周亞楠，柴賀，初琦，樸春紅，王玉華，于寒松，劉俊梅，代偉長

（吉林農業(yè)大學食品科學與工程學院，吉林長春130118）

納豆芽孢桿菌發(fā)酵豆渣營養(yǎng)成分變化研究

周亞楠，柴賀，初琦，樸春紅，王玉華，于寒松，劉俊梅，代偉長

（吉林農業(yè)大學食品科學與工程學院，吉林長春130118）

研究納豆芽孢桿菌發(fā)酵豆渣后營養(yǎng)成分變化情況。將濕豆渣調整水分，滅菌，冷卻后接入不同濃度的納豆芽孢桿菌，37℃下發(fā)酵22h，4℃下后熟22h后，對其粒徑分布、營養(yǎng)成分、氨基酸含量、蛋白降解程度、部分抗營養(yǎng)因子指標進行測定。結果表明：豆渣經納豆芽孢桿菌發(fā)酵后粒徑變小、渣感減弱、口感明顯得到改善。粗蛋白、粗纖維等常規(guī)營養(yǎng)成分無顯著變化；水溶性蛋白、水溶性纖維、多糖、小肽含量顯著提高（P<0.05）；氨基酸組分上，豆渣發(fā)酵后纈氨酸、甲硫氨酸等必需氨基酸含量均有顯著提高（P<0.05）；豆渣風味品質得到明顯改善；胰蛋白酶抑制劑活性和植酸含量均有顯著下降（P<0.05）。豆渣經納豆芽孢桿菌發(fā)酵后營養(yǎng)價值和風味品質得到一定程度的提高，同時降低抗營養(yǎng)因子，為納豆桿菌發(fā)酵豆渣的可行性提供理論參考。

豆渣；發(fā)酵；納豆芽孢桿菌；營養(yǎng)成分

豆渣是豆腐、豆奶等大豆制品加工中的主要副產物，約占全豆干重的15%～20%[1]，目前國內大豆食品行業(yè)每年約生產4 000萬t濕豆渣[2]。由于其保質期短、口感粗糙、豆腥味較重，加工性能較差、幾乎無市場價值，往往只能作為工業(yè)廢渣和飼料處理。近年來大量研究發(fā)現，通過微生物發(fā)酵可以使豆渣的很多性能得

到改善[3]。發(fā)酵后的豆渣不僅具有抗氧化、降低血液中膽固醇含量、減少糖尿病患者對胰島素的消耗等功效[4]；還可以改善豆渣口感、風味、延長保質期、減少資源浪費、環(huán)境污染等，從而極大提高了其綜合利用價值。

目前，發(fā)酵豆渣常用的微生物種類繁多，有應用毛霉、黑曲霉、米曲霉等單一菌株為接種液進行發(fā)酵[5]，也有以酵母、米曲霉等混合菌株為接種液進行發(fā)酵[6]，經發(fā)酵后豆渣的很多性能均得到很好的改善。納豆芽孢桿菌是從日本的傳統發(fā)酵食品納豆中發(fā)現并分離出來的一種益生菌，屬細菌科、芽孢桿菌屬。經研究發(fā)現：納豆芽孢桿菌具有分解蛋白質、碳水化合物、脂肪等大分子物質的性能，使發(fā)酵產品中富含氨基酸、寡聚糖等多種易被人體吸收的成分，因而對于發(fā)酵豆制品來說，納豆芽孢桿菌是一種非常重要的發(fā)酵劑。此外，納豆芽孢桿菌在發(fā)酵產品的屬性、功能特性及風味品質上也同樣起到重要的作用。但是目前對于納豆芽孢桿菌的研究主要集中于納豆及相關產品的研發(fā)和成分分析，而對納豆芽孢桿菌發(fā)酵豆渣營養(yǎng)成分變化尚沒有系統化研究。本研究以納豆芽孢桿菌為發(fā)酵菌株對副產物豆渣進行發(fā)酵，研究發(fā)酵前后營養(yǎng)成分變化情況，旨在為副產物豆渣的高效利用及工藝研究提供理論參考，同時為進一步促進豆渣食品產業(yè)化進程奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與儀器

