林 琳, 李貞景, 陳勉華, 高雅娟, 武慧佳, 王昌祿

(天津科技大學(xué) 食品工程與生物技術(shù)學(xué)院/食品營養(yǎng)與安全教育部重點實驗室， 天津 300457)

4種培養(yǎng)基對紅曲霉M1莫納可林K產(chǎn)量影響及基因差異表達分析

林 琳, 李貞景, 陳勉華, 高雅娟, 武慧佳, 王昌祿*

(天津科技大學(xué) 食品工程與生物技術(shù)學(xué)院/食品營養(yǎng)與安全教育部重點實驗室， 天津 300457)

莫納可林K是紅曲霉重要的次級代謝產(chǎn)物之一。研究了4種培養(yǎng)基質(zhì)對紅曲霉M1莫納可林K產(chǎn)量的影響，并利用RT-qPCR的方法，對莫納可林K相關(guān)基因簇mRNA水平的差異表達進行測定分析。結(jié)果表明，蕎麥培養(yǎng)基中莫納可林K的產(chǎn)量最高(8.49 mg/L)，其次為糙米(莫納可林K產(chǎn)量7.12 mg/L)、燕麥(莫納可林K產(chǎn)量4.77 mg/L)、大米(莫納可林K產(chǎn)量2.11 mg/L)。蕎麥培養(yǎng)基利于紅曲霉莫納可林K產(chǎn)生。基因差異表達研究發(fā)現(xiàn)，除MKB與MKC基因外，其他基因的表達量均與莫納可林K產(chǎn)量呈正相關(guān)；不同培養(yǎng)基通過刺激紅曲霉基因表達從而影響其次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)生。

紅曲霉; 莫納可林K; 培養(yǎng)基; RT-qPCR

紅曲霉(Monascussp.)，別名紅曲、赤曲、紅糟、紅大米等，長期以來被認(rèn)為是一種促進消化和血液循環(huán)的民間藥物。李時珍認(rèn)為紅曲米 “味甜、性甘”，能促進“消化和血液循環(huán)”，并且能健脾、燥胃[1]。在中國，紅曲霉的種類較為豐富，其生產(chǎn)發(fā)酵成本也較低，因而對于紅曲霉的研究也越來越深入[2]。紅曲霉中的紅曲色素、γ-氨基丁酸、麥角甾醇和莫納可林K等次級代謝產(chǎn)物具有抗炎、降血壓、抗骨質(zhì)疏松和降血脂等生理活性，因而越來越受到人們的重視[3-6]。

莫納可林K(Monacolin K，MK)能競爭性抑制膽固醇合成限速酶(HMG-CoA還原酶)的活性，并能有效地刺激細(xì)胞表面低密度脂蛋白受體(LDL受體)形成，從而使體內(nèi)低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)濃度降低；相反，MK能促進高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)的合成，減少高血壓、冠心病的發(fā)病幾率[7-8]。目前，MK已作為治療高血脂、高膽固醇等疾病的臨床藥物[9]，研發(fā)含有MK的功能性食品更是受到推崇[10-12]，因此提高MK產(chǎn)量對于紅曲霉功能性食品的開發(fā)具有重要意義。改變發(fā)酵條件提高MK產(chǎn)量是一種高效、便利，具有較強可行性的方法[13]。

紅曲霉MK分子層面的相關(guān)研究起步較晚，Chen等[14]利用探針技術(shù)從叢毛紅曲霉(M.pilosus)中篩選出MK相關(guān)基因簇MKA-MKI9個基因，開啟了紅曲霉MK基因水平的相關(guān)研究。關(guān)于發(fā)酵條件對紅曲霉MK產(chǎn)量影響的分子機理研究較少，尤其通過不同培養(yǎng)基質(zhì)對MK產(chǎn)量影響的分子水平研究更是鮮見報道。

