朱媛媛，趙 明, 2*，歐陽臻，蔡建明，張 成，周文菊，劉江弟，楊 倩，王琳瑋

(1. 江蘇大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2. 江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

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響應(yīng)面法優(yōu)化合萌總黃酮提取工藝

朱媛媛1，趙 明1, 2*，歐陽臻1，蔡建明1，張 成1，周文菊1，劉江弟1，楊 倩1，王琳瑋1

(1. 江蘇大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2. 江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

目的：利用響應(yīng)面法優(yōu)化合萌中總黃酮的提取工藝條件。方法：通過單因素試驗(yàn)分別考察提取時間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、液固比、提取溫度及提取次數(shù)對合萌總黃酮得率的影響，并選取提取時間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、液固比、提取溫度為影響因子，應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝。結(jié)果：合萌總黃酮的最佳提取條件為：提取時間60 min，乙醇濃度65%，液固比(g∶mL)25∶1，提取溫度90 ℃，在此條件下，合萌總黃酮得率為4.08 mg/g，接近模型預(yù)測值4.11 mg/g。結(jié)論：響應(yīng)面法在一定程度上可以提高合萌總黃酮得率，表明響應(yīng)面法用于合萌總黃酮提取工藝的優(yōu)化具有可行性。

合萌；總黃酮；響應(yīng)面法

合萌為豆科蝶形花亞科合萌屬植物合萌(AeschynomeneindicaL.)的干燥全草，又名田皂角，俗稱水槐。味甘、苦，性微寒，歸肺、胃經(jīng)。全草入藥，具有清熱利濕，祛風(fēng)明目，通乳等功效。能治水腫腹脹、腫毒、濕疹、膽囊炎、尿道感染或結(jié)石、腎炎水腫等[1]。分析研究表明，黃酮類化合物具有抗菌、抗氧化自由基活性、保肝作用、抗骨質(zhì)疏松作用、抗腫瘤等多種藥理作用[2-6]，但合萌中黃酮類化合物的研究尚未有文獻(xiàn)報道。本實(shí)驗(yàn)首先采用單因素試驗(yàn)分析提取時間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、液固比、提取溫度及提取次數(shù)對合萌總黃酮得率的影響，并選取提取時間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、液固比、提取溫度4個因素為影響因子，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)建立數(shù)學(xué)模型，以合萌總黃酮得率為響應(yīng)值，采用Design Expert 軟件進(jìn)行數(shù)值分析，得出最優(yōu)提取工藝條件，為合萌總黃酮的進(jìn)一步開發(fā)和研究提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)儀器和材料

1.1 儀器與設(shè)備

SHB-111循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；HHS-1恒溫水浴鍋，上海浦東躍新科學(xué)儀器廠；AE240分析天平，上海梅特勒-托利多儀器有限司；1810-B型自動雙重純水蒸餾器，上海申立玻璃儀器公司；DHG-9240A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海恒科學(xué)儀器有限公司；UV-2102PCS型紫外可見分光光度計(jì)，尤尼柯(上海)分析儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，瑞士BUCHI公司；H66 MC超聲清洗機(jī)，無錫超聲儀器廠。

1.2 藥品與試劑

合萌(采收于江蘇省丹陽市導(dǎo)墅鎮(zhèn)，經(jīng)歐陽臻教授鑒定為合萌AeschynomeneindicaL.)；蘆丁對照品，中國食品藥品檢定研究院，批號：100080-200707；三氯化鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、乙醇等試劑均為分析純，購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蒸餾水為實(shí)驗(yàn)室自制。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 對照品溶液的制備

精密稱取干燥至恒重的蘆丁對照品15.2 mg，置25 mL容量瓶中，加70%乙醇使之溶解，并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品母液，備用。