新鮮豆渣：吉林農業(yè)大學食品生物反應器與功能性食品研究室自制；菌種：納豆芽孢桿菌由林農業(yè)大學食品生物反應器與功能性食品研究室分離并保存。

1.1.2 試劑

石油醚（沸程：30℃～60℃）、苯酚、濃硫酸、碘化汞、3、5-二硝基水楊酸試劑、葡萄糖、氫氧化鈉、重蒸酚、亞硫酸氫鈉、酒石酸鈉（均為分析純）：北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司。

1.1.3 儀器與設備

AUY220分析天平、UV-1700紫外分光光度計：日本島津公司；YXQ-LS-75G立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療器械廠；101A-2電熱鼓風干燥箱：上海實驗儀器廠有限公司；DSY-2-4電熱恒溫水浴鍋：北京國華醫(yī)療器械廠；3K15離心機：美國Sigma公司；DG-800旋渦混合器：北京鼎國昌盛生物技術責任有限公司；RE52CS旋轉蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；Hanon K1100全自動定氮儀：山東海能科學儀器有限公司；SW-CJ-1F超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 豆渣發(fā)酵

等分稱取新鮮豆渣6份，調整水分含量至75%，121℃、滅菌20min，冷卻至40℃，按每100 g濕豆渣分別接種5、10mL接種活化好的菌液濃度為107/mL納豆芽孢桿菌液后，37℃前期發(fā)酵22 h，置于4℃后熟22 h，將樣品取出后，121℃滅菌20min，真空冷凍干燥備用。其中以不接種菌液作為空白對照組，其它條件均一致。

1.2.2 粒度分布測定

分別取8 g發(fā)酵和未發(fā)酵豆渣，置于三角瓶中，按相同比例加水混合后，進行超聲處理，促使顆粒分散（超聲處理可能造成豆渣顆粒破碎的影響可忽略不計）。將處理后的樣品置于搖床中，40℃、150 r/min振蕩3 h，使豆渣顆粒均勻分散，隨后倒入依次疊好的標準套篩中進行篩析（疊放次序由上至下，篩孔直徑分別為：1 500、900、450、200、30μm標準檢驗篩），用蒸餾水沖洗每層篩豆渣顆粒5min，依次將篩上殘留豆渣顆粒分別轉入事先編號的稱量皿中，于烘箱中105℃烘干至恒重，稱取重量并分別計算質量分數（%），由此依次求出0～30、（＞30）～200、（＞200）～450、（＞450）～900、（＞900）～1 500、＞1 500μm顆粒質量分數（%）。

1.2.3 一般營養(yǎng)成分測定

灰分含量參照GB/T 5009.4-2010《食品安全國家標準食品中灰分含量的測定》，采用高溫灼燒法進行測定；蛋白含量測定參照GB/T 5009.5-2010《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》方法進行；粗脂肪含量測定參照GB/T5009.6-2003《食品中粗脂肪的測定》方法進行；膳食纖維含量測定參照GB/T5009.88-2008《食品中膳食纖維的測定》方法進行；粗蛋白體外消化率的測定參照李清曉等[7]方法進行測定；采用鄰苯二甲醛法[8]對小肽含量進行測定；胰蛋白酶抑制劑活性測定參照盧曉凌等[9]方法進行；植酸含量測定參考Ling JF[10]等方法進行；采用氨基酸自動分析儀測定氨基酸的組成和含量。

1.2.4 蛋白降解程度分析

準確稱?。?.0±0.01）g豆渣樣品，加入30mL丙酮，室溫攪拌30min～50min后，9000 r/min離心15min，去除上清液，將樣品置于通風櫥內，揮去殘留丙酮，干燥備用。參照Lim等[11]方法進行SDS-PAGE凝膠電泳法。

