劉亞慶 趙 博 羅亞東 李祎南 楊 巍

(吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系,長(zhǎng)春130021)

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轉(zhuǎn)錄因子Foxp3對(duì)人肺腺癌細(xì)胞A549增殖周期的影響及機(jī)制研究

劉亞慶 趙 博 羅亞東 李祎南 楊 巍

(吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系,長(zhǎng)春130021)

目的：研究Foxp3對(duì)肺腺癌細(xì)胞A549增殖及細(xì)胞周期的影響，并探討相關(guān)調(diào)控機(jī)制。方法：采用siRNA沉默A549細(xì)胞Foxp3表達(dá)；MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期變化；RT-PCR篩選細(xì)胞周期相關(guān)checkpoint基因；免疫熒光及雙熒光素酶報(bào)告基因分析Foxp3對(duì)相關(guān)checkpoint基因調(diào)控機(jī)制。結(jié)果：沉默A549細(xì)胞Foxp3后，其增殖明顯減慢并發(fā)生G0/G1期阻滯，G1/S期checkpoint基因CCND1表達(dá)顯著降低。機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)Foxp3能直接調(diào)控CCND1表達(dá)。結(jié)論：Foxp3通過上調(diào)細(xì)胞周期G1/S期checkpoint基因CCND1表達(dá)，促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞A549增殖，從而促進(jìn)了肺腺癌發(fā)展，為肺腺癌的發(fā)生發(fā)展及治療靶點(diǎn)提供了新思路。

Foxp3；CCND1；肺腺癌；增殖；細(xì)胞周期

Foxp3(Forkhead box protein 3)是叉頭/翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，最初被發(fā)現(xiàn)表達(dá)于CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(regulatory T cells,Tregs)，是其特異的標(biāo)志物，也是維持其免疫抑制功能的關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因。在某些腫瘤中，如結(jié)腸癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胰腺癌等，外周血和腫瘤局部Foxp3+Tregs增多，能抑制多種免疫細(xì)胞的作用，促進(jìn)腫瘤免疫逃逸[1]，與腫瘤進(jìn)展及不良預(yù)后關(guān)系密切[2]。而近年研究發(fā)現(xiàn)Foxp3不僅在Tregs表達(dá)，在多種腫瘤組織和腫瘤細(xì)胞中也有表達(dá)，但是發(fā)揮的作用、與預(yù)后的關(guān)系卻不盡相同。在舌鱗狀細(xì)胞癌、肝癌、胃癌中，F(xiàn)oxp3表達(dá)與不良預(yù)后呈正相關(guān)，發(fā)揮促癌作用[3,4]；而在前列腺癌、乳腺癌中，F(xiàn)oxp3高表達(dá)者預(yù)后較好，F(xiàn)oxp3發(fā)揮抑癌作用[5,6]。惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展是多基因參與的過程，表現(xiàn)為細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)行為調(diào)節(jié)異常，這是影響患者預(yù)后的重要因素。因此，腫瘤細(xì)胞Foxp3可能改變了腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為，進(jìn)而促進(jìn)或抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展，影響患者預(yù)后。增殖是細(xì)胞的重要生命特征，在胃癌、黑色素瘤中，F(xiàn)oxp3對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響也不一致[7,8]。腫瘤細(xì)胞能夠無限增殖究其原因在于細(xì)胞周期調(diào)控紊亂，細(xì)胞周期的調(diào)控是一個(gè)精細(xì)復(fù)雜的過程，由多種蛋白共同參與。在肺腺癌中，F(xiàn)oxp3對(duì)其增殖影響尚不明確，其機(jī)制研究更是鮮有報(bào)道。因此，本課題擬以人肺腺癌細(xì)胞A549為模型，研究Foxp3對(duì)肺腺癌細(xì)胞增殖周期的影響及相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料、試劑 人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549為本課題組前期凍存。Foxp3 siRNA購于廣州銳博公司。轉(zhuǎn)染試劑Lipofecta mine 2000購于Invitrogen公司。MTT購于Sigma公司。細(xì)胞周期試劑盒、anti-Foxp3和anti-CCND1購于天津三箭公司。膠回收試劑盒和DNA抽提試劑盒購于Roche公司。pGL3螢光素酶雙報(bào)告載體質(zhì)粒以及雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購于Promega公司。限制性內(nèi)切酶KpnⅠ、BgⅢ及T4 DNA連接酶購于北京全式金公司。

