李 陶龐 琪劉永斌

抑制microRNA-22可通過調(diào)節(jié)SIRT1表達(dá)減輕氧化應(yīng)激引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷

李 陶1龐 琪2劉永斌1

目的 探討SIRT1及microRNA-22在氧化應(yīng)激引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷過程中的表達(dá)變化和機(jī)制。方法 使用20 μmol/L叔丁基過氧化氫（t-BHP）誘導(dǎo)人臍周靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞株（HUVEC）的氧化應(yīng)激。Cell Tilter Blue細(xì)胞活性分析試驗(yàn)及流式細(xì)胞術(shù)檢測氧化應(yīng)激對HUVEC增殖及凋亡的影響。Western blot檢測氧化應(yīng)激狀態(tài)下HUVEC SIRT1蛋白水平的變化，同時(shí)qRT-PCR分析氧化應(yīng)激對HVEC microRNA-22水平的影響。通過轉(zhuǎn)染microRNA-22 inhibitor抑制HUVEC的microRNA-22表達(dá)，并觀察microRNA-22抑制對氧化應(yīng)激狀態(tài)下HUVEC SIRT1表達(dá)及細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果 t-BHP誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激可誘導(dǎo)HUVEC的增殖抑制，且降低SIRT1的表達(dá)。氧化應(yīng)激狀態(tài)下，HUVEC的microRNA-22表達(dá)增高。抑制microRNA-22可以恢復(fù)氧化應(yīng)激狀態(tài)下HUVEC的SIRT1表達(dá)，減輕細(xì)胞增殖抑制。結(jié)論 microRNA-22通過調(diào)節(jié)SIRT1參與氧化應(yīng)激引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，可作為動(dòng)脈粥樣硬化的潛在治療靶點(diǎn)。

動(dòng)脈粥樣硬化；氧化應(yīng)激；血管內(nèi)皮損傷；microRNA；SIRT1

血管內(nèi)皮細(xì)胞（vascular endothelial cell，VEC）的損傷是動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié)，既是促進(jìn)AS初期粥樣斑塊形成的使動(dòng)因素，又是AS惡化的重要原因之一［1-2］。近年來，關(guān)于氧化應(yīng)激和血管內(nèi)皮損傷關(guān)系的研究較為熱門，一般認(rèn)為氧化應(yīng)激過程中產(chǎn)生的活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）可導(dǎo)致VEC胞膜凋亡，進(jìn)而導(dǎo)致血管內(nèi)皮屏障功能喪失，脂質(zhì)大量沉積于血管內(nèi)皮下，形成粥樣斑塊。因此，抗氧化應(yīng)激保護(hù)VEC有助于AS的防治［3-4］。沉默信息調(diào)節(jié)因子1（Silent mating-type information regulation 2 homolog，SIRT1）是NAD+依賴的組蛋白去乙?；?，參與細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)并與細(xì)胞應(yīng)激狀態(tài)下的存活有關(guān)。既往研究認(rèn)為SIRT1可以維持細(xì)胞的存活，具有抗凋亡作用，同時(shí)SIRT1是一種對氧化損傷敏感的蛋白［5］。但SIRT1是否在氧化應(yīng)激造成的VEC損傷中扮演一定角色，還少有報(bào)道。microRNA是一類長度約20～24個(gè)核苷酸的非編碼RNA，其可通過與靶基因mRNA序列的3'非翻譯區(qū)互補(bǔ)，從而降解mRNA來實(shí)現(xiàn)對靶基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控?，F(xiàn)有研究證明，microRNA與很多人類疾病相關(guān)，包括AS［6］。因此調(diào)控microRNA水平，有可能成為治療或緩解動(dòng)脈粥樣硬化的措施，通過調(diào)控microRNA水平來保護(hù)AS中的血管內(nèi)皮損傷具有前景。生物信息學(xué)方法證實(shí)，microRNA-22可能以SIRT1為靶點(diǎn)。因此，本研究觀察了氧化應(yīng)激狀態(tài)下VEC中SIRT1水平及microRNA-22水平的變化，同時(shí)明確了二者以氧化應(yīng)激所致細(xì)胞損傷的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　材料和方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng)

