翟新宇 丁 毅 趙建華*

（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海 201203）

澤瀉+車前子復(fù)方對(duì)大鼠尿草酸鈣結(jié)石形成的影響

翟新宇 丁 毅 趙建華*

（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海 201203）

目的 研究澤瀉+車前子復(fù)方水提取液對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠尿草酸鈣結(jié)石形成的影響，確定其抑制腎臟草酸鈣結(jié)石的形成并具有保護(hù)腎功能的作用。方法 通過喂服澤瀉+車前子復(fù)方不同濃度的水提取液對(duì)乙二醇和1α羥基維生素D3誘導(dǎo)的大白鼠腎草酸鈣結(jié)石模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。結(jié)果 乙二醇和1α羥基維生素D3誘導(dǎo)能顯著提高大鼠尿草酸鈣結(jié)石模型大鼠血BUN、Cr、24 h尿Ox、尿Ca2+分泌量及腎Ca2+含量，但對(duì)血P3+、尿Mg2+和腎Mg2+無明顯變化；不同劑量藥物組大鼠腎Ca2+含量、24 h尿Ca2+分泌量、尿Ox、腎組織的草酸鈣結(jié)晶及腎小管擴(kuò)張均明顯低于草酸鈣結(jié)石模型組（P＜0.05），藥物組大鼠血P3+、尿Mg2+和腎Mg2+和草酸鈣結(jié)石模型組間無明顯差異。結(jié)論 澤瀉+車前子復(fù)方水提取液能抑制實(shí)驗(yàn)性大鼠體內(nèi)腎草酸鈣晶體的形成并具有保護(hù)腎臟功能的作用。

尿石；草酸鈣；澤瀉；車前子；大鼠

尿石癥是常見的泌尿外科疾病之一，它既是一種歷史古老的疾病又是一個(gè)現(xiàn)代醫(yī)療上的重要問題。在流行病調(diào)查中，國際上每年有10萬新發(fā)病人數(shù)，然而實(shí)際住院治療者僅占該病的25%，其他多數(shù)患者在院外治療[1]。在中國，中醫(yī)藥治療結(jié)石已經(jīng)成為院外治療的主要手段之一。

在中醫(yī)中，泌尿系結(jié)石歸屬于“淋”。淋者有五：熱淋、石淋、血淋、膏淋和勞淋。泌尿系結(jié)石屬于“石淋”和“血淋”的范疇。隋《諸病源候論》中說：“石淋者，淋而出石也，其病之狀，小便則莖里痛，尿不能足出，痛引少腹，膀胱里急，沙石從小便道出，甚者塞痛?！迸R床以腎絞痛和血尿?yàn)橹靼Y，后期亦可引起腎功能不全。中藥以“清利濕熱、利尿通淋”為治療泌尿系結(jié)石的方法，多采用如滑石、澤瀉、車前子、石韋、燈心草、地膚子等作為藥方中的主要成分用于泌尿系結(jié)石的治療。

澤瀉（Alisma）為植物澤瀉的干燥塊莖，味甘、淡、性寒，歸腎、膀胱經(jīng)，利水滲濕、泄熱通淋。主小便不利；熱淋澀痛；水腫脹滿；泄瀉；痰飲眩暈；遺精?？膳c多種中草藥配伍組成治療尿路結(jié)石的傳統(tǒng)方劑，如豬苓湯、五苓散等。小川等[2]研究證實(shí)豬苓湯具有排石和體外抑制草酸鈣結(jié)晶的作用，認(rèn)為豬苓湯主要是通過降低尿草酸排泄量而抑制實(shí)驗(yàn)性大鼠尿草酸鈣結(jié)石形成。尹春平等[3]在乙二醇和1α羥基維生素D3誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性大鼠腎草酸鈣結(jié)石模型中，發(fā)現(xiàn)澤瀉水提取液能明顯抑制大鼠尿草酸鈣結(jié)石形成，同時(shí)澤瀉水提取液對(duì)草酸及鈣的代謝沒有影響。李浩勇、劉繼紅[4]等發(fā)現(xiàn)澤瀉水提取液高劑量組可明顯降低腎組織Ca2+的含量，對(duì)24 h尿Ca2+也有減少的趨勢(shì)，一定程度上減輕腎小管擴(kuò)張和草酸鈣結(jié)晶的形成。

