn)，除2個(gè)與自交結(jié)實(shí)率重疊，是主效位點(diǎn)外，另2個(gè) QTL2和 QTL3屬微效位點(diǎn)。需要指出的是，這些位點(diǎn)的重要性是根據(jù)LOD值確定的，但它們連鎖的基因的確切作用需要進(jìn)一步檢測(cè)之后才能確定。在QTL的數(shù)目上，由于中國(guó)春是BNS的高恢復(fù)系，F(xiàn)1相對(duì)中國(guó)春恢復(fù)度在85.0%左右，因此，理論上，具有多數(shù)位點(diǎn)，但不具備全部位點(diǎn)，因此BNS的完全恢復(fù)，除上述位點(diǎn)外，還應(yīng)有一些微效恢復(fù)位點(diǎn)存在。王茂婷[12]用BNS×山農(nóng)555025的F2為作圖群體，檢測(cè)到14個(gè)QTL，分布在1A、1B、4A、4B和7B染色體上，而中國(guó)春中并沒(méi)有檢測(cè)到4A、4B染色體上有恢復(fù)位點(diǎn)，而檢測(cè)到2B染色體上的恢復(fù)位點(diǎn)。2B染色體缺四體組合F1不育性很低，3年結(jié)果一致，因此，2B染色體是恢復(fù)的一個(gè)主效位點(diǎn)染色體。這些相同和不同，還需今后更多的檢測(cè)來(lái)證實(shí)。

另外，檢測(cè)的QTL數(shù)目的結(jié)果和作圖群體估計(jì)的基因數(shù)目基本一致。結(jié)果中顯示利用F2分離數(shù)據(jù)估計(jì)恢復(fù)基因數(shù)目，與自交結(jié)實(shí)率相關(guān)是2個(gè)主效基因，與花粉可育率相關(guān)是3個(gè)基因，檢測(cè)的QTL位點(diǎn)，分別是3個(gè)和4個(gè)。由于表型是基因綜合作用的結(jié)果，因此，基因數(shù)目估計(jì)值一般偏小。

檢測(cè)的恢復(fù)多位點(diǎn)還有一個(gè)重要意義，就是可解釋BNS的完全恢復(fù)系較少的原因。目前報(bào)道的正?？捎男←溒贩N，能完全恢復(fù)BNS的育性的品種較少[5,9-10]。分析認(rèn)為這是由于對(duì)BNS不育性的完全恢復(fù)，上述位點(diǎn)以及未檢測(cè)到的位點(diǎn)都必須是顯性狀態(tài)，或者說(shuō)對(duì)恢復(fù)的有效狀態(tài)才能實(shí)現(xiàn)，因此在此之前沒(méi)有進(jìn)行過(guò)恢復(fù)性選擇的小麥品種中，恢復(fù)位點(diǎn)全部是顯性狀態(tài)的基因型，理論概率比較小，各種恢復(fù)性能力品種的比率應(yīng)是恢復(fù)位點(diǎn)數(shù)的隨機(jī)組合概率。

根據(jù)以上討論，本研究從連鎖群檢測(cè)，到SSR連鎖標(biāo)記篩選，到QTL定位，3個(gè)環(huán)節(jié)相互聯(lián)系，相互支撐，得到的結(jié)果相互印證，與數(shù)量遺傳的基因?qū)?shù)估計(jì)的結(jié)果也吻合，因此認(rèn)為檢測(cè)的連鎖群和定位的QTL有較高可靠性。但還有一些問(wèn)題需深入研究和回答，如中國(guó)春是高恢復(fù)系，但不是完全恢復(fù)系，因此定位的位點(diǎn)不是全部位點(diǎn)，今后需用恢復(fù)度更高的恢復(fù)系與BNS雜交建立作圖群體，整合定位位點(diǎn)；7B染色體是否是恢復(fù)相關(guān)連鎖群需進(jìn)一步檢測(cè)；還有如BNS與中國(guó)春F1中的一些組合，缺少1對(duì)染色體即幾乎完全不育，表現(xiàn)出重疊基因的性質(zhì)；檢測(cè)的QTLs與分子標(biāo)記之間的距離還較大等，這些現(xiàn)象，可能存在實(shí)驗(yàn)假陽(yáng)性或假隱性，也可能存在恢復(fù)基因靶基因的干擾，這些疑問(wèn)需通過(guò)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方案和技術(shù)路線等方法來(lái)解決，如選用透氣性更好的紙袋減少套袋對(duì)授粉的影響，提高SSR分子標(biāo)記篩選密度來(lái)提高QTLs與分子標(biāo)記之間的連鎖強(qiáng)度等，準(zhǔn)確檢測(cè)和定位BNS的恢復(fù)基因及位點(diǎn)。