本實驗利用不同種類的培養(yǎng)基對紅曲霉M1中MK產(chǎn)量的影響，同時結(jié)合RT-qPCR對不同培養(yǎng)基菌絲體MK相關(guān)基因簇表達量進行研究，從分子層面探求培養(yǎng)基對MK產(chǎn)量影響的原因，希望為MK相關(guān)基因簇的進一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗菌種

紅曲霉M1，由天津科技大學(xué)生物技術(shù)實驗室保存。

1.1.2 實驗原料

大麥芽、大米、糙米、燕麥、蕎麥，均由遼寧巨龍有機食品有限公司購入；植物RNA提取試劑盒，OMEGA公司；HiFi- Script cDNA 第一鏈合成試劑盒，康為世紀(jì)生物科技有限公司；熒光定量Mix為SYBR Premix Ex Taq Ⅱ，Takara公司。

1.1.3 主要設(shè)備

1260型高效液相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司；LRH- 250- GⅡ型培養(yǎng)箱，廣東省醫(yī)療器械廠；KCL- 2000W型恒溫恒濕培養(yǎng)箱，日本東京理化器械株氏會社；熒光定量PCR儀，美國安捷倫科技有限公司。

1.2 菌種活化

活化培養(yǎng)基(麥芽汁培養(yǎng)基)：將一定量的大麥芽粉碎，加入4倍的水，55～60 ℃保溫糖化3～4 h，濾去殘渣，煮沸、過濾，加水稀釋至糖度為12°Brix，加入3%瓊脂，121 ℃滅菌20 min。

保藏菌種接種于斜面培養(yǎng)基，30 ℃恒溫箱培養(yǎng)5～7 d，活化菌株。

1.3 液態(tài)種子培養(yǎng)

種子液培養(yǎng)基：葡萄糖 60 g/L，蛋白胨 20 g/L，NaNO310 g/L， MgSO4·7H2O 5 g/L，KH2PO410 g/L，水。分裝至三角瓶中(100 mL培養(yǎng)液/250 mL 三角瓶)，121 ℃滅菌20 min。

將活化后的紅曲霉菌挑入種子液培養(yǎng)基，搖床培養(yǎng)48 h，用紗布濾去菌絲體，得孢子懸浮液。

1.4 4種培養(yǎng)基質(zhì)對MK產(chǎn)量的影響實驗

選取大米、糙米、蕎麥、燕麥作為培養(yǎng)基，用水浸泡過夜，瀝干水分，每瓶裝28 g濕米和12 mL水。121 ℃滅菌20 min。冷卻至室溫后，將孢子懸液以10%接種量分別接種于培養(yǎng)基上，發(fā)酵培養(yǎng)。30 ℃恒溫培養(yǎng)10 d，之后轉(zhuǎn)入25 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，每組3個平行，從第10天開始，隔4天取樣進行檢測。

1.5 發(fā)酵產(chǎn)物中MK的檢測

1.5.1 樣品處理

在無菌操作臺中使用無菌打孔器取樣，50 ℃烘干，研磨成粉末，稱取0.50 g，用10 mL 75%乙醇分3次進行萃取。每次超聲30 min，3 500 r/min離心15 min，上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，待測。

1.5.2 MK標(biāo)準(zhǔn)品的制備及檢測

配制質(zhì)量濃度分別為5.00，10.00，50.00，100.00，200.00，400.00 mg/L的MK標(biāo)準(zhǔn)溶液。用高效液相色譜法(HPLC法)測定MK標(biāo)準(zhǔn)品，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5.3 MK檢測條件

用HPLC進行檢測，檢測條件為：二極管陣列檢測器，檢測波長為237 nm；Agilent X DB- C18型色譜柱(5 m，4.6 mm×150 mm)，進樣體積為20 μL，柱溫為25 ℃，流速1 mL/min；流動相的乙腈與水之比為60∶40(在水相中加入0.1%的色譜甲酸)。