車前子（Plantago）為植物車前的干燥成熟種子，味甘、微寒，歸肝、腎、肺、小腸經(jīng)，清熱利尿、滲濕通淋、明目、祛痰。用于水腫脹滿，熱淋澀痛，暑濕泄瀉，目赤腫痛，痰熱咳嗽。《本草新編》所載：車前子，味甘、咸，氣微寒，無毒。入膀胱、脾、腎三經(jīng)。功專利水，通尿管最神，止淋瀝泄瀉，能閉精竅，祛風(fēng)熱，善消赤目，催生有功。但性滑，利水可以多用，以其不走氣也。邵紹豐[5]等在對(duì)單味中藥金錢草、石韋、車前子對(duì)大鼠腎結(jié)石腎保護(hù)作用的研究中發(fā)現(xiàn)車前子能預(yù)防腎結(jié)石，保護(hù)腎功能，其作用可能是通過增加尿中草酸鈣結(jié)晶的排泄，減少其在腎內(nèi)堆積而達(dá)到的。

1　材料與方法

1.1材料、主要試劑、儀器：澤瀉生藥材：上海市曙光醫(yī)院中藥房，產(chǎn)地福建，批號(hào)110907；車前子生藥材：上海市曙光醫(yī)院中藥房，產(chǎn)地吉林，批號(hào)120701；枸櫞酸鉀溶液（上海曙光醫(yī)院藥房自制0.1 g/mL，批號(hào)：110903）；阿法骨化醇片（重慶藥友制藥有限責(zé)任公司，0.25 μg阿法骨化醇（1-α（OH）VitD3）/片）；HC-9600型火焰原子吸收分光光度計(jì)，附計(jì)算機(jī)一臺(tái)及FAAS軟件（上海荊和分析儀器有限公司產(chǎn)，上海中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)系提供）；FJ-200可調(diào)高速分散機(jī)（江蘇儀器有限公司）；低速離心機(jī)（張家港離心機(jī)制造有限公司生產(chǎn)）；偏光顯微鏡NIKON 1100（上海中醫(yī)藥大學(xué)組織學(xué)系提供）。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1澤瀉+車前子復(fù)方有效成分不同濃度的制備：按澤瀉∶車前子=9∶15的比例（藥典上最大常用量的比例），稱取100 g澤瀉和166.8 g車前子，采用煎煮法，煎煮3次，每次2 h，加水量分別為2.35、1.7、1.4 L。過濾，合并濾液。濾液濃縮至500 mL，得濃度為0.2 g/mL的藥液（以澤瀉生藥量計(jì)）。取50 mL 0.2 g/mL的藥液，用蒸餾水定容至100 mL，得濃度為0.1 g/mL的藥液。