1.2 方法

1.2.1 siRNA沉默肺腺癌細(xì)胞Foxp3表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞，調(diào)濃度2×105ml-1，接種于六孔板(每孔1.5 ml)，次日細(xì)胞密度達(dá)到60%～70%后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。先分別孵育轉(zhuǎn)染試劑和siRNA，再將兩者充分混合，室溫孵育20 min。吸棄原六孔板內(nèi)培養(yǎng)基，換無血清無抗生素DMEM。將上述混合溶液加入六孔板內(nèi)(siRNA終濃度50 nmol/L)，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育6 h后，吸棄培養(yǎng)上清，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。48 h后收細(xì)胞提取總RNA，RT-PCR檢測(cè)Foxp3 mRNA表達(dá)水平。

1.2.2 MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549細(xì)胞，調(diào)濃度8×104ml-1，接種于96孔板(每孔100 μl)。沉默F(xiàn)oxp3表達(dá)72 h后每孔加入10 μl MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄掉上清后加入100 μl DMSO，低速震蕩10 min，使顆粒物充分溶解，于酶標(biāo)儀波長(zhǎng)570 nm測(cè)OD值。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 沉默A549細(xì)胞Foxp3表達(dá)48 h后，胰酶消化收取細(xì)胞，調(diào)濃度1×106ml-1，70%乙醇4℃固定過夜。PBS洗滌2次后加入500 μl PI染液，室溫避光孵育30 min后上機(jī)檢測(cè)。

1.2.4 RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)基因的mRNA水平 沉默A549細(xì)胞Foxp3表達(dá)48 h后，胰酶消化收取細(xì)胞，提取總RNA，RT-PCR檢測(cè)CCND1、CCND2、CCND3、CCNE2、CCDE1、CDK2、CDK4、CDK6 mRNA表達(dá)水平。

1.2.5 免疫熒光 在24孔板中做細(xì)胞爬片，次日取出玻片用PBS洗3次，4%多聚甲醛固定15 min，PBS再清洗3次，0.5% Triton室溫打孔20 min，PBS清洗后用1% BSA封閉。加入稀釋的一抗，濕盒內(nèi)4℃過夜。次日加熒光二抗，PBST浸洗3次，濕盒中37℃孵育1 h，再用PBST浸洗3次。滴加DAPI避光孵育1～3 min染核，PBST洗去多余DAPI并吸干液體，封片后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

1.2.6 雙熒光素酶報(bào)告基因 根據(jù)http://www.geneco-poeia.com網(wǎng)站提供預(yù)測(cè)的CCND1可能的啟動(dòng)子作用區(qū)，設(shè)計(jì)引物，為了報(bào)告載體構(gòu)建簡(jiǎn)便，在引物上下游分別插入限制性內(nèi)切酶KpnI及BglII，引物由上海生工生物公司合成。上游引物為5′-GCGGTACCTCAGTCCCAGGGCAAATTCT-3′，下游引物為5′-GGCAGATCTAAACTCCCCTGTAGTCCGT-GC-3′，序列大小為1 143 bp。切膠回收PCR產(chǎn)物，在T4 DNA連接酶的作用下行連接反應(yīng)(16℃過夜)，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，篩選培養(yǎng)陽性克隆質(zhì)粒測(cè)序鑒定。

沉默A549細(xì)胞Foxp3表達(dá)24 h后，轉(zhuǎn)染pGL3-CCND1-promoter質(zhì)粒。48 h后收集細(xì)胞裂解物，用雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)pGL3-CCND1-promoter質(zhì)粒的螢光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 沉默A549細(xì)胞Foxp3表達(dá) 為干預(yù)A549細(xì)胞Foxp3表達(dá)，采用RNAi的方法將siRNANC、Foxp3siRNA1和Foxp3siRNA2分別轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞48h后，RT-PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞Foxp3表達(dá)。結(jié)果顯示：siRNA1、siRNA2兩組Foxp3表達(dá)水平明顯低于siRNANC組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。該結(jié)果表明:兩對(duì)siRNA均可特異性干擾Foxp3表達(dá)，可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，見圖1。

圖1 RT-PCR mRNA水平檢測(cè)Foxp3沉默效果Fig.1 mRNA expression of silencing Foxp3 was detected by RT-PCRNote: *.P<0.05，compared with siRNA NC group.