1.6 4種培養(yǎng)基菌絲體MK相關(guān)基因簇表達量測定

將MK產(chǎn)量最高時的4種培養(yǎng)基中紅曲霉菌絲體剝落，每種培養(yǎng)基菌體稱取100 mg，分別提取菌絲體RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用相對熒光定量PCR(RT-qPCR)對4種培養(yǎng)基中紅曲霉菌絲體MK相關(guān)基因簇的表達量進行測定。RT-qPCR反應(yīng)體系為：11 μL水，12 μL SYBR Ⅱ Mix，1 μL cDNA，上下游引物各0.5 μL，總體系25 μL，每個樣品做3個平行。以GenBank公布的紅曲霉MK 相關(guān)基因簇MKA-MKI基因序列(GenBank accession No.DQ176595.1)以及內(nèi)參基因β-actin(GenBank accession No.AJ417880.1)為參照，通過Primer 5設(shè)計引物，引物序列如表1。相對熒光定量PCR反應(yīng)程序為95 ℃，30 s，1個循環(huán)；95 ℃，5 s，57 ℃，20 s，72 ℃，15 s，40個循環(huán)，熔解曲線分析(95 ℃，15 s,60℃，30 s,60～95 ℃，軟件采集熔解峰)。

2 結(jié)果與分析

2.1 MK標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度和相應(yīng)的峰面積計算回歸方程和相關(guān)系數(shù)，得到MK標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為y=63.48x，相關(guān)系數(shù)R2=0.996。

2.2 4種培養(yǎng)基質(zhì)對MK產(chǎn)量的影響

按照1.4中的方法，研究不同培養(yǎng)基質(zhì)對MK產(chǎn)量的影響，其結(jié)果如圖1。

表1 RT-qPCR 所用引物

圖1 4種培養(yǎng)基質(zhì)對MK產(chǎn)量的影響Fig.1 Effects of four kinds of natural solid medium on MK production

功能性紅曲的固態(tài)發(fā)酵時間較長，發(fā)酵周期一般為30 d，這與產(chǎn)MK的功能性紅曲霉的生產(chǎn)特性有關(guān)[15]。由圖1可知，在不同的培養(yǎng)基質(zhì)中，MK的產(chǎn)量均呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢；不同培養(yǎng)基中MK產(chǎn)量達到峰值的時間不同，但產(chǎn)量最高值均在18～22 d出現(xiàn)。蕎麥培養(yǎng)基中在MK產(chǎn)量最短時間內(nèi)達到峰值，之后MK的含量迅速下降，Bizukojc等[16]認(rèn)為MK含量突然下降是由于培養(yǎng)基pH值降低導(dǎo)致MK測定值減小。

培養(yǎng)基的組成對于微生物的生長和代謝有關(guān)鍵作用。不同培養(yǎng)基質(zhì)對紅曲霉產(chǎn)MK有顯著影響。圖1顯示，4種發(fā)酵基質(zhì)中MK的峰值濃度排序由高到低為：蕎麥培養(yǎng)基中(MK質(zhì)量濃度8.94 mg/L)、糙米培養(yǎng)基中(MK質(zhì)量濃度7.12 mg/L )、燕麥培養(yǎng)基中(MK質(zhì)量濃度4.77 mg/L)、大米培養(yǎng)基中(MK質(zhì)量濃度2.11 mg/L)。以蕎麥為培養(yǎng)基時， MK產(chǎn)量最高，約為大米培養(yǎng)基中的4倍。由此可知，培養(yǎng)基種類的不同對產(chǎn)物的含量影響顯著，這與高紅等[17]的實驗結(jié)果相一致。蕎麥培養(yǎng)基使紅曲霉MK產(chǎn)量增加，可能是由于蕎麥的營養(yǎng)成分豐富[7],且培養(yǎng)基顆粒松散，溶氧量高，刺激紅曲霉中某些基因的表達，從而影響其次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生[18]。圖2為蕎麥培養(yǎng)中紅曲霉M1產(chǎn)MK的高效液相色譜圖。其出峰時間為8.83 min，分離度及峰型良好。