[1]李羅江,茹振剛,高慶榮,等.BNS小麥的雄性不育性及其溫光特性 [J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,42(9):3019-3027.

LI L J,RU Z G,GAO Q R,etal.Male sterility and thermo-photo sensitivity charaterisitics of BNS in wheat [J].ScientiaAgriculturaSinica,2009,42(9):3019-3027.

[2]張自陽(yáng),胡鐵柱,馮素偉,等.溫敏核雄性不育小麥BNS的育性轉(zhuǎn)換規(guī)律初探 [J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué),2010(7):5-9.

ZHANG Z Y,HU T Z,FENG S W,etal.A preliminary study on fertility alteration of thermo-sensitive genic male sterile wheat line BNS [J].HenanAgriculturalSciences,2010(7):5-9.

[3]周美蘭,茹振鋼,駱葉青,等.兩系小麥不育系BNS雄性育性的轉(zhuǎn)換 [J].核農(nóng)學(xué)報(bào),2010,24(5):887-894.

ZHOU M L,RU Z G,LUO Y Q,etal.Male fertility transformation of two-line wheat sterile lines BNS [J].JournalofNuclearAgriculturalSciences,2010,24(5):887-894.

[4]李羅江,茹振鋼,高慶榮,等.小麥雄性不育系BNS及其雜種F1的育性分析 [J].麥類作物學(xué)報(bào),2009,29(4):583-587.

LI L J,RU Z G,GAO Q R,etal.Analysis the fertility of male-sterile line BNS and its F1hybrids in wheat [J].JournalofTriticeaeCrops,2009,29(4):583-587.

[5]寧江權(quán),茹振鋼,鄭煒君,等.BNS小麥雄性不育性及其恢復(fù)性的研究 [J].麥類作物學(xué)報(bào),2011,31(4):642-647.

NING J Q,RU Z G,ZHENG W J,etal.Male sterility and restoration of thermo-photo-sensitive male sterile line BNS of common wheat [J].JournalofTriticeaeCrops,2011,31(4):642-647.

[6]范曉靜,馬小飛,王 震,等.小麥溫敏雄性不育系BNS的遺傳穩(wěn)定性及恢復(fù)性 [J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2015,43(4):53-58.

FAN X J,MA X F,WANG Z,etal.Hereditary stability and restoration of thermo-photo-sensitive male sterile line BNS of wheat(TriticumaestivumL.) [J].JournalofNorthwestA&FUniversity(NaturalScienceEdition),2015,43(4):53-58.

[7]秦志英,楊 靖,馬亞朝,等.BNS小麥雄性不育系育性的穩(wěn)定性和波動(dòng)性 [J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2013,22(4):39-43.

QIN Z Y,YANG J,MA Y C,etal.Stability and variability of male infertility of wheat BNS line [J].ActaAgriculturaeBoreali-occidentalisSinica,2013,22(4):39-43.

[8]張保雷,張衛(wèi)東,高慶榮,等.溫光敏雄性不育小麥BNS育性的遺傳效應(yīng)分析 [J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2013,46(8):1533-1542.