2.2Foxp3對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響 為研究Foxp3對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響，沉默F(xiàn)oxp3后采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。結(jié)果顯示：沉默A549細(xì)胞Foxp3后，細(xì)胞增殖明顯減慢，siRNA1、siRNA2兩組OD值分別為2.155±0.007、1.786±0.032，明顯低于siRNANC組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。該結(jié)果表明：Foxp3可以促進(jìn)A549細(xì)胞增殖，見表1、圖2。

2.3Foxp3對(duì)A549細(xì)胞周期的影響 為研究Foxp3對(duì)A549細(xì)胞周期的影響，沉默F(xiàn)oxp3后采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)A549細(xì)胞的細(xì)胞周期。結(jié)果顯示：沉默A549細(xì)胞Foxp3后，細(xì)胞發(fā)生G0/G1期阻滯，siRNA1、siRNA2兩組G0/G1期細(xì)胞比例分別為65.6%、64.6%，明顯高于siRNANC組50.5%，且S期細(xì)胞比例明顯低于siRNANC組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。該結(jié)果表明：Foxp3可以促進(jìn)A549細(xì)胞從G1期向S期轉(zhuǎn)化，見圖3。

2.4Foxp3對(duì)CCND1表達(dá)的調(diào)控 為研究Foxp3調(diào)控CCND1表達(dá)過程中的作用機(jī)制，首先采用細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)A549細(xì)胞Foxp3和CCND1的定位情況。結(jié)果顯示：在A549細(xì)胞中，部分區(qū)域出現(xiàn)了綠色熒光(代表CCND1表達(dá))及紅色熒光(代表Foxp3表達(dá))的重疊區(qū)域(黃色區(qū)域)，即CCND1與Foxp3的表達(dá)出現(xiàn)了共定位。該結(jié)果提示Foxp3與CCND1可能直接相互作用，見圖4。

GroupsOD570nmsiRNANC2.484±0.104siRNA12.155±0.007siRNA21.786±0.032

圖2 MTT檢測(cè)沉默F(xiàn)oxp3后A549增殖變化Fig.2 Proliferation of A549 after silencing Foxp3 was detected by MTTNote: *.P<0.05，compared with siRNA NC group.

2.5 G1/S期checkpoint基因的篩選 為研究Foxp3對(duì)A549細(xì)胞G1/S期checkpoint基因的影響，沉默F(xiàn)oxp3后采用RT-PCR檢測(cè)G1/S期checkpoint基因，包括CCND1、CCND2、CCND3、CCNE2、CCDE1、CDK2、CDK4、CDK6。結(jié)果顯示：沉默A549細(xì)胞Foxp3后，CCND1表達(dá)隨之降低，明顯低于siRNA NC組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。該結(jié)果表明，F(xiàn)oxp3可以促進(jìn)A549細(xì)胞G1/S期checkpoint基因CCND1表達(dá)，見圖5。

為進(jìn)一步驗(yàn)證Foxp3是否對(duì)CCND1具有直接調(diào)控作用，我們構(gòu)建了含有CCND1啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒(pGL3-CCND1-promoter)。重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切可見大小為1 143 bp的條帶，見圖6。熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果顯示：沉默A549細(xì)胞Foxp3后，CCND1啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因活性明顯降低(P<0.05)。該結(jié)果明確了Foxp3對(duì)CCND1的直接調(diào)控作用，見圖7。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)沉默F(xiàn)oxp3后A549細(xì)胞周期變化Fig.3 Cell cycle of A549 after silencing Foxp3 was detected by FCMNote: *.P<0.05，compared with siRNA NC group.