HUVEC細(xì)胞株培養(yǎng)采用添加10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。細(xì)胞消化采用0.25%胰酶（含0.02%EDTA的）。培養(yǎng)環(huán)境為37℃，5%CO2培養(yǎng)箱。

1.2細(xì)胞氧化應(yīng)激的誘導(dǎo)

參考Khoo等人報(bào)道的方法［7］，本研究使用20 μmol/L叔丁基過氧化氫（t-BHP）誘導(dǎo)HUVEC的氧化應(yīng)激。根據(jù)是否使用t-BHP處理，將HUVEC細(xì)胞分為兩組，分別為：對照組，即不采用任何刺激處理僅常規(guī)培養(yǎng)；t-BHP處理組，使用20 μmol/L t-BHP刺激24 h以模擬氧化應(yīng)激狀態(tài)。

1.3Cell Tilter Blue法分析氧化應(yīng)激對HVEC增殖的影響

將上述兩組細(xì)胞分別接種于96孔板，密度為每孔2×104個(gè)細(xì)胞。繼續(xù)培養(yǎng)12 h、24 h、48 h及72 h，分別于上述時(shí)間點(diǎn)，棄去孔內(nèi)原有液體，每孔加入DMEM稀釋后的Cell Tilter Blue試劑（1：10）72 μL，同時(shí)設(shè)立空白對照孔（無細(xì)胞，僅含Cell Tilter Blue）避光孵育1 h后，使用熒光微板儀讀取各孔熒光強(qiáng)度，并計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.4Western Blot檢測氧化應(yīng)激對HVEC SIRT1蛋白表達(dá)水平的影響

將上述兩組細(xì)胞分別接種于6孔板，密度為每孔1×105個(gè)細(xì)胞。繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)24 h。收集各組細(xì)胞，提取蛋白樣本。使用12%的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳并轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，使用5%脫脂奶粉室溫封閉30 min。采用大鼠源性抗人SIRT1抗體及大鼠源性抗人β-actin孵育膜2 h。TBS-T清洗以除去多余一抗。使用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗避光孵育膜2 h，TBS-T清洗以除去多于二抗，滴加ECL發(fā)光試劑，顯影曝光，分析蛋白條帶。

1.5qRT-PCR檢測氧化應(yīng)激對HVEC microRNA-22表達(dá)的影響

提取兩組細(xì)胞中的總RNA，采用TaqMan microRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒將microRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用上文所述方法，對cDNA進(jìn)行擴(kuò)增定量。2-△△CT法計(jì)算microRNA-22的相對水平（t-BHP處理組相對于對照組）表示，內(nèi)參選用U6 RNA。

1.6轉(zhuǎn)染microRNA 22 inhibitor抑制HUVEC內(nèi)的microRNA-22表達(dá)

將t-BPH處理后的細(xì)胞種植于6孔板，密度為每孔1×105個(gè)細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到70%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染采用HiperFect轉(zhuǎn)染試劑，轉(zhuǎn)染試劑與miRRNA-22 抑制劑的比例為3：1，miRRNA-22 抑制劑的終濃度為50 nmol/L。轉(zhuǎn)染miRRNA-22 抑制劑陰性對照序列（microRNA inhibitor NG）作為陰性對照。轉(zhuǎn)染48 h后，使用qRT-PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果，取microRNA-22受到抑制的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.7microRNA-22抑制對氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的HVEC損傷的影響。