圖2 蕎麥基質(zhì)中紅曲霉M1產(chǎn)MK的高效液相色譜Fig.2 HPLC analysis of Monacolin K in Monascus M1 fermented on buckwheat

2.3 4種培養(yǎng)基質(zhì)紅曲霉MK相關(guān)基因簇表達量差異

不同培養(yǎng)基紅曲霉MK相關(guān)基因簇表達量差異，見圖3。由圖3可知，糙米、蕎麥、燕麥培養(yǎng)基中的紅曲霉MK基因簇中，除MKB與MKC基因外，其他基因的表達量均比大米組菌絲體的表達量高，這與圖1中不同培養(yǎng)基對紅曲霉MK產(chǎn)量影響的情況呈正相關(guān)。其中，蕎麥培養(yǎng)基中的紅曲霉MKF基因的表達量是大米培養(yǎng)基中的2.09倍，MKF基因?qū)?yīng)編碼轉(zhuǎn)酯酶，二酮化合物在轉(zhuǎn)脂酶的作用下，甲基丁酰CoA通過酯鍵連接到九酮化合物(Monacolin J)上，最終生成MK，這可能是導(dǎo)致蕎麥培養(yǎng)基中MK產(chǎn)量高的一個原因。培養(yǎng)基通過刺激紅曲霉MK相關(guān)基因簇的表達而影響紅曲霉MK代謝產(chǎn)量。MK生物合成途徑如圖4[19](箭頭右側(cè)代表與該步驟反應(yīng)相關(guān)酶的編碼基因)。

圖3 4種培養(yǎng)基紅曲霉MK相關(guān)基因簇表達量差異Fig.3 Expression of Monacolin K biosysnsis genes in four kinds of natural solid medium

圖4 MK生物合成途徑Fig.4 Biosynthetic pathway of Monacolin K

3 結(jié) 論

研究了4種培養(yǎng)基質(zhì)對紅曲霉M1產(chǎn)MK的影響，結(jié)果表明，培養(yǎng)基種類的選擇對MK的生成有顯著影響，其中紅曲霉M1在蕎麥培養(yǎng)基上培養(yǎng)時，MK產(chǎn)量最高，質(zhì)量濃度達到8.94 mg/L。其次為糙米培養(yǎng)基(MK產(chǎn)量7.12 mg/L)、燕麥培養(yǎng)基(MK產(chǎn)量4.77 mg/L)和大米培養(yǎng)基(MK產(chǎn)量2.11 mg/L)。在紅曲霉的發(fā)酵生產(chǎn)中，大多數(shù)都是使用大米作為培養(yǎng)基，然而，該實驗結(jié)果表明，蕎麥培養(yǎng)基中MK產(chǎn)量約為大米培養(yǎng)基中的4倍。對于紅曲霉MK的生產(chǎn)，蕎麥作為培養(yǎng)基比大米更有優(yōu)勢。推測蕎麥培養(yǎng)基使紅曲霉MK產(chǎn)量增加，可能是由于蕎麥的營養(yǎng)成分豐富，且培養(yǎng)基顆粒松散、溶氧量高，刺激紅曲霉中某些基因的表達，從而影響其次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生。

本實驗通過RT-qPCR，從mRNA水平探求紅曲霉MK相關(guān)基因簇表達量的變化，結(jié)合MK生物合成途徑，從分子水平以及代謝途徑推測MK產(chǎn)量增高的代謝機理。結(jié)果表明，除MKB與MKC基因外，紅曲霉MK相關(guān)基因簇mRNA水平的基因表達量與MK產(chǎn)量呈正相關(guān)；不同培養(yǎng)基通過刺激紅曲霉MK相關(guān)基因簇的表達從而影響MK產(chǎn)量；MKB與MKC基因的表達量與MK產(chǎn)量呈負(fù)相關(guān)。推測可能是由于MKB與MKC對應(yīng)編碼的二酮合成酶及P450單氧酶受到甲基丁酰CoA與九酮化合物(Monacolin J)的反饋抑制，而高濃度的甲基丁酰CoA與九酮化合物(Monacolin J)可以促進MKF表達，大量生成轉(zhuǎn)酯酶，促進MK產(chǎn)生。MK合成相關(guān)基因簇中每個基因的具體功能仍需要通過基因敲除或過表達技術(shù)進一步深入研究。

[1] LIN Y L，WANG T H，LEE M H，et al. Biologically active components and nutraceuticals in theMonascus-fermented rice[J]．Appl Microbiol Biotechnol，2008，77(5)： 965-973.