圖4 A549細(xì)胞Foxp3和CCND1的定位表達(dá)Fig.4 Expression of CCND1 and Foxp3 on A549 cell by immunofluorescences

圖5 RT-PCR檢測(cè)G1/S期checkpoint基因變化Fig.5 mRNA expression of G1/S cycle checkpoint gene was detected by RT-PCRNote: *.P<0.05，compared with siRNA NC group.

圖6 雙酶切鑒定pGL3-CCND1-promoter質(zhì)粒Fig.6 Identification of eukaryotic expression plasmids by restriction endonuclease analysisNote: M.Represents marker;1.Represents pGL3-CCND1-promoter;2.Represents pGL3-CCND1-promoter PCR product after digestion.

圖7 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)Foxp3對(duì)CCND1啟動(dòng)子活性的影響Fig.7 Effect of Foxp3 on activity of CCND1 promoters was detected by dual-luciferase reporter gene assayNote: *.P<0.05，compared with siRNA NC group.

3 討論

轉(zhuǎn)錄因子Foxp3是Tregs特異的標(biāo)志物及細(xì)胞發(fā)育和功能的關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因[9]。一旦Tregs缺失Foxp3，其抑制功能將隨之缺失，因此，F(xiàn)oxp3是維持Tregs抑制功能所必需[10]。在腫瘤微環(huán)境中，Tregs也發(fā)揮著免疫抑制作用，參與了腫瘤免疫逃逸[11,12]，去除Tregs可以誘導(dǎo)抗腫瘤免疫，因此，Tregs是介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸的關(guān)鍵細(xì)胞。最初人們認(rèn)為Foxp3僅表達(dá)于淋巴細(xì)胞，而近年來越來越多的研究發(fā)現(xiàn)Foxp3在多種腫瘤組織及細(xì)胞中也有表達(dá)，高表達(dá)Foxp3的腫瘤病人一般預(yù)后較差[13,14]。但Foxp3在不同腫瘤中發(fā)揮的作用也不盡相同，并且相關(guān)機(jī)制研究較少。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)Foxp3在人非小細(xì)胞肺腺癌中高表達(dá)，并與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期密切相關(guān)[15]。因此，本研究以人肺腺癌細(xì)胞A549為模型，研究Foxp3在肺腺癌中的作用及相關(guān)機(jī)制。

腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵之一在于腫瘤細(xì)胞的無限增殖，其本質(zhì)就是細(xì)胞周期調(diào)控紊亂。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)oxp3通過促進(jìn)細(xì)胞G1期向S轉(zhuǎn)化從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。因此，F(xiàn)oxp3在肺腺癌中發(fā)揮促腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)作用，并與腫瘤細(xì)胞周期調(diào)控紊亂有密切關(guān)系。細(xì)胞周期的調(diào)控是一個(gè)精細(xì)的生物學(xué)過程，有一個(gè)復(fù)雜的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。細(xì)胞周期進(jìn)程主要由細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(Cyclin-dependent kinase,CDK)和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制物(Cyclin-dependent kinase inhibitor,CDKI)驅(qū)動(dòng)[16]，在G0/G1、G2/M兩個(gè)關(guān)鍵性限制點(diǎn)進(jìn)行調(diào)控。其中，cyclin和CDK為細(xì)胞周期正調(diào)控蛋白，CDKI為負(fù)調(diào)控蛋白。G0/G1期轉(zhuǎn)變標(biāo)志DNA合成開始，G2/M期轉(zhuǎn)變標(biāo)志有絲分裂開始，其中G1期向S期轉(zhuǎn)變更為重要。