1.3 數據處理

本試驗采用Microsoft Excel2007軟件對所得數據結果進行統計；運用SPSS軟件進行顯著性分析。結果圖均用SigmaPlot軟件繪制。

2 結果與分析

2.1 粒徑分布比較分析

豆渣發(fā)酵前后粒徑分布如圖1所示。

圖1 豆渣發(fā)酵前后粒徑分布Fig.1 Particle sizedistribution of bean residuebeforeand after ferm ention

由圖1可知，未發(fā)酵豆渣的粒徑主要集中在（＞450）～900、（＞900）～1500和＞1 500μm之間，其中在0～30μm尺寸的顆粒僅占17.5%。而發(fā)酵后的豆渣粒徑則主要分布在0～30μm之間，占總顆粒的85%以上，（＞900）μm～1 500μm和＞1 500μm顆粒幾乎不存在，即經發(fā)酵的豆渣與未發(fā)酵的豆渣相比，其豆渣顆粒明顯變小。對于感覺敏感的人，口腔可感知的顆粒最小尺寸為20μm～30μm。由于＞30μm的豆渣顆粒的減少，使發(fā)酵后豆渣的渣感顯著降低，更容易吞咽。

2.2 常規(guī)營養(yǎng)成分分析

豆渣發(fā)酵前后粗灰分、粗蛋白、可溶性多糖等常規(guī)營養(yǎng)成分測定結果見表1。

表1 豆渣發(fā)酵前后常規(guī)營養(yǎng)成分分析Table1 The conventionalnutrient com position analysisofbean residuebeforeand after fermention %

由表1可知豆渣發(fā)酵前后粗灰分、粗蛋白、總纖維等常規(guī)營養(yǎng)成分無顯著變化，而發(fā)酵豆渣的粗脂肪、可溶性多糖、可溶性纖維含量均顯著提高（P＜0.05）。當接種量為5%和10%時，粗脂肪增加31.44%和35.83%，可溶性多糖增加393.33%和364.00%，可溶性纖維則增加102.43%和125.35%，不同接種量之間無顯著差異。

2.3 氨基酸組分分析

通過氨基酸自動分析儀測得豆渣發(fā)酵前后氨基酸的組分如表2所示。

表2 豆渣發(fā)酵前后氨基酸（AA）含量變化Table2 Theam ino acid（AA）contentsof bean residuebeforeand after ferm ention%

豆渣經發(fā)酵后，部分氨基酸組分、總必需氨基酸含量均發(fā)生顯著變化（P＜0.05）。當接種量為5 mL/100 g時，谷氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸以及總必需氨基酸含量分別提高了14.71%、68.42%、40.00%、58.82%、31.34%和13.81%；當接種量為10%時分別提高了23.11%、78.95%、60%、147.06%、89.55%和30.03%，均高于接種量為5%的發(fā)酵豆渣；發(fā)酵后只有絲氨酸出現顯著下降，當接種量為5%和10%時，分別下降了23.53%和47.06%；半胱氨酸等11種氨基酸含量無顯著變化。

2.4 蛋白質品質變化

試驗分別對豆渣發(fā)酵前后可溶性蛋白和小肽含量指標進行了測定，具體結果見表3，并結合SDSPAGE凝膠電泳對豆渣發(fā)酵前后蛋白降解程度進行分析（圖2）。

表3 豆渣發(fā)酵前后蛋白品質變化Table3 Theprotein qualityofbean residuebeforeand after ferm ention

圖2 發(fā)酵豆渣SDS-PAGE電泳圖譜分析Fig.2 SDS-PAGE electrophoresisprofileof the fermented bean residues

由表3可知，按不同的接種量發(fā)酵豆渣后可溶性蛋白、小肽含量均有顯著增加（P<0.05）。當接種量為5mL/100 g時，分別增加了128.83%和438.57%；接種量為10mL/100g時則分別增加了144.58%和443.57%，而不同接種量之間無顯著差異。由圖2可知，未發(fā)酵豆渣中大分子蛋白居多，但豆渣發(fā)酵后，蛋白質分子量基本都集中在14.4 ku以下，充分表明豆渣中大分子蛋白已被降解，這與表3結果趨勢基本一致。