表4　澤瀉+車前子不同劑量組對(duì)大鼠24 h尿草酸分泌量、尿鈣、尿鎂含量及腎組織鈣、鎂含量的結(jié)果（，n=10）

表4　澤瀉+車前子不同劑量組對(duì)大鼠24 h尿草酸分泌量、尿鈣、尿鎂含量及腎組織鈣、鎂含量的結(jié)果（，n=10）

注：與A組相比1）P＜0.05；與B組相比2）P＜0.05

組別　　尿Ox(mmol/24 h)　　尿Ca2+(mmol/24 h)　　尿Mg2+(mmol/24 h)　　腎Ca2+(mg/g)　　腎Mg2+(mg/g) A 0.218±0.027　0.34±0.04　0.50±0.06　2.73±0.90　0.96±0.09 B 0.416±0.0331)2)　0.85±0.061)　0.46±0.09　10.42±2.221)　0.93±0.07 0.324±0.0351)2)　0.55±0.071)2)　0.48±0.06　6.11±2.391)2)　0.85±0.17 D 0.322±0.0211)2)　0.50±0.061)2)　0.47±0.07　7.09±2.531)2)　0.90±0.11 E 0.295±0.0441)2)　0.56±0.081)2)　0.51±0.08　6.95±2.981)2)　0.91±0.18 F 0.298±0.0361)2)　0.46±0.051)2)　0.53±0.08　5.81±1.271)2)　0.89±0.07 C

1.2.2動(dòng)物分組及給藥方法：SD健康雄性大鼠60只（上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），體質(zhì)量180～220 g，隨機(jī)分為6組，每組10只，在清潔級(jí)環(huán)境下飼養(yǎng)。購買后適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，A組繼續(xù)使用常規(guī)飼料和水喂養(yǎng)28 d，B至F組在試驗(yàn)期間的28 d內(nèi)灌胃給予誘石劑（1%乙二醇（EG）飲水＋隔天灌胃1 mL 0.5 μg/mL 1α-羥基維生素D3），誘導(dǎo)成為大鼠尿草酸鈣結(jié)石模型。具體分組如下：A組：空白對(duì)照組；B組：模型對(duì)照組；C組：陽性對(duì)照組（枸櫞酸鉀0.5 g/kg）；D組：低劑量組；E組：中劑量組；F組：高劑量組，具體情況見表1。

表1　各組大鼠在實(shí)驗(yàn)期間給藥情況

1.2.3觀察指標(biāo)及檢測方法：實(shí)驗(yàn)結(jié)束前一天用代謝籠收集尿液，測量24 h尿量并用pH計(jì)測尿pH，將收集的尿液裝入一次性尿瓶中，加入濃鹽酸防止尿液腐化（濃鹽酸能使尿液中的化學(xué)成分及細(xì)胞延遲破壞，加入的量為1 mL/dL）測24 h尿草酸（Ox）的分泌量（離子色譜法）。斷頸處死大鼠，下腔靜脈穿刺取血4 mL（抗凝），離心（3500 r/min）后，取上層血清測血BUN，Cr，P，Ca2+含量。切取雙腎，縱向剖開，取左側(cè)腎臟用10%中性福爾馬林固定，作常規(guī)HE石蠟切片和Von-Kossa's染色，偏光顯微鏡觀察腎組織草酸鈣結(jié)晶形態(tài)分布及腎組織的病理改變，原子吸收光譜儀進(jìn)行右腎組織Ca2+，Mg2+含量，尿總Ca2+，Mg2+含量測定。

1.2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS18統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)以（）表示，組間比較用單因素方差分析檢驗(yàn)各組間差異顯著性，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)意義。

2　結(jié) 果

2.1澤瀉+車前子不同劑量組對(duì)大鼠24 h尿量，尿pH的影響：各組的尿量和pH值見表示，B，C，D，E，F(xiàn)組和A組相比，尿量顯著增加（P＜0.05），而B，C，D，E，F(xiàn)組之間并沒有顯著性差異，表明造模是有意義的。各組尿液的pH值并沒有顯著性差異。見表2。

2.2澤瀉+車前子不同劑量組對(duì)大鼠血生化的影響：大鼠24 h后血清中BUN，Cr，Ca2+，P的含量見表3。B，C，D，E，F(xiàn)組和A組相比，BUN和Cr顯著增加（P＜0.05），C，D，E，F(xiàn)組和B組比較，BUN和Cr明顯降低（P＜0.05）；A，B，C，D，E，F(xiàn)組中的Ca2+和P3+沒有顯著性差異。