收集t-BPH處理+轉(zhuǎn)染microRNA-22 inhibitor（或microRNA inhibitor NG序列）的HVEC細(xì)胞及僅經(jīng)過t-BPH處理的HVEC細(xì)胞，按上文提到的方法，檢測抑制micrRNA-22后，HVEC在氧化應(yīng)激狀態(tài)下的細(xì)胞存活情況，同時(shí)觀察SIRT1在microRNA 22抑制后的表達(dá)變化。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 15.0 軟件。計(jì)量資料采用（）表示，采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1t-BHP誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激可抑制HVEC細(xì)胞的增殖

Cell Tilter Blue分析的結(jié)果顯示，在24 h，48 h及72 h時(shí)間點(diǎn)，t-BHP處理組細(xì)胞的存活率分別為［1.3±0.12），（1.8±0.22）及2.2±0.30］均低于對照組［（1.7±0.1），（2.9±0.2）及（4.3±0.3）］（P＜0.05）（如圖1）。

圖1　t-BHP處理可以抑制HVEC的增殖

2.2t-BHP誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激抑制HVEC細(xì)胞SIRT1的表達(dá)

Western blot結(jié)果顯示（如圖2），t-BHP處理細(xì)胞24 h后，SIRT1的蛋白水平較對照組有所降低，提示t-BHP誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激可以抑制SIRT1的表達(dá)。

圖2　t-BHP處理可以抑制HVEC SIRT1的蛋白水平

2.3t-BHP誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激增加HVEC細(xì)胞microRNA-22的水平

qRT-PCR結(jié)果顯示（如圖3），t-BHP處理組細(xì)胞的micorRNA-22（1.73±0.24）水平高于對照組（1.00±0.08），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），該結(jié)果提示t-BHP誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激可以增加HEVC microRNA-22的表達(dá)。

圖3　t-BHP處理可以增加HVEC的microRNA-22水平

2.4抑制microRNA-22可增加氧化應(yīng)激狀態(tài)下HVEC SIRT1的表達(dá)并減輕其損傷

抑制microRNA-22可以增加氧化應(yīng)激狀態(tài)下HEVC細(xì)胞內(nèi)的SIRT1表達(dá)（如圖4）。同時(shí)，抑制microRNA-22還可以保護(hù)t-BHP誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激對HVEC的損傷，表現(xiàn)為細(xì)胞存活率增加（如圖5）。