2.5 抗營養(yǎng)因子活性分析

原豆渣中抗營養(yǎng)因子殘留較高。但經發(fā)酵后發(fā)現胰蛋白酶抑制劑活性和植酸含量均顯著下降（P< 0.05），特別是當接種量為10mL/100 g的發(fā)酵豆渣，胰蛋白酶抑制劑活性變成17.27 TIU/g，僅為原豆渣胰蛋白酶抑制劑活性的1%，且植酸未檢測出（見表4）。

3 討論

豆渣由于口感粗糙、蛋白質分子結構緊密、顆粒較大，同時含有一些抗營養(yǎng)因子，不利于營養(yǎng)物質的消化吸收。將豆渣用微生物進行發(fā)酵可以改變營養(yǎng)物質化學結構，其中部分抗營養(yǎng)因子得到有效的減少或消除，大分子蛋白得到不同程度的降解[12]，同時豆渣的渣感降低，吞咽難易程度得到改善[13]。隨著微生物發(fā)酵的發(fā)展，為使用納豆芽孢桿菌發(fā)酵豆渣改善其營養(yǎng)特性提供了可能性。本試驗選用納豆芽孢桿菌發(fā)酵豆渣，與未發(fā)酵豆渣相比，發(fā)酵豆渣粒度分布改變，顆粒減小，渣感降低。ZhuYunping[14]等在用枯草芽胞桿菌屬發(fā)酵豆渣的研究中也發(fā)現枯草芽孢桿菌發(fā)酵能改善豆渣的口感，這一點與本研究相一致。

表4 豆渣發(fā)酵前后抗營養(yǎng)因子活性變化Table4 Theanti-nutritional factorsactivity of bean residue beforeand after fermention

在常規(guī)營養(yǎng)成分分析中發(fā)現，發(fā)酵后的豆渣粗蛋白、總纖維、粗灰分含量均無顯著變化，但是粗脂肪、可溶性多糖、可溶性纖維含量顯著提高。特別指出的是，發(fā)酵豆渣粗脂肪含量顯著增加，為30.4%，這可能是在發(fā)酵過程中，豆渣的營養(yǎng)成分降解后會產生一些小分子物質（如：醇和酸），同時氨基酸在酸的作用下可能會變成醇，醇和酸發(fā)生酯化反應，化合為酯，使得石油醚提取物質量增加，從而導致粗脂肪含量相對增加；可溶性多糖、可溶性纖維含量的顯著提高則與納豆芽孢桿菌產酶體系有關。納豆芽孢桿菌是一類產復合酶的菌株，除產蛋白酶外，還可產纖維素酶、淀粉酶、果膠酶和糖化酶等。納豆芽孢桿菌發(fā)酵豆渣過程中產生的復合酶不僅可以降解大量纖維素生成單糖物質，使可溶性碳水化合物遞增，同時還可以將不溶性纖維相關組分轉化為可溶性，提高其含量。而可溶性多糖和可溶性纖維含量的增加不僅有利于改善豆渣的口感和風味，還會增加豆渣的細膩程度。豆渣發(fā)酵后氨基酸組成發(fā)生一定變化，其中谷氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸含量均有不同程度提高，而其它氨基酸及總氨基酸含量均無顯著變化，這可能是由于在發(fā)酵過程中，豆渣中氨基酸組分發(fā)生轉氨及合成作用所致。楊學娟[15]在用納豆芽孢桿菌發(fā)酵低溫豆粕的功能活性和機制研究中發(fā)現納豆芽孢桿菌發(fā)酵豆粕后天冬氨酸、谷氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸及賴氨酸明顯增加，和本試驗研究結果相類似。