表2　澤瀉+車前子不同劑量組對(duì)大鼠24 h尿量、尿pH的影響（，n=10）

表2　澤瀉+車前子不同劑量組對(duì)大鼠24 h尿量、尿pH的影響（，n=10）

注：與A、B、C組相比1）P＜0.05

組別　　尿量(mL)　　尿pH A 15.00±2.60　6.46±0.10 B 40.50±3.221)　6.63±0.21 C 38.63±3.571)　6.81±0.29 D 37.93±4.631)　6.42±0.24 E 38.88±3.161)　6.44±0.20 F 39.25±3.021)　6.38±0.18

表3　澤瀉+車前子不同劑量組對(duì)大鼠血生化的影響（，n=10）

表3　澤瀉+車前子不同劑量組對(duì)大鼠血生化的影響（，n=10）

注：與A組相比1）P＜0.05；與B組相比2）P＜0.05

組別　BUN(mmol/L)　Cr(μmol/L)　Ca2+(mmol/L)　P3+(mmol/L) A　6.58±0.92　30.60±4.51　2.85±0.09　3.81±0.56 B　17.34±3.871)　54.04±6.351)　2.77±0.18　3.60±0.62 C　10.38±1.961)2)　45.26±5.911)2)　2.88±0.16　4.10±0.76 D　9.74±1.981)2)　39.66±4.041)2)　2.65±0.23　3.54±0.60 E　8.30±1.101)2)　38.61±4.241)2)　2.73±0.21　3.86±0.82 F　7.93±1.641)2)　35.17±6.281)2)　2.74±0.18　3.68±0.37

2.3澤瀉+車前子不同劑量組對(duì)大鼠24 h尿草酸分泌量、尿鈣、尿鎂含量及腎組織鈣、鎂含量的結(jié)果：大鼠24 h尿草酸分泌量、尿鈣、尿鎂含量及腎組織鈣、鎂含量的結(jié)果見表4，B，C，D，E，F(xiàn)組和A組相比，尿Ca2+，尿Ox和腎Ca2+顯著增加（P＜0.05），C，D，E，F(xiàn)組和B組比較，尿Ca2+，尿Ox和腎Ca2+顯著降低（P＜0.05）；各組中的尿鎂和腎鎂都沒有明顯變化。

2.4病理學(xué)分析：肉眼觀：A組大鼠腎臟表面光滑，呈鮮紅色，色澤一致。切開可見明顯的皮、髓質(zhì)分界，組織結(jié)構(gòu)緊湊清晰，觸之光滑。除A組大鼠外，其余各組腎臟均有不同程度腫大（B組大鼠尤為明顯），呈蒼白色，色澤暗淡。B組大鼠腎臟切開后可見皮髓質(zhì)分界模糊，皮質(zhì)變薄，結(jié)構(gòu)組織疏松，觸之有明顯的磨砂感。C，D，E，F(xiàn)組大鼠腎臟皮髓質(zhì)分界較清晰，組織結(jié)構(gòu)欠緊湊，觸之沒有明顯的磨砂感。各組大鼠腎臟標(biāo)本在偏光顯微鏡下所呈現(xiàn)的圖像，見圖1。（在NIKON偏光顯微鏡下觀看，放大倍數(shù)均為10倍，從左至右分別為A，B，C，D，E和F組大鼠鏡下觀）。