本研究中我們發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxp3可以促進(jìn)A549細(xì)胞G1/S期checkpoint基因CCND1表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞從G1期向S期轉(zhuǎn)化。CCND1是細(xì)胞周期調(diào)控蛋白家族的重要成員，屬于細(xì)胞周期素cyclin D家族，正向調(diào)控G0/G1期限制點(diǎn)，推動(dòng)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，開始合成DNA，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的增殖過程[17]。CCND1的表達(dá)、激活、在核內(nèi)的聚集全都發(fā)生在G1中期[18]。CCND1最初被發(fā)現(xiàn)于甲狀旁腺癌，是一種原癌基因，在乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌等多種腫瘤中通過基因擴(kuò)增、基因重排及突變導(dǎo)致過表達(dá)[19-21]。腫瘤細(xì)胞CCND1過表達(dá)可縮短G1期，促進(jìn)細(xì)胞從G1期向S期轉(zhuǎn)化，加速細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)細(xì)胞分裂，引起細(xì)胞周期調(diào)控紊亂，導(dǎo)致細(xì)胞增殖異常，從而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生發(fā)展[22]。在舌鱗狀細(xì)胞癌、乳腺癌等腫瘤中，CCND1對(duì)于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后、提高診斷陽性率均有重要意義[23-25]。但在肺腺癌中，CCND1與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及在肺腺癌中的表達(dá)情況一直存在爭(zhēng)議[26]。本研究中利用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)了Foxp3可直接與CCND1啟動(dòng)子結(jié)合，促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄，引起細(xì)胞周期調(diào)控紊亂，加速細(xì)胞周期進(jìn)程，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞無限增殖。這與CCND1在乳腺癌、甲狀腺癌、膀胱癌等腫瘤中發(fā)揮促癌作用的結(jié)果是一致的。但Foxp3與CCND1具體的結(jié)合位點(diǎn)還需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

基于上述研究結(jié)果，我們證實(shí)了在人肺腺癌中，腫瘤細(xì)胞Foxp3可直接與CCND1啟動(dòng)子結(jié)合，促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄，引起細(xì)胞周期調(diào)控紊亂，促進(jìn)細(xì)胞從G1期向S期轉(zhuǎn)化，加速細(xì)胞周期進(jìn)程，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞無限增殖促進(jìn)其發(fā)展。以細(xì)胞周期調(diào)控分子為靶點(diǎn)的腫瘤治療已成為一個(gè)研究熱點(diǎn)，F(xiàn)oxp3通過CCND1調(diào)控細(xì)胞周期影響細(xì)胞增殖可為腫瘤治療提供新思路。

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[收稿2015-12-15]

(編輯 許四平)

Effect and mechanism of transcription factor Foxp3 on proliferation and cell cycle of human lung adenocarcinoma cell A549

LIU Ya-Qing,ZHAO Bo,LUO Ya-Dong,LI Yi-Nan，YANG Wei.Department of Immunology,Basic Medical College,Jilin University,Changchun 130021,China

Objective:To investigate the effect and mechanism of transcription factor Foxp3 on the proliferation and cell cycle of human lung adenocarcinoma cell line A549.Methods: We knocked down the expression of Foxp3 using siRNA.Foxp3 inhibition was detected by RT-PCR.Cell proliferation was detected by MTT.Cell cycle of A549 cells were detected by flow cytometry after the transfection of siRNA.Cell cycle-related checkpoint genes were filtered by RT-PCR.The regulation of Foxp3 on cell cycle-related checkpoint genes were detected by immunofluorescence and dual-luciferase reporter assay system.Results: The proliferation of A549 cells were inhibited after silencing Foxp3,and A549 cells were arrested in G0/G1cycle.G1/S cycle checkpoint gene CCND1 was down regulated.Mechanism research show that Foxp3 can regulate the expression of CCND1 directly.Conclusion: Foxp3 can promote the proliferation of A549 cell line by up regulating G1/S cycle checkpoint gene CCND1.This provides a new target for the therapeutic targets of lung adenocarcinoma.

Foxp3;CCND1;Lung adenocarcinoma;Proliferation;Cell cycle

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.04.009

劉亞慶(1990年-)，女，碩士，主要從事腫瘤免疫學(xué)研究，E-mail：yqliu13@jlu.edu.cn。

及指導(dǎo)教師：李祎南(1988年-)，女，博士，主要從事腫瘤免疫研究，E-mail：liyn13@mails.jlu.edu.cn。 楊 巍(1980年-)，女，博士，副教授，主要從事免疫耐受方面的研究，E-mail:ywei@jlu.edu.cn。

R730.3

A

1000-484X(2016)04-0490-05