馬詩雨，李如波，羅宇家，呂孟妍，王漢志，王正?。?中國(guó)醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院法醫(yī)病理學(xué)研究室，遼寧沈陽000；2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)，遼寧沈陽000）

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CDK5的表達(dá)與腦損傷時(shí)間推斷的相關(guān)性研究進(jìn)展

馬詩雨1，2，李如波1，羅宇家1，2，呂孟妍1，2，王漢志1，王正印1
（1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院法醫(yī)病理學(xué)研究室，遼寧沈陽110001；2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)，遼寧沈陽110001）

摘要：細(xì)胞周期蛋白依賴激酶5（cyclin-dependent kinase 5，CDK5）是CDK家族中一類不直接調(diào)控細(xì)胞周期的蛋白。CDK5通過靶蛋白的磷酸化在神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)育、修復(fù)及退行性變等方面發(fā)揮著不可替代的作用。腦損傷是指暴力作用于頭部造成的腦組織器質(zhì)性損傷，由于損傷發(fā)生后機(jī)體啟動(dòng)應(yīng)激及修復(fù)機(jī)制，腦組織中變化的多種蛋白及酶類物質(zhì)可作為損傷時(shí)間判定的指標(biāo)。本文就CDK5的分布、活性機(jī)制、生理作用及其腦損傷研究與其作為腦損傷標(biāo)志物可能性的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

關(guān)鍵詞：法醫(yī)病理學(xué)；腦損傷；綜述[文獻(xiàn)類型]；細(xì)胞周期蛋白依賴激酶5；損傷時(shí)間

近年來，隨著分子生物學(xué)、免疫組織化學(xué)的快速發(fā)展，細(xì)胞周期素依賴蛋白激酶（cyclin-dependent kinase，CDK）的生物學(xué)特性研究逐漸被重視，但主要集中在與細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)的CDK1、CDK2等，對(duì)于不直接涉及細(xì)胞周期調(diào)控的CDK5及其抑制劑的研究相對(duì)匱乏，這些激酶在細(xì)胞周期中的作用機(jī)制尚未得到完全清晰的解讀[1]。在法醫(yī)病理學(xué)領(lǐng)域，腦損傷是一種常見的病理損傷，推斷其發(fā)生時(shí)間需要的標(biāo)志物多為腦中可檢出的活性蛋白、mRNA等。CDK5在哺乳動(dòng)物大腦中高表達(dá)，因此有希望成為法醫(yī)病理學(xué)研究中作為損傷時(shí)間推斷的標(biāo)志物，故有必要研究其生理、生化及調(diào)節(jié)作用。

1 CDK5的分布及作用機(jī)制

1.1 CDK5的分布

CDK5是一類不能直接調(diào)控細(xì)胞周期，但可以參與分裂后神經(jīng)元的靶蛋白磷酸化，以此對(duì)神經(jīng)元的遷移、突起的生長(zhǎng)和軸突模式進(jìn)行調(diào)節(jié)的激酶[2]。CDK5最初被認(rèn)為存在于分裂后、失去增殖能力且CDK家族常常不表達(dá)或無活性的神經(jīng)元中，后發(fā)現(xiàn)幾乎整個(gè)中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元都能檢測(cè)到CDK5轉(zhuǎn)錄體的存在[3]。近來多種實(shí)驗(yàn)表明，哺乳動(dòng)物腦組織中含有大量CDK5活性物質(zhì)，可能參與小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞等許多細(xì)胞的分化過程[4]，并在哺乳動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)外（腎、睪丸、卵巢、空腸、回腸和十二指腸）也有中等程度的表達(dá)[5]。

1.2 CDK5的產(chǎn)生與激活

單體形式存在的CDK5無激酶活性，需要通過磷酸化特定位點(diǎn)（thr14、thr15、Alb、Ser159等）與其特異性激活因子p35、p39及p35、p39含碳末端的蛋白水解產(chǎn)物p25和p29等結(jié)合，錨定在膜上并磷酸化膜性底物，參與平衡促存活和促凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)，以此發(fā)揮生物學(xué)活性[6]。