3　討 論

在泌尿系結(jié)石中，草酸鈣結(jié)石約占80%。尚旭明等[6]認(rèn)為，絕大多數(shù)結(jié)石含有草酸鈣成分，檢出率為98%。近年來，中藥輔助預(yù)防結(jié)石在尿排石過程中發(fā)揮著越來越巨大的作用，澤瀉、車前子作為傳統(tǒng)利水排石的配方之一，其排石機(jī)制正在被越來越多的專家學(xué)者所研究證實(shí)。自日本學(xué)者栗田[7]等首先報(bào)道澤瀉具有排石和體外抑制草酸鈣結(jié)晶的作用后，日本學(xué)者Utsunomiya等[8]對(duì)組成豬苓湯的多種單味中藥在體外對(duì)草酸鈣結(jié)晶的生長，而且抑制活性很強(qiáng)（晶體生長抑制指數(shù)達(dá)到80%以上）。Yamaguchi[9]和劉繼紅、尹春萍等[4]在EG和1α-羥基維生素D3誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性大鼠草酸鈣模型中發(fā)現(xiàn)澤瀉提取物能有效抑制草酸鈣結(jié)石的形成，尹春萍等[10]還發(fā)現(xiàn)在體外的研究實(shí)驗(yàn)證明澤瀉水提取液能有效抑制草酸鈣晶體的生長和自發(fā)性結(jié)晶，并隨著人工尿液的離子強(qiáng)度降低和pH值的升高，其抑制活性隨之增強(qiáng)，推測其作用機(jī)制可能是由于低離子強(qiáng)度和高pH值時(shí)，澤瀉水提取液吸附于草酸鈣晶體表面的能力增強(qiáng)，從而抑制晶體的聚集生長。邵紹韋等[5]在對(duì)單味中藥金錢草、石韋、車前子對(duì)大鼠腎結(jié)石腎保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究中證實(shí)車前子能預(yù)防腎結(jié)石、保護(hù)腎臟的作用，可能主要是通過增加尿中草酸鈣結(jié)晶的排泄，減少其在腎內(nèi)堆積而達(dá)到的。

圖1　鏡下觀：常規(guī)病理切片HE染色后，草酸鈣結(jié)晶在偏光顯微鏡下顯示為淡藍(lán)色晶體，不規(guī)則，折光性較強(qiáng)；Von-kossa’s染色后，草酸鈣晶體顯示為黑褐色。A組大鼠腎組織結(jié)構(gòu)緊密，可見正常的腎小體、近曲小管、遠(yuǎn)曲小管。B組大鼠腎組織中可見大量草酸鈣結(jié)晶，主要存在于腎皮質(zhì)、腎乳頭、腎小管內(nèi)；腎小體結(jié)構(gòu)破壞，腎小球完全消失；腎小管管腔明顯擴(kuò)張，多數(shù)管腔內(nèi)可見連接成片的草酸鈣結(jié)晶；在高倍鏡下觀察可見腎小管上皮細(xì)胞腫大、變性、壞死，管腔內(nèi)可見嗜伊紅染色樣壞死物質(zhì)及部分脫落上皮細(xì)胞，腎間質(zhì)可見慢性炎性細(xì)胞。C，D，E，F(xiàn)組大鼠腎組織中草酸鈣結(jié)晶明顯少于B組，腎組織結(jié)構(gòu)破壞較B組輕。D，E，F(xiàn)組大鼠腎組織中草酸鈣結(jié)晶僅少量存在于腎皮質(zhì)，腎小體結(jié)構(gòu)破壞少，腎小管管腔擴(kuò)張輕，高倍鏡下可見管腔內(nèi)未有明顯的壞死脫落物質(zhì)，腎間質(zhì)中慢性炎性細(xì)胞極為少見