2.1.2 供試品溶液的制備

干燥的合萌全草經(jīng)粉碎，過20目篩，備用。精密稱取合萌干燥粉末2.0 g，置于100 mL圓底燒瓶中，按照一定的提取溫度、提取時間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、液固比、提取次數(shù)進(jìn)行回流提取，趁熱抽濾，合并提取液，將濾液濃縮后，轉(zhuǎn)移至50 mL的容量瓶，定容，搖勻，作為供試品溶液，備用。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密量取蘆丁對照品溶液6份(0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL)，分別加入25 mL容量瓶中，加70%乙醇至6 mL，加入5% 亞硝酸鈉1 mL，搖勻，放置6 min，再加10% 硝酸鋁1 mL，搖勻，放置6 min，再加1 mol/L 氫氧化鈉10 mL，70%乙醇定容至刻度，搖勻，放置15 min，于510 nm波長下測吸光度。以對照品溶液濃度為橫坐標(biāo)x，吸光度測定值為縱坐標(biāo)y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示。用最小二乘法計(jì)算得到回歸方程為y=0.0129x-0.0373，r=0.9996。在12.16～60.80 μg/mL范圍內(nèi)蘆丁對照品濃度與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 合萌總黃酮含量測定

精密量取供試品溶液5.0 mL，根據(jù)亞硝酸鈉-硝酸鋁法，即“2.2”項(xiàng)下的方法測定吸光度，計(jì)算合萌總黃酮含量，按以下公式計(jì)算合萌總黃酮得率。

式中：P 為合萌總黃酮的得率(mg/g)，C為從回歸方程計(jì)算求得樣品溶液的濃度(μg/mL)，V1為樣品溶液定容體積(mL)，V2為提取液定容體積(mL)，V3為取樣溶液體積(mL)，M為合萌粉末質(zhì)量(g)。

2.4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.4.1 提取溫度對合萌總黃酮得率的影響

以合萌總黃酮得率為指標(biāo)，在固定提取時間60min，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，液固比20∶1，提取次數(shù)2次的條件下，考察不同提取溫度(60、70、80、90、100 ℃)對合萌總黃酮得率的影響?？傸S酮得率隨提取溫度變化結(jié)果如圖2所示。

結(jié)果表明，當(dāng)溫度低于80 ℃時， 隨溫度的上升，總黃酮得率變化不大，當(dāng)溫度高于80℃時，隨溫度的上升總黃酮得率顯著升高，并在90 ℃時達(dá)到最高值，但當(dāng)溫度高于90 ℃時，總黃酮得率反而下降，這可能是由于溫度過高導(dǎo)致可溶性蛋白變性，影響細(xì)胞的破裂，導(dǎo)致總黃酮溶出減少，從而降低了合萌總黃酮得率[7]。因而確定最佳提取溫度為90 ℃。

圖2 提取溫度對合萌總黃酮得率的影響

2.4.2 提取時間對合萌總黃酮得率的影響

以合萌總黃酮得率為指標(biāo)，在固定提取溫度90 ℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，液固比20∶1，提取次數(shù)2次的條件下，考察不同提取時間(30、45、60、75、90min)對合萌總黃酮得率的影響?？傸S酮得率隨提取時間變化結(jié)果如圖3所示。

結(jié)果表明：隨時間增加，合萌總黃酮提取率先上升后下降，60min時達(dá)到最高點(diǎn)，提取時間過長或過短時，合萌總黃酮得率均較低。這可能是由于提取時間過短時，合萌總黃酮提取不充分，而時間過長時，合萌總黃酮受熱時間過長，其中主要成分部分發(fā)生分解。因而確定最佳提取時間為60min。

圖3 提取時間對合萌總黃酮得率的影響

2.4.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對合萌總黃酮得率的影響

以合萌總黃酮得率為指標(biāo)，在固定提取溫度90 ℃，提取時間60min，液固比20∶1，提取次數(shù)2次的條件下，考察不同的乙醇體積分?jǐn)?shù)(50%、60%、70%、80%、90%)對合萌總黃酮得率的影響?？傸S酮得率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)變化結(jié)果如圖4所示。

結(jié)果表明：當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)較小時，合萌總黃酮得率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而上升，且當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時達(dá)到最高；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)大于70%時，合萌總黃酮得率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加反而下降，且下降幅度很大。造成這種現(xiàn)象可能是由于乙醇體積分?jǐn)?shù)過大時，醇溶性雜質(zhì)或色素等成分溶出增加，從而使合萌總黃酮得率下降。因而確定最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%。

圖 4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對合萌總黃酮得率的影響

2.4.4 液固比對合萌總黃酮得率的影響

以合萌總黃酮得率為指標(biāo)，在固定提取溫度90 ℃，提取時間60min，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，提取次數(shù)2次的條件下，考察不同液固比(10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1)對合萌總黃酮得率的影響?？傸S酮得率隨液固比變化結(jié)果如圖5所示。