1.3 CDK5的生理作用

CDK5雖然不直接調(diào)控細(xì)胞周期，但其在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、退化過程中的作用是復(fù)雜多樣的，CDK5在機(jī)體各系統(tǒng)發(fā)揮著不同生理作用。CDK5在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育形成的整個(gè)過程（如神經(jīng)元的遷移和分化）中的作用是最早被發(fā)現(xiàn)的，特別是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞骨架形成中起重要作用。CDK5缺失會(huì)導(dǎo)致腦皮質(zhì)層狀細(xì)胞性結(jié)構(gòu)缺陷，剔除CDK5或p35-/p39-的小鼠近60%會(huì)死亡，而這種現(xiàn)象可以被植入p35啟動(dòng)子下游的CDK5基因轉(zhuǎn)染所逆轉(zhuǎn)[7]，提示活性CDK5在正常神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中有不可替代的作用。彭芳芳等[8]研究表明，在鼠E12~P14神經(jīng)組織發(fā)育、神經(jīng)元大量重構(gòu)、形成神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)過程中，CDK5蛋白及p35持續(xù)高表達(dá)，CDK5激酶活性顯現(xiàn)，可能通過磷酸化細(xì)胞骨架的方式引導(dǎo)神經(jīng)元形態(tài)學(xué)改變，調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育。

2 CDK5在腦損傷時(shí)間推斷中的應(yīng)用

多種實(shí)驗(yàn)表明，CDK5在腦組織及神經(jīng)系統(tǒng)損傷后存在著表達(dá)異常，提示其發(fā)揮多樣的生物學(xué)作用。了解CDK5的作用機(jī)制有助于從生物學(xué)層面驗(yàn)證其作為腦損傷推斷標(biāo)志物的合理性。

2.1基于CDK5的腦損傷研究

2.1.1急性CO中毒性遲發(fā)型腦病

研究[9]表明，急性一氧化碳（CO）中毒引發(fā)的遲發(fā)型腦病發(fā)病過程中，CDK5、p25、p35的表達(dá)均有明顯增高。該研究以morris水迷宮實(shí)驗(yàn)篩選出認(rèn)知功能正常的大鼠，并通過腹腔追加CO、行為學(xué)觀察、HbCO動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)等方式建立遲發(fā)型腦病大鼠模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在中毒后1周左右，CDK5的異常激活達(dá)到高峰。推測(cè)CDK5引發(fā)遲發(fā)型腦病的可能機(jī)制為急性CO中毒引發(fā)的缺氧性毒性刺激使p35自身表達(dá)上調(diào)，同時(shí)一部分裂解為能完全激活CDK5的p25。由于缺乏膜錨定信號(hào)，p25-CDK5復(fù)合物在細(xì)胞內(nèi)的定位改變，造成底物磷酸化失調(diào)，進(jìn)一步引發(fā)神經(jīng)元病理性損害。2.1.2神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病

神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病是以中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)特定神經(jīng)元的損傷丟失為特征的一組慢性進(jìn)展性疾病，近期研究[10]表明，此類神經(jīng)元損傷中存在CDK5的異常聚集。CDK5誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡主要通過細(xì)胞質(zhì)途徑導(dǎo)致細(xì)胞骨架崩解和細(xì)胞核途徑干擾促存活基因兩種不同方式[11]，CDK5酶活性異常引發(fā)的tau蛋白異常磷酸化使糖原合成酶激酶3β對(duì)tau蛋白的磷酸化易化，從而影響軸漿轉(zhuǎn)運(yùn)過程，促進(jìn)了神經(jīng)退行性病變的發(fā)生過程[10]。有研究[12-13]表明，CDK5在軸突導(dǎo)向和靶向性選擇方面起重要作用，p35突變會(huì)導(dǎo)致某些神經(jīng)軸突的成簇化和導(dǎo)向生長(zhǎng)，CDK5缺陷時(shí)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元還會(huì)出現(xiàn)染色質(zhì)融解、細(xì)胞氣球樣變、核偏位伴隨神經(jīng)絲堆積等一系列軸漿運(yùn)輸障礙現(xiàn)象。