[2] RAJH S J，KREFT S，STRUKELJ B，et al．Comparison of CE and HPLC methods for determining Monacolin K and its oxidation products after exposure to an oxidative atmosphere[J]．Croatica Chemica Acta，2003，76(3)：263-268．

[3] AKIHISA T，TOKUDA H，YASUKAWA K，et al．Azaphilones，furanoisophthalides，and amino acids from the extracts ofMonascuspilosus-fermented rice(red-mold rice)and their chemopreventive effects [J]．Journal of agricultural and food chemistry，2005，53(3)：562-565．

[4] LI Xuemei，SHEN Xinghai，DUAN Zhenwen，et al．Advances on the pharmacological effects of red yeast rice[J]．Chinese Journal of Natural Medicines，2011，9(3)：161-166．

[5] 王婧，王昌祿，陳勉華，等．紅曲霉 M1 發(fā)酵糙米代謝產(chǎn)物抗 S180 細(xì)胞增殖效應(yīng)研究[J]．食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報，2013，31(2)31-36． WANG J, WANG C L, CHEN M H, et al. Studies on metabolites ofMonascusM1 fermented brown rice and antiproliferation effect on S180 ascitic tumor cell[J].Journal of Food Science and Technology,2013,31(2):31-36.

[6] 侯敏，周端頊，王艷新，等．紅曲霉的研究進展[J]．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42(11)：3382-3384. HOU M, ZHOU D X, WANG Y X, et al. Research progress ofMonascuspurpureusWent.[J]. Journal of Anhui Agricultural Sciences,2014,42(11):3382-3384.

[7] 蘇萬春．紅曲霉蕎麥的固態(tài)發(fā)酵及其產(chǎn)物分析[D]．天津：天津科技大學(xué)，2004.

[8] 劉愛英，孫嘉龍，鄒曉，等．提高紅曲霉發(fā)酵產(chǎn)品 Monacolin K 含量的研究[J]．貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2007，35(6)：5-7． LIU A Y, SUN J L, ZOU X, et al. Study on improving content of monacolin K inMonascuspurpureus[J].Guizhou Agricultural Sciences,2007,35(6):5-7.

[9] 李晶，馬貴民，馮曉明，等．紅曲霉發(fā)酵產(chǎn)物Monacolin K的研究進展與應(yīng)用[J]．食品工程，2014(2)：9-11． LI J, MA G M, FENG X M, et al. Research progress and application of Monacolin K byMonascus[J].Food Engineering,2014 (2):9-11.

[10] 崔海燕，王婧，陳勉華，等． 紅曲糙米功能性餅干的開發(fā)[J]．食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報，2014，32(6)：46-53． CUI H Y, WANG J, CHEN M H, et al. Study on production process ofMonascusfermented brown rice biscuit[J].Journal of Food Science and Technology,2014,32(6):46-53.