納豆芽孢桿菌發(fā)酵過程中分泌的蛋白酶是一類

內切酶，它能有效水解大豆蛋白，生成大量的大豆多肽。王陽等[16]利用納豆芽孢桿菌發(fā)酵大豆，并以大豆蛋白水解率為指標，研究納豆芽孢桿菌對大豆蛋白水解作用，發(fā)現在最佳條件下大豆蛋白水解率達到44.4%。本試驗表3及SDS-PAGE電泳圖譜的結果表明豆渣在納豆芽孢桿菌所分泌的蛋白酶作用下，部分水不溶性蛋白轉變成水溶性蛋白，把大分子量的蛋白降解成為營養(yǎng)價值更高、更容易被吸收利用的小分子量的多肽，并且經發(fā)酵后的蛋白質分子量主要集中在14.4 ku以下，這可能是因為不同微生物產酶體系不一樣，從而水解程度也不同，這和前人研究的結果基本類似[17]。

豆渣中含豐富的蛋白質，同時也存在多種抗營養(yǎng)因子，例如胰蛋白酶抑制劑、植酸等典型代表。它們的存在對生物體內某些消化酶起抑制作用，與營養(yǎng)物質絡合成不易消化的成分，使得豆渣的消化率和動物的吸收率下降。本試驗豆渣經不同接種量納豆芽孢桿菌發(fā)酵后胰蛋白酶抑制劑活性顯著降低，說明胰蛋白酶抑制劑在發(fā)酵的過程中被有效的降解。姜丹等[18]研究發(fā)現用酵母發(fā)酵大豆后植酸降解率可達到80.11%。而本研究中顯示用納豆芽孢桿菌發(fā)酵豆渣后植酸的降解率基本上達到了100%，這可能是由于納豆芽孢桿菌發(fā)酵過程中產生的復合酶對植酸的分解具有協同作用，從而提高植酸的降解率。

4 小結

豆渣經納豆芽孢桿菌發(fā)酵后粒徑變小，渣感減弱，大分子蛋白被分解，必需氨基酸含量提高，抗營養(yǎng)因子基本被降解，豆渣的營養(yǎng)品質得到了充分提高。該工藝的研究為提高豆渣綜合利用價值和生產高品質豆渣食品提供新思路與理論參數。

[1]高金燕.豆渣的營養(yǎng)與藥用價值[J].中國食品與營養(yǎng),2003(11): 49-50

[2]Liu X B,Jin J,Wang G H,et al.Soybean yield physiology and developmentofhigh-yielding practices in NortheastChina[J].Field Crops research,2008,105:157-171

[3]李艷芳,郝建雄,程永強,等.黑曲霉和米曲霉發(fā)酵改善豆渣口感[J].農業(yè)工程學報,2012,28(7):248-253

[4]Fujita T,Funako T,Hayashi H.8-Hydroxydaidzein,an aldose reductase inhibitor from okara fermented with Aspergillussp.HK-388 [J].Bioscience,Biotechnology,and Biochemistry,2004,68(7):1588－1590

[5]王慧,劉瑩,胡博涵,等.豆渣不同菌種發(fā)酵后成分變化的研究[J].現代食品科技,2013,29(6):1277-1280

[6] 徐媛.固態(tài)發(fā)酵法改變豆渣加工性能的研究[D].長春:吉林農業(yè)大學,2012

[7]李清曉,李忠平,莊蘇,等.豆粕粉碎粒度與蛋白質體外消化率的關系研究[J].家畜生態(tài)學報,2005,26(5):28-31

[8]Estefania Gonzalez-Garcia,M.Luisa Marina,M.Concepcion Garcia. Plum (PrunusDomestica L.)by-productasanew and cheap source of bioactive peptides:Extraction method and peptides characterization[J].Journalof Functional Foods,2014,11:428-437

[9]盧曉凌.大豆中抗營養(yǎng)因子脲酶和胰蛋白酶抑制劑不同測定方法的比較[D].哈爾濱:東北林業(yè)大學,2008

[10]Ling JF,HAan BZ,RObertNountM J,etal.Effectsofsoaking,germination and fermentation on phytic acid,total and in vitro soluble zinc in brown rice[J].Food Chemistry,2008,11(4):821-828

[11]Lim JY,Kim JJ,LeeDS,etal.Physicochemical characteristicsand production of whole soymilk from Monascus fermented soybeans. Food Chemistry,2010,120(1):255-260