2.1.3放射性損傷

在韓永清等[14]模擬大鼠放射性腦損傷模型的實(shí)驗(yàn)中，給予培養(yǎng)至12d的海馬神經(jīng)元30 Gy X射線的單次照射，用Western印跡法檢測(cè)CDK5的激活蛋白p35、p25的水平，并用DAPI染核方法檢測(cè)海馬神經(jīng)元凋亡情況，進(jìn)一步證實(shí)CDK5在腦損傷后存在表達(dá)的異常增加。DAPI顯示，30 Gy組在照射后24h核固縮百分比為（24.83±3.97）%，其對(duì)照組為（1.82±1.08）%；30 Gy+CDK5抑制劑組在照射后24 h核固縮百分比為（7.74±2.27）%；p35蛋白水平在照射后3.5 h和4 h分別比對(duì)照組升高（1.51±0.13）、（1.45±0.14）倍，p25蛋白水平在照射后6h比對(duì)照組升高（1.62±0.28）倍，各組結(jié)果差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由此實(shí)驗(yàn)可得，X線照射培養(yǎng)海馬神經(jīng)元后造成腦組織放射性損傷，p35、p25蛋白表達(dá)在一定時(shí)間內(nèi)隨損傷時(shí)間呈增加趨勢(shì)，且應(yīng)用CDK5抑制劑抑制CDK5活性可以減少神經(jīng)元的凋亡。

2.2 CDK5隨損傷時(shí)間變化的評(píng)估

李偉等[15]在三叉神經(jīng)痛大鼠模型中，已證實(shí)CDK5/p35對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)疼痛信號(hào)傳遞調(diào)節(jié)的作用，采用Western印跡、CDK5活性分析等方法檢驗(yàn)了Vc組織中CDK5及p35的活性時(shí)限（三叉神經(jīng)眶下支慢性壓迫性損傷第14天，CDK5活性為第1天的6倍）。上述研究提示，CDK5蛋白在腦損傷后周邊區(qū)隨時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)增多，但具體變化方式尚未明確證實(shí)，因此CDK5作為標(biāo)志物參與腦損傷時(shí)間推斷具有一定的先進(jìn)性。

大量研究總結(jié)出許多腦損傷時(shí)間推斷標(biāo)志物在腦挫傷后的分布有其規(guī)律性與特異性，如缺氧誘導(dǎo)因子-1α蛋白、神經(jīng)病靶酯酶與誘導(dǎo)型環(huán)氧合酶、Homer蛋白、載脂蛋白E mRNA、caspase-3在腦挫傷后的表達(dá)時(shí)限多為單峰[16-19]，腫瘤壞死因子α則為雙峰[20]。故而證實(shí)，CDK5在腦損傷后表達(dá)的變化曲線對(duì)其作為標(biāo)志物應(yīng)用有較高的可行意義。

3展　望

腦損傷可參考檢驗(yàn)的指標(biāo)眾多，實(shí)際工作中需要參考實(shí)際案例，根據(jù)鑒定需求、標(biāo)本組織部位、峰值出現(xiàn)的時(shí)間等指標(biāo)，選擇合適的蛋白或mRNA，采取合適的方式進(jìn)行分析推斷。CDK5正常情況下通過調(diào)節(jié)底物磷酸化水平調(diào)控神經(jīng)發(fā)育、促進(jìn)軸突生長(zhǎng)，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的過程中都有著積極的作用，因此推測(cè)其在腦損傷后也必然會(huì)有因損傷修復(fù)機(jī)制啟動(dòng)造成的表達(dá)異常。