ZHANG B L,ZHANG W D,GAO Q R,etal.Genetic analysis on male sterility of thermo-photo-sensitive male sterile line BNS in wheat [J].ScientiaAgriculturaSinica,2013,46(8):1533-1542.

[9]馬小飛,王 震,李雪垠,等.小麥溫光敏雄性不育系BNS育性恢復(fù)性測(cè)定及雜種優(yōu)勢(shì) [J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2013,22(7):90-94. MA X F,WANG Z,LI X Y,etal.Restoring ability test and heterosis analysis of wheat thermo-photo-sensitive genic male sterile line BNS [J].ActaAgriculturaeBoteali-occidentalisSinica,2013,22(7):90-94.

[10]曹銀萍,楊 靖,茹振鋼,等.小麥溫敏雄性不育BNS的顯性不育和非等位顯性恢復(fù)特性觀察[R/OL].中國(guó)科技論文在線(http://www.paper.edu.cn/releasepaper/content/),2015:3-15. CAO Y P,YANG J,RU Z G,etal.Observation of the characteristics of dominant infertility and non-allelic dominant recovery on male sterile wheat BNS [R/OL].Sciencepaper Online(http://www.paper.edu.cn/releasepaper/content/),2015:3-15.

[11]XING Q H,RU Z G,ZHOU C J,etal.Molecular tagging and mapping of the thermo-sensitive genic male-sterile gene( wtms1) in wheat [J].TheoreticalandAppliedGenetics,2003,107(8):1500-1504.

[12]王茂婷.BNS小麥雄性不育性恢復(fù)基因遺傳特性和QTL初步定位 [D].山東:山東農(nóng)業(yè)大學(xué),2011:41.

WANG M T.Genetic analysis and QTL priliminary mapping for fertility of BNS [D].Shandong:Shandong Agricultural University,2011:41.

[13]王風(fēng)平,梅明華,徐才國(guó),等.光敏核不育水稻農(nóng)墾58S與正常品種“農(nóng)墾58”在 pms1區(qū)段無(wú)育性基因分離 [J].植物學(xué)報(bào),1997,39(10):922-925.

WANG F P,MEI M H,XU C G,etal. Pms1 is not the locus relevant to fertility difference between the photoperiod-sensitive male sterile rice Nongken 58S and normal rice “Nongken 58” [J].ChineseBulletinofBotany,1997,39(10):922-925.

[14]CHEN D H,RONALD P C.A rapid DNA minipreparation method suitable for AFLP and other PCR applications [J].PlantMolecularBiologyReporter,1999,17(1):53-57.

[15]MICHELMORE R W,PARAN I,KESSELI R V.Identification of markers linked to disease-resistance genes by bulked segregant analysis:a rapid method to detect markers in specific genomic regions by using segregating populations [J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,1991,88(21):9828-9832.

[16]R?DER M S,KORZUN V,WENDEHAKE K,etal.A microsatellite map of wheat [J].GeneticsSocietyofAmerica,1998,149(14):2007-2023.

[17]SOMERS D J,ISAAC P,EDWARDS K.A high-density microsatellite consensus map for bread wheat(TriticumaestivumL.) [J].TheoreticalandAppliedGenetics,2004,109(16):1105-1114.

[18]何蓓如,董普輝,宋喜悅,等.小麥溫度敏感不育系A(chǔ)3314溫敏特性研究 [J].麥類作物學(xué)報(bào),2003,23(1):1-6.

HE B R,DONG P H,SONG X Y,etal.Study on the thermo-sensitivity male sterile wheat line A3314 [J].JournalofTriticeaeCrops,2003,23(1):1-6.

[19]王竹林,楊 睿,楊興圣,等.Mapmaker 3.0和作圖軟件使用 [J].實(shí)驗(yàn)室研究與探索,2012,31(11):62-65.