結(jié)果表明，合萌總黃酮得率隨液固比的增加而增加，但當(dāng)液固比大于25時，總黃酮得率趨于穩(wěn)定。在實(shí)際操作中，既要考慮總黃酮得率，又要避免溶劑浪費(fèi)，因而確定最佳液固比為25∶1。

圖 5 液固比對合萌總黃酮得率的影響

2.4.5 提取次數(shù)對合萌總黃酮得率的影響

以合萌總黃酮得率為指標(biāo)，在固定提取溫度90 ℃，提取時間60min，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，液固比25:1的條件下，考察不同的提取次數(shù)(1、2、3、4次)對合萌總黃酮得率的影響?？傸S酮得率隨提取次數(shù)變化結(jié)果如圖6所示。

結(jié)果表明：合萌總黃酮得率隨提取次數(shù)增加而增加，但增幅逐漸減小。從圖中可以看出提取3次后，曲線基本趨于穩(wěn)定，即總黃酮得率趨于穩(wěn)定，因而視作提取4次后已提取完全。經(jīng)計(jì)算得知提取一次后轉(zhuǎn)移率為73.98%，提取2次后轉(zhuǎn)移率達(dá)到91.02%，這表明提取兩次后，合萌中總黃酮已基本轉(zhuǎn)移完全。因而確定最佳提取次數(shù)為 2 次。

圖 6 提取次數(shù)對合萌總黃酮得率的影響

2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化合萌總黃酮提取工藝

2.5.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平

依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果確定因素水平范圍，利用Design-ExpertSoftware8.0.6為輔助手段設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)。根據(jù)中心組合設(shè)計(jì)原理，以提取溫度、提取時間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、液固比4個因素為自變量，合萌總黃酮的得率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)了4因素3水平共29個試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，其中24個為析因試驗(yàn)，5個為中心試驗(yàn)，其因素水平分析選取見表1。

表1 響應(yīng)面因素水平編碼

2.5.2 模型方程的建立與方差分析

按照“2.5.1”項(xiàng)下進(jìn)行響應(yīng)面分析試驗(yàn)，方法與結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。采用Design-

Expert( 8.0.6 版本) 軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，以總黃酮得率為響應(yīng)值，對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二元多項(xiàng)式回歸擬合，得出回歸方程為：

Y=3.96+0.12A+0.066B-0.50C+0.058D-0.027AB-0.077AC-0.070AD+0.030BC+0.040BD-0.075CD-0.65A2-0.21B2-0.53C2-0.20D2

式中：Y為總黃酮得率，A為提取溫度，B為提取時間，C為乙醇體積分?jǐn)?shù)，D為液固比。

表2 響應(yīng)面分析試驗(yàn)結(jié)果

表3 方差分析結(jié)果

注：***P<0.001為極顯著，**P<0.01為高度顯著，*P<0.05為顯著。

由表3方差分析結(jié)果可知，回歸模型是極顯著的(P<0.001)，同時該模型的相關(guān)系數(shù)r=0.990 1，CV值為2.17%。說明該模型能夠反映響應(yīng)值的變化，而且方程的失擬項(xiàng)(P=0.134 0)不顯著，表明該方程對實(shí)驗(yàn)擬合情況好、誤差小，因此可用該回歸方程代替實(shí)驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測。

2.5.3 響應(yīng)曲面的分析

根據(jù)回歸方程，作出響應(yīng)面和等高線，考察擬合響應(yīng)面的形狀，分析提取溫度、提取時間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、液固比對合萌總黃酮提取得率的影響。各因素及其相互作用對相應(yīng)值的影響可以通過各圖直觀反應(yīng)出來。Design-ExpertSoftware8.0.6軟件處理后三維響應(yīng)面和等高線圖見圖7～12。

根據(jù)圖7～12及表3可知，一次項(xiàng)中，乙醇體積分?jǐn)?shù)(C)、提取溫度(A)對總黃酮得率的線性效率極顯著(P<0.001)，提取時間(B)對總黃酮得率的線性效率高度顯著(P<0.01)，液固比(D)對總黃酮得率的線性效率顯著(P<0.05)，二次項(xiàng)中，A2、B2、C2和D2影響均極顯著(P<0.001)，交互項(xiàng)按影響大小排列依次為AC、CD、AD、BD、BC、AB，其中提取溫度和乙醇體積分?jǐn)?shù)交互項(xiàng)即AC對合萌總黃酮的提取率有顯著影響，其他交互項(xiàng)均不顯著，表明各因素對黃酮得率不是簡單的線性關(guān)系。同時，由F值的大小可以推斷，在所選擇的試驗(yàn)范圍內(nèi)，4個因素對總黃酮提取得率影響的排序?yàn)橐掖俭w積分?jǐn)?shù)(C)>提取溫度(A)>提取時間(B)>液固比(D)。