[12]Juan M Y,Wu CH,Chou CC.Fermentationwith Bacillus spp.asa bioprocess to enhance anthocyanin content,the angiotensin converting enzyme inhibitory effect and the reducing activity of black soybeans[J].Food Microbiology,2010,27(7):918-923

[13]Rhyu M R,Kim EY.Umami taste characteristicsofwater extractof Doenjang,a Korean soybean paste:low-molecular acidic peptides maybeapossible clue to the taste[J].Food Chemistry,2011,127(3): 1210-1215

[14]Zhu Yunping,Yin Lijun,Cheng Yongqing,et al.Effects of sources ofcarbon and nitrogen on production ofα-glucosidase inhibitorbya newly isolated strain ofBacillussubtilisB2[J].Food Chemistry,2008, 109(4):737－742

[15]楊學娟.納豆芽孢桿菌固體發(fā)酵低溫豆粕的功能活性及機制研究[D].南京:江蘇大學,2013

[16]王陽,張景,陳聰,等.納豆芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵產低分子大豆蛋白肽的工藝優(yōu)化[J].大連工業(yè)大學學報,2012,31(3):161-164

[17]Teng D,Gao M,Yang Y,et al.Bio-modification of soybean meal with Bacillus subtilis or Aspergillus oryzae.Biocatalysis and AgriculturalBiotechnology,2012,1(1):32-38

[18]姜丹,丁洪浩,張晶,等.發(fā)酵對豆粕中營養(yǎng)物質和抗營養(yǎng)因子的影響[J].中國獸醫(yī)學報,2011,31(4):579-582

The Variable Pattern of Nutrition Com ponents in Bacillus natto Fermentation of Bean Residue

ZHOUYa-nan，CHAIHe，CHUQi，PIAOChun-hong，WANGYu-hua，YUHan-song，LIU Jun-mei，DAIWei-chang
（Instituteof Food Scienceand Engineering，Jilin AgriculturalUniversity，Changchun 130118，Jilin，China）

In the present study，bacillus natto was used to fermented bean residue，fermented bean residue of the contents of nutrition componentswas investigated.Themoisture ofwet bean residue was adjusted，sterilized，cooleddown to room temperature，the bacillus natto seed culture was incubated to the sterilized bean residue and incubated at37℃for 22 h，after-mature cultivated at4℃for 22 h.The particle size distribution，conventional nutritional components，amino acid contents，protein degradation degree，some anti-nutritional factorsof fermented bean residuewere analyzed，respectively.The resultsshowed the taste sense that the particle sizebecame smallerwassignificantly improved after fermentation.Crude protein，crude fiber，ash and other nutrients had no significant differences，the contents of the water-soluble protein，water-soluble fiber，polysaccharidesand smallpeptide levelswere significantly increased（P<0.05）.The contentsofsome amino acid ofbean residuewere changed，compared with non-fermented bean residue.The essentialamino acids contents including valine，methionine，phenylalanine of fermented bean residue both were significantly improved（P< 0.05）.Additionally，the trypsin inhibitor activity and phytate content of fermented bean residue were significantly decreased.The study indicated that bacillusnatto fermentation significantly improved nutrition and flavor components of bean residue，the partial amino acid component contents and the nutritional valuewere significantly increased，anti-nutritional factorswere degraded and itprovided a theoretical refeen for the feasibility of bean residue fermented by bacillusnatto.

bean residue；fermention；bacillusnatto；nutrition components

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.23.040

2016-01-21

現代農業(yè)產業(yè)技術體系建設專項資金資助項目（CARS-04）；吉林省科技廳科技創(chuàng)新人才培養(yǎng)計劃“吉林省農產品副產物高附加值開發(fā)研究團隊”（20160519013JH）

周亞楠（1991—），女（漢），碩士研究生，研究方向：發(fā)酵微生物的選育與代謝調控。

*通信作者：樸春紅（1972—），女（朝鮮），教授，博士，研究方向：生物反應器與功能性食品。