為探討大鼠局灶性腦挫傷后腦中p35和p25表達(dá)變化的時(shí)間規(guī)律性，王漢志等[21]進(jìn)行了大鼠局灶性腦挫傷后p35及p25的表達(dá)變化試驗(yàn)。以手術(shù)方式建立大鼠局灶性腦挫傷模型，通過HE、免疫組織化學(xué)染色及Western印跡法等方法進(jìn)行損傷不同時(shí)間后損傷周邊區(qū)腦組織p35及p25的蛋白表達(dá)檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在局部腦挫傷后，p35蛋白隨挫傷時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)降低，于12h達(dá)到低峰，隨后表達(dá)增加，于5d基本恢復(fù)正常表達(dá)量，呈現(xiàn)單峰變化。而p25作為p35的蛋白降解產(chǎn)物，是一種較p35更為穩(wěn)定、具有更強(qiáng)激活CDK5能力的特異性激活因子，隨挫傷時(shí)間延長(zhǎng)呈現(xiàn)雙峰變化：挫傷后6 h出現(xiàn)第一個(gè)高峰，隨后降低至24 h達(dá)到低峰，5 d后出現(xiàn)第二次高峰，隨后逐漸降低恢復(fù)正常。p35與p25是CDK5的特異激活劑，這兩種蛋白表達(dá)呈現(xiàn)不同的規(guī)律性且有較好的時(shí)間相關(guān)性，為利用CDK5進(jìn)行腦挫傷時(shí)間推斷提供了有利的論據(jù)。

綜上，CDK5有望成為腦損傷時(shí)間推斷的檢測(cè)指標(biāo)，為法醫(yī)病理學(xué)鑒定提供一條新的思路。

參考文獻(xiàn)：

[1]劉文虎，常晉霞，王仕寶.細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶及其抑制劑構(gòu)效關(guān)系研究進(jìn)展[J].國(guó)際藥學(xué)研究雜志，2014，41（1）：37-44，56.

[2] Connell-Crowley L，Le Gall M，Vo DJ，et al. The cyclin-dependent kinase Cdk5 controls multiple aspects of axon patterning in vivo[J]. Curr Biol，2000，10（10）：599-602.

[3] Ino H，Ishizuka T，Chiba T，et al. Expression of CDK5（PSSALRE kinase），a neural cdc2-related protein kinase，in the mature and developing mouse central and peripheral nervous systems[J]. Brain Res，1994，661（1-2）：196-206.

[4] He X，Takahashi S，Suzuki H，et al. Hypomyelination phenotype caused by impaired differentiation of oligodendrocytes in Emx1-cre mediated Cdk5 conditional knockout mice[J]. Neurochem Res，2011，36（7）：1293-1303.

[5] Zheng YL，Li BS，Kanungo J，et al. Cdk5 Modulation of mitogen-activated protein kinase signaling regulates neuronal survival[J]. Mol Biol Cell，2007， 18（2）：404-413.

[6]陳潔，王中峰.細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶5在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和神經(jīng)退行性疾病中的作用[J].生理學(xué)報(bào)，2010，62（4）：295-308.

[7] Dhariwala FA，Rajadhyaksha MS. An unusual member of the Cdk family：Cdk5[J]. Cell Mol Neurobiol，2008，28（3）：351-369.

[8]彭芳芳，張百芳，章江洲，等.發(fā)育、成年及老年期大鼠腦中Cdk5，p35，p39的表達(dá)及Cdk5激酶活性變化[J].卒中與神經(jīng)疾病，2001，8（6）：350-353.

[9]李勇軍，劉強(qiáng)，趙春梅，等.急性CO中毒遲發(fā)腦病大鼠海馬中CDK5、p35及p25的表達(dá)[J].腦與神經(jīng)疾病雜志，2012，20（4）：241-244.

[10]張紅麗，劉亞玲. CDK-5在神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病的研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述，2012，18（19）：3166-3169.

[11] Rashidian J，Rousseaux MW，Venderova K，et al. Essential role of cytoplasmic cdk5 and Prx2 in multiple ischemic injury models，in vivo[J]. J Neurosci，2009，29（40）：12497-12505.

[12] Paglini G，Cáceres A. The role of the Cdk5--p35 kinase in neuronal development[J]. Eur J Biochem，2001，268（6）：1528-1533.