[11] AJDARI Z， EBRAHIMPOUR A， MANAN M A，et al．A statistical modeling study by response methodology and artificial neural networks on medium optimization forMonascuspurpureusFTC5391 sporulation[J]．Minerva Biotecnologica，2012，24(3)：71-81．

[12] JEPPESEN J， HEIN H O， SUADICANI P，et al．Relation of high TG-low HDL cholesterol and LDL cholesterol to the incidence of ischemic heart disease： an 8-year follow-up in the copenhagen male study[J]．Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology，1997，17(6)：1114-1120．

[13] SINGGIHA M，SARASWATYB V，RATNANINGRUM D，et al．The influence of temperature and ethanol concentration in Monacolin K extraction fromMonascusfermented rice[J]．Procedia Chemistry，2014(9)：242-247．

[14] CHEN Y P，TSENG C P，LIAW L L，et al．Cloning and characterization of Monacolin K biosynthetic gene cluster fromMonascuspilosus[J]．Journal of Agricultural and Food Chemistry，2008，56(14)：5639-5646．

[15] 陸磊，李耀，劉秀河．功能紅曲固態(tài)發(fā)酵工藝對莫納可林K形態(tài)影響的研究[J]．山東食品發(fā)酵，2014(2)：3-6． LU L, LI Y, LIU X H. Different solid-state fermentation technology of functional red yeast rice has an effect on the morphological change of Monacolin K[J]. Shandong Food Ferment, 2014(2)：3-6．

[16] BIZUKOJC M，PAWLAK M，BORUTA T，et al． Effect of pH on biosynthesis of lovastatin and other secondary metabolites byAspergillusterreusATCC 20542[J]．Journal of Biotechnology，2012(162)：253-261．

[17] 高紅，彭月菊，李貞景，等．八種稻米基質(zhì)對紅曲重要代謝產(chǎn)物的影響[J]．中國食品添加劑，2015(4)：134-142． GAO H, PENG Y J, LI Z J, et al. Effects of eight kinds of rice on the important metabolites inMonascus-fermented production[J].China Food Additives,2015 (4):137-142.

[18] 王靜. 環(huán)境因子對紅曲霉菌產(chǎn)桔霉素的影響[D]. 天津: 天津科技大學(xué)，2011.

[19] MANZONI M，ROLLINI M．Biosynthesis and biotechnological production of statins by filamentous fungi and application of these cholesterol-lowering drugs[J]．Applied Microbiology and Biotechnology，2002，58(5)：555-564．

Effect of Four Kind of Medium on Monascus M1 with Monacolin K Production and Real-time Quantitative Analysis

LIN Lin, LI Zhenjing, CHEN Mianhua, GAO Yajuan WU Huijia, WANG Changlu*

(CollegeofFoodEngineeringandBiologicalTechnology/KeyLaboratoryofFoodNutritionandSafety,MinistryofEducation,TianjinUniversityofScienceandTechnology,Tianjin300457,China)

Monacolin K is one of the important secondary metabolites ofMonascussp. The influence of Monacolin K production forMonascusM1 on four kinds of fermentation substrate were studied．And the mRNA expression of Monacolin K biosynthesis gene cluster was measured by RT-qPCR. The result showed that the concentration of Monacolin K was the highest(8.49 mg/L)cultured by buckwheat while the concentration of Monacolin K was 7.12, 4.77, 2.11 mg/L cultured by brown rice, oats, and rice. And there was positive correlation between the expression genes related to MK and the MK production, except forMKBandMKC. The different kinds of culture medium could influence the secondary metabolites production by stimulating the gene clusters.

Monascussp.; Monacolin K; culture medium; RT-qPCR

葉紅波)

10.3969/j.issn.2095-6002.2016.05.006

2095-6002(2016)05-0043-05

林琳,李貞景,陳勉華,等. 4種培養(yǎng)基對紅曲霉M1莫納可林K產(chǎn)量影響及基因差異表達分析[J]. 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報，2016,34(5):43-47. LIN Lin, LI Zhenjing, CHEN Mianhua, et al. Effect of four kind of medium onMonascusM1 with Monacolin K production and real-time quantitative analysis[J]. Journal of Food Science and Technology, 2016,34(5):43-47.

2015-12-09

國家自然科學(xué)基金資助項目(31171729)。

林 琳，女，博士研究生，研究方向為食品科學(xué)；

*王昌祿，男，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事食品生物技術(shù)方面的研究。通信作者。

TS201.3; Q815

A