本實(shí)驗(yàn)采用1%乙二醇（EG）飲水＋隔天灌胃0.5 μg/mL 1α-羥基維生素D31 mL[11]誘導(dǎo)大鼠腎草酸鈣結(jié)石形成。乙二醇水溶性強(qiáng)，吸收后迅速分布于血液及組織液中，并很快在肝臟經(jīng)乙醇脫水酶代謝為乙醇醛，再經(jīng)乙醛脫水酶代謝為乙醇酸，乙醇酸經(jīng)乙醇酸氧化酶氧化為乙醛酸，最后主要的代謝物為草酸；1α-羥基維生素D3可促進(jìn)小腸黏膜上皮和腎小管上皮細(xì)胞對(duì)鈣的吸收，促進(jìn)骨鈣的釋放。長期應(yīng)用可是大鼠的尿鈣濃度升高，臨床上許多結(jié)石患者對(duì)鈣的吸收主要是通過對(duì)維生素D3依賴機(jī)制，故1α-羥基維生素D3是草酸鈣結(jié)石形成的重要危險(xiǎn)因素[12]。增加腸內(nèi)的鈣吸收，使血鈣升高；草酸與鈣結(jié)合形成草酸鈣結(jié)晶在腎臟沉積，引起腎損傷，破壞腎功能。結(jié)晶長期沉積可堵塞腎小管，造成腎小管擴(kuò)張，小管上皮細(xì)胞腫大、變性、壞死、脫落，脫落的細(xì)胞形成新的結(jié)石中心，進(jìn)一步加重結(jié)石的沉積。本實(shí)驗(yàn)中，B組大鼠的血清BUN、Cr含量，24 h尿鈣分泌量，腎鈣含量顯著高于A組，在腎組織病理切片中同樣可以觀察到B組大鼠腎組織中草酸鈣結(jié)晶明顯多于A組。從實(shí)驗(yàn)所測結(jié)果看，澤瀉+車前子復(fù)方不同劑量組能明顯降低草酸鈣結(jié)石大鼠24 h尿鈣分泌量，腎組織鈣含量以及草酸鈣晶體在腎組織內(nèi)的沉積，一定程度上減輕了腎小管的擴(kuò)張，從而達(dá)到保護(hù)腎臟的作用。枸櫞酸鉀是已應(yīng)用于臨床的有效預(yù)防結(jié)石的藥物，研究表明枸櫞酸是一種很強(qiáng)的鈣離子螯合劑[13]，可降低鈣離子活性、濃度及其飽和度，從而減少鈣結(jié)晶的析出，阻斷結(jié)石的成核、生長和聚集過程，也可堿化尿液，具有利尿作用[14]同時(shí)枸櫞酸鉀可通過封閉晶體生長點(diǎn)，改變晶體表面電荷或晶體幾何形態(tài)，達(dá)到對(duì)草酸鈣晶體生長和聚焦的抑制作用。在本實(shí)驗(yàn)中設(shè)為陽性對(duì)照組。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，澤瀉+車前子復(fù)方不同劑量組能更好的減少草酸鈣結(jié)石的形成，改善腎功能作用更加明顯。

目前尚無學(xué)者對(duì)澤瀉+車前子復(fù)方水提取液抑制草酸鈣結(jié)晶進(jìn)行研究，有必要對(duì)這兩種傳統(tǒng)利尿通淋的中藥作進(jìn)一步更深入的研究，以期能發(fā)揮傳統(tǒng)中藥更大的功效。

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The Effect of Alisma and Plantago Compound on Experimental Urinary Calcium Oxalate Stones Formation in Rats

ZHAI Xin-yu, DING Yi, ZHAO Jian-hua
(Affiliated Shuguang Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China)

Objective To study the effect of alisma and plantago compound on experimental urinary calcium oxalate stone in rats and to confirm that it can inhibit the formation of calcium oxalate kidney stone and protect renal function. Methods Different alisma and plantago compound exteacts were administered through a stomach tube to rats of different groups with renal calcium oxalate stones induced by ethylene glycol(EG) and ammonium chloride(AC). Results The urolithiasis induced by thylene glycol(EG) and ammonium chloride(AC) could cause significant increase in the level of serum urea, serum creatinine, urine oxalate, urine Ca2+and renal Ca2+. The alisma and plantago compound reversed the changes in the levels of serum urea, serum creatinine, urine Ca2+and renal Ca2+. It also diminished the number and size of calcium oxalate crystal deposits and protected the kidneys from serious damage. Conclusion Alisma and Plantago compound can inhibit urinary calcium oxalate stone formation in rats and protect renal function.

Urinary stone; Calcium oxalate; Alisma; Plantago; Rat

R285.5

B

1671-8194（2016）31-0012-03