圖4　microRNA-22 inhibitor轉(zhuǎn)染可以增加氧化應(yīng)激狀態(tài)下HVEC的SIRT1蛋白水平

圖5　microRNA-22 inhibitor轉(zhuǎn)染可以增加氧化應(yīng)激狀態(tài)下HVEC的增殖注：*表示P＜0.05

3　討論

氧化應(yīng)激是AS發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，伴隨從脂紋形成到粥樣斑塊破裂乃至血栓形成的整個(gè)過程［8］。VEC是血管的首道屏障，也是與血液直接接觸的部位，因此是氧化應(yīng)激損傷的主要目標(biāo)。ROS對VEC具有直接毒性且作用廣泛能誘發(fā)細(xì)胞凋亡［9］。除外ROS的直接毒性作用，ROS還可作用于一些細(xì)胞信號(hào)通路，調(diào)節(jié)相應(yīng)基因的表達(dá)。如ROS可作用于炎性反應(yīng)調(diào)控通路，誘導(dǎo)腫瘤壞死因子α，白細(xì)胞介素-1及干擾素-γ等致炎因子的釋放，從而引起炎性反應(yīng)。過度激活的炎性細(xì)胞又能釋放更多的活性氧物質(zhì)，從而形成局部惡性循環(huán)，加劇對細(xì)胞的損傷［10］。ROS還可影響蛋白質(zhì)的磷酸化，作用于相應(yīng)的信號(hào)通路，實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)控［11］。此外，ROS還可作用于一些轉(zhuǎn)錄因子，ROS可通過直接氧化轉(zhuǎn)錄因子或者影響上級(jí)通路蛋白的磷酸化修飾來間接作用于轉(zhuǎn)錄因子［12］。本研究的焦點(diǎn)之一為AS中氧化應(yīng)激中產(chǎn)生的ROS對SIRT1表達(dá)的影響，以及這種關(guān)系對VEC凋亡的影響。SIRT1是sirtuin家族的成員之一，具有組蛋白脫乙酰酶的活性，參與細(xì)胞的生長，凋亡調(diào)控。一般認(rèn)為，SIRT1具有抗凋亡作用，是細(xì)胞存活的保護(hù)因子。在腫瘤中，可檢測到SIRT1的高表達(dá)，其可抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡［13］。近期研究指出，SIRT1可以保護(hù)百草枯導(dǎo)致的肺泡上皮細(xì)胞損傷［14］。還有研究指出，SIRT1可以緩解心肌缺血再灌注過程中的氧化損傷［15］。SIRT1抑制凋亡的機(jī)制之一為SIRT1可以結(jié)合P53的乙?；稽c(diǎn)，導(dǎo)致P53去乙?；Щ?，而后者是重要的凋亡促進(jìn)因子［16］。此外SIRT1發(fā)揮抗凋亡作用的機(jī)制還包括對FOXO轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控［17］。本研究發(fā)現(xiàn)在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，HVEC的SIRT1表達(dá)降低，提示不足的SIRT1表達(dá)可能是氧化應(yīng)激導(dǎo)致VEC損傷凋亡的原因之一。此外，本研究還關(guān)注了相關(guān)microRNA在氧化應(yīng)激處理前后的表達(dá)變化。使用t-BHP處理后，HVEC的microRNA-22水平增高，且與SIRT1的水平呈反比。更重要的是通過抑制microRNA-22的表達(dá)，SIRT1的水平得以恢復(fù)，且HVEC的凋亡減少。因此，我們認(rèn)為氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的HVEC損傷與SIRT1的表達(dá)不足有關(guān)。下調(diào)microRNA-22可通過恢復(fù)SIRT1表達(dá)抑制氧化應(yīng)激引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。

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Inhibition of microRNA-22 Could Antagonize the Injury Casedby Oxidative Stress in Vascular Endothelial Cells Via Targeting Sirt1

LI Tao1PANG Qi2LIU Yongbin11 Department of Cardiovascular，Lanzhou Petrochemical General Hospital，Lanzhou Gansu 730060，China，2 Department of Respiratory

Objective To investigate the change of SIRT1 and microRNA-22 expression in vascular endothelial cell injury induced by oxidative stress. Methods20 μmol/L t-BHP was used to induce oxidative stress injury. The proliferation and apoptosis of HUVEC under oxidative stress were detected with cell tilter blue assay and flow cytometry. The change of level SIRT1 was determined with Western blot. The level of microRNA-22 in HUVEC under oxidative stress was detected with qRT-PCR assay. The down-regulate of microRNA-22 in HUVEC，microRNA-22 inhibitor was transfected followed with cell tilter blue assay，the effect of microRNA-22 inhibition on HUVEC proliferation was observed. Results The oxidative stress caused by t-BHP could inhibit proliferation of HUVEC. Also，the level of SIRT1 decreased in HUVEC after treated with t-BHP. A high expression of microRNA-22 was observed in HUVEC under oxidative stress. Inhibition of microRNA-22 could recover the expression of SIRT1. Moreover，down-regulation of microRNA-22 could antagonize the proliferation inhibition induced by oxidative stress. Conclusion MicroRNA-22 could play a role in the HUVEC injury caused by oxidative stress via regulate SIRT1. It can be a potential therapy target for atherosclerosis.

Atherosclerosis，Oxitative stress，Vascular endothelial cell injury，MicroRNA，SIRT1

R541

A

1674-9316（2016）21-0023-04

10.3969/j.issn.1674-9316.2016.21.014

1蘭州石化總醫(yī)院心內(nèi)科，甘肅 蘭州 730060；2呼吸科 通訊作者：劉永斌，E-mail：liuybres@126.com