WANG Z L,YANG R,YANG X S,etal.The use of mapmaker 3.0 and mapping software [J].ResearchandExplorationinLaborator,2012,31(11):62-65.

[20]WANG S,BASTEN C J,ZENG Z B.Windows QTL Cartographer 2.5 [EB/OL].Department of Statistics,North Carolina State University,Raleigh,NC.[2015-10-16]http://statgen.ncsu.edu/qtlcart/WQTLCart.htm.

[21]劉仁虎,孟金陵.MapDraw,在Excel中繪制遺傳連鎖圖的宏 [J].遺傳,2003,25(3):317-321.

LIU R H,MENG J L.MapDraw:a microsoft excel macro for drawing genetic linkage maps based on given genetic linkage data [J].Hereditas,2003,25(3):317-321.

[22]姚克敏,劉 梅,袁潛華.水稻不育系育性觀察指標(biāo)套袋自交結(jié)實(shí)率和花粉可育度的比較分析 [J].雜交水稻,1998,13(4):23-25.

YAO K M,LIU M,YUAN Q H.Comparison of bagged seed set with pollen fertility in observing the fertility of male sterile rice [J].HybridRice,1998,13(4):23-25.

Detection of Linkage Groups and Location of QTLs in Chinese Spring for Restorer Wheat BNS Male Sterility SUN Huihui1,YANG Jing1,2,WEI Xiao1,FU Qingyun1,

CAO Yinping1,RU Zhengang1,LI Youyong1

(1.Henan Institute of Science and Technology/Key Discipline Opening Laboratory of Crop Molecular Breeding of Henan Province/Collaborative Innovation Center of Modern Biological Breeding,Xinxiang,Henan 453003,China; 2.College of Agronomy,Sichuan Agricultural University,Chengdu,Sichuan 611130,China)

BNS is a new type of thermo-sensitive wheat male-sterile line,and has excellent sterility and convertibility by itself. It is of important value for the utilization of hybrid wheat and the research of genetic resources. In order to locate the restorer gene of BNS,wheat Chinese Spring(CS),a high restorer line for BNS,was selected as parent material to reform an F2population by crossing over BNS. In the detection,two bulked segregant analysis(BSA) pools of phenotypes,the self-seedsetting rate and pollen fertility rate were established. First,the linkage groups related to restorer gene(s) were detected by Chinese Spring nulli-tetrasomes. Then,SSR molecular markers on these linkage groups were used to screen two BSA pools,and the linked markers obtained in screening were used to screen F2population to detect QTL loci of restorer gene(s). The results showed that when CS nulli-tetrasomes was crossed over BNS,there were four recombinations in F1to be pulled into low self-seedsetting rate,meaning that the four linkage groups on chromosomes 1B,2B,1A and 7B were relative to the recovery of BNS. When 222 pairs of SSR primers from 8 chromosomes were used to screen two phenotypes BSA pools,it was found that there were eight SSR markers on three linkage groups on chromosomes 1B,2B and 1A,which are linked with the restoration of BNS. These eight linkage markers then were used for screening 210 individual plants of F2population,and five QTL loci were found. Of them,one QTL was relative to self seedsetting rate only,and two major QTLs were relative to two phenotypes,and two minor QTLs were relative to fertile pollen rate only,which were located on chromosomes 1A,1B and 2B,respectively. These results laid a value foundation for MAS(marker-assisted selection) and fine mapping of BNS restorer genes.

Wheat; BNS male sterility; Restorer gene; SSR molecular marker; QTL locus

時(shí)間：2016-07-07

2015-12-03

2016-03-30

河南省基礎(chǔ)與前沿計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(122300410011，162300410136)

E-mail:vip.sunhui@qq.com(孫慧慧)；yangjing228@foxmail.com(楊 靖，與第一作者同等貢獻(xiàn))

李友勇(E-mail:liyouyong@163.com)

S512.1；S330

A

1009-1041(2016)07-0856-10

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20160707.1530.010.html