[13]范瑞文，張俊珍，劉佳，等.細(xì)胞周期素依賴蛋白激酶5 （CDK5）研究進(jìn)展[J].畜牧獸醫(yī)雜志，2010，29（6）：47-49.

[14]韓永清，孫愛民，劉鵲凌，等. X線照射原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元后p35、p25的表達(dá)及Cdk5激酶活性變化[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，29（3）：405-407，411.

[15]李偉，方敏，才曉慧.三叉神經(jīng)痛大鼠模型中Cdk5/p35的表達(dá)與活性[J].上海口腔醫(yī)學(xué)，2010，19（5）：545-548.

[16]劉玉利，田亞汀，田曉菲，等.大鼠腦挫傷后NTE與COX-2表達(dá)隨時(shí)間的變化[J].中國(guó)法醫(yī)學(xué)雜志，2014，29（1）：22-24，29.

[17]王福遠(yuǎn)，李如波，梁紅霞，等.大鼠局灶性腦挫傷后Homer蛋白表達(dá)變化[J].法醫(yī)學(xué)雜志，2011，27（6）：409-412.

[18] Iwata A，Browne KD，Chen XH，et al. Traumatic brain injury induces biphasic upregulation of ApoE and ApoJ protein in rats[J]. J Neurosci Res，2005，82（1）：103-114.

[19]蔡紅星，李周儒，程言博，等. Caspase 3和iNOS在人挫傷腦組織中的時(shí)序性表達(dá)[J].法醫(yī)學(xué)雜志，2009，25（4）：241-245.

[20]嚴(yán)治，孫小麗，胡玉蓮，等.大鼠腦挫傷后腦與其他器官組織中TNF-α表達(dá)的比較[J].法醫(yī)學(xué)雜志，2012，28（4）：261-264.

[21]王漢志，李如波，王正印，等.大鼠局灶性腦挫傷后p35 及p25的表達(dá)變化[J].法醫(yī)學(xué)雜志，2015，31（2）：93-96.

（本文編輯：張建華）

·經(jīng)驗(yàn)交流·

Progress on Correlation between the Expression of CDK5 and Brain Injury Time

MA Shi-yu1,2, LI Ru-bo1, LUO Yu-jia2, Lü Meng-yan2, WANG Han-zhi1, WANG Zheng-yin1
（1. Department of Forensic Pathology, School of Forensic Medicine, China Medical University, Shenyang 110001, China; 2. Specialty of Clinical Medicine, China Medical University, Shenyang 110001, China）

Abstract：Cyclin-dependent kinase 5（CDK5）is a member of cyclin-dependent kinase family, which does not directly regulate cell cycle. Through phosphorylation of target protein, CDK5 plays an irreplaceable role in the development, reparation and degeneration of neurons. Brain injury refers to the organic injury of brain tissue caused by external force hit on the head. Owing to the stress and repair system activated by our body itself after injury, various proteins and enzymes of the brain tissues are changed quantitatively, which can be used as indicators for estimating the time of injury. This review summarizes the progress on the distribution, the activity mechanism and the physiological effects of CDK5 after brain injury and its corresponding potential served as a marker for brain injury determination.

Key words：forensic pathology; brain injuries; review [publication type]; cyclin-dependent kinase 5; injury time

收稿日期：（2014-08-20）

通信作者：李如波，男，博士，教授，主要從事法醫(yī)病理學(xué)教學(xué)、研究及鑒定；E-mail：rbli@mail.cmu.edu.cn

作者簡(jiǎn)介：馬詩雨（1993—），女，碩士研究生，主要從事臨床醫(yī)學(xué)、法醫(yī)病理學(xué)研究；E-mail：magic23@yeah.net

基金項(xiàng)目：遼寧省教育廳科學(xué)研究一般項(xiàng)目（L2013317）；遼寧省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2014021027）

文章編號(hào)：1004-5619（2016）01-0058-03

中圖分類號(hào)：DF795.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

doi：10.3969/j.issn.1004-5619.2016.01.013