2.6 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

由Design-Expert8.0.6軟件分析得出合萌總黃酮的最優(yōu)提取工藝為：提取溫度91.06 ℃，提取時間62.02min，乙醇體積分?jǐn)?shù)65.05%，液固比26.16∶1，其總黃酮得率為4.11mg/g。根據(jù)實(shí)際情況可將條件優(yōu)化為提取溫度90 ℃，提取時間60min，乙醇體積分?jǐn)?shù)65%，液固比25∶1。在此優(yōu)化條件下，進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明合萌平均總黃酮得率為4.08mg/g，與模型預(yù)測值的誤差為0.73% ，說明該方程與實(shí)際情況擬合較好。

3 結(jié)論與討論

響應(yīng)面分析克服了正交設(shè)計(jì)在考慮因素間交互作用時，如果任意安排正交表中各列因素將會導(dǎo)致交互效應(yīng)與其它效應(yīng)混雜的缺陷。響應(yīng)面分析法是研究幾種因素間交互作用的回歸分析方法[8]。本實(shí)驗(yàn)采用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析法對合萌總黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并結(jié)合實(shí)際情況得出最優(yōu)條件：提取溫度90 ℃，提取時間60min，乙醇體積分?jǐn)?shù)65%，液固比25∶1，在此優(yōu)化條件下，總黃酮得率為4.08mg/g。回歸分析和驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明，模型擬合情況好、實(shí)驗(yàn)誤差小，可用于實(shí)際預(yù)測，從而也說明了采用響應(yīng)面分析法中Box-Behnken對合萌總黃酮提取條件進(jìn)行優(yōu)化合理可行，具有一定的實(shí)際應(yīng)用價值。

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Optimization of Extraction for Flavonoids fromAeschynomeneindicaL.by Response Surface Methodology

Zhu Yuanyuan1，Zhao Ming1, 2*，Ouyang Zhen1，Cai Jianming1，Zhang Cheng1,Zhou Wenju1，Liu Jiangdi1，Yang Qian1，Wang Linwei1

(1. School of Pharmacy, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China;2. Affiliated Hospital of Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China)

Objective: Response Surface Methodology (RSM) was used to optimize the extraction technology of total flavonoids fromAeschynomeneindicaL.. Methods: In single-factor tests, extraction time, ethanol concentration, liquid-solid ratio, extraction temperature and extraction times on yield of total flavonoids were explored. Among them, extraction time, ethanol concentration, liquid-solid ratio and extraction temperature were selected as influencing factors during extraction. The extraction technology was optimized by RSM. Results: The optimal extraction conditions of total flavonoids were extraction time of 60 min, ethanol concentration of 65%, liquid-solid ratio (g∶mL) of 25∶1, extraction temperature of 90 ℃. Under the optimal conditions, the yield of total flavonoids was 4.08 mg/g, which was close to the predicted value (4.11 mg/g). Conclusion: RSM can improve the yield of total flavonoids in a certain extent, which indicated that RSM is feasible to optimizing the extraction technology of total flavonoids fromAeschynomeneindicaL..

AeschynomeneindicaL.; flavonoids; Response Surface Methodology (RSM)

10.3969/j.issn.1006-9690.2016.05.003

2016-03-28

江蘇省中醫(yī)藥局科技項(xiàng)目(LB 13037)；江蘇省江蘇大學(xué)第13批大學(xué)生科研立項(xiàng)資助項(xiàng)目(13A167)。

朱媛媛(1992—)，女, 在讀碩士研究生，主要從事中藥活性成分研究及新藥開發(fā)。E-mail：1462936884@qq.com

*通訊作者： 趙明(1962—)，男，主任中藥師，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事中藥活性成分研究及新藥開發(fā)工作。 E-mail：anchorage8@126.com

R284.2

A

1006-9690(2016)-05-0009-05