張麗娜 王 爽 劉澤媛 張 麗 李 玲 胡 明 王 斌

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，青島266071)

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四種中藥單體作為腫瘤細(xì)胞疫苗佐劑的體外篩選研究

張麗娜 王 爽 劉澤媛 張 麗 李 玲 胡 明 王 斌

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，青島266071)

目的：初步從細(xì)胞水平檢測(cè)原花青素、天麻素、黃芩素、芹菜素四種中藥單體對(duì)抗原提呈細(xì)胞RAW264.7和DC2.4的免疫刺激活性，為腫瘤細(xì)胞疫苗佐劑篩選和應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。方法：以LPS作為陽性對(duì)照，不同種類、不同濃度的中藥單體分別刺激RAW264.7和DC2.4細(xì)胞系，48 h后用抗體染色，通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)兩種細(xì)胞表面CD80、CD86、MHCⅠ、MHCⅡ分子的表達(dá)量。結(jié)果：實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示不同種類、不同濃度的中藥單體分別刺激RAW264.7和DC2.4細(xì)胞后，細(xì)胞表面CD80、CD86、MHCⅠ、MHCⅡ分子不同程度表達(dá)上調(diào)，原花青素和黃芩素在細(xì)胞水平具有較強(qiáng)的免疫刺激活性。結(jié)論：原花青素、黃芩素是兩種具有潛在應(yīng)用價(jià)值的腫瘤細(xì)胞疫苗佐劑。

中藥單體；原花青素；黃芩素；免疫活性；篩選；佐劑

惡性腫瘤是當(dāng)前威脅人類生命健康的主要疾病之一，其發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢(shì)[1-3]。由于腫瘤具有易侵襲轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的生物學(xué)特性，使傳統(tǒng)的手術(shù)、放療和化療效果比較局限[3，4]。在腫瘤治療中，疫苗免疫已經(jīng)成為一種新興的防治方法，在患者體內(nèi)注射腫瘤疫苗，可以達(dá)到有效減輕患者病情并防治高危個(gè)體癌癥復(fù)發(fā)的效果，由于腫瘤疫苗治療無明顯的毒副作用，使得腫瘤治療性疫苗成為疫苗研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)[5-7]。

免疫佐劑通過物理或化學(xué)的方式非特異性地與特異性免疫原結(jié)合，從而激活先天性免疫應(yīng)答、增強(qiáng)免疫系統(tǒng)對(duì)抗原的提呈作用、延長(zhǎng)抗原在機(jī)體內(nèi)的存在時(shí)間以及維持抗原對(duì)免疫系統(tǒng)的持續(xù)激活等[8]，疫苗佐劑對(duì)于增強(qiáng)疫苗的免疫效果具有重要作用。近年來佐劑發(fā)展非常迅速，越來越多的物質(zhì)被發(fā)現(xiàn)有佐劑作用[8-14]，因此佐劑的迅速發(fā)展為腫瘤疫苗的發(fā)展提供了更大機(jī)遇。

中藥有效成分在疫苗佐劑中應(yīng)用廣泛，可與疫苗起協(xié)同作用，能影響和調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能，具有多方面的免疫活性。因其毒副作用小、安全性高、不易產(chǎn)生依賴性等特點(diǎn)，被認(rèn)為是理想的免疫調(diào)節(jié)劑，已成為疫苗佐劑研究的一個(gè)熱點(diǎn)[15-17]。本文從細(xì)胞水平分別檢測(cè)原花青素、天麻素、黃芩素、芹菜素四種中藥單體對(duì)RAW264.7和DC2.4細(xì)胞系的免疫刺激活性，從而為腫瘤細(xì)胞疫苗佐劑的研發(fā)提供研究思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞、培養(yǎng)基及藥物 RAW264.7細(xì)胞系購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞資源中心，DC2.4細(xì)胞系由復(fù)旦大學(xué)王賓教授(醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)教育部/衛(wèi)生部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)惠贈(zèng)，分別培養(yǎng)在含有10%胎牛血清(Gibco)的DMEM(HyClone)和RPMI1640(HyClone)培養(yǎng)基中，并常規(guī)培養(yǎng)于含有5% CO2的37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱中；LPS購自Sigma公司；原花青素、天麻素、黃芩素、芹菜素(標(biāo)準(zhǔn)品)購自大連美侖生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 試劑及儀器 流式抗體PE anti-mouse H-2Kb(MHCⅠ)，PE anti-mouse I-A/I-E(MHCⅡ)，PE anti-mouse CD80，PE anti-mouse CD86均購自Biolegend公司；-86超低溫冰箱(SANYO，日本)；細(xì)胞培養(yǎng)箱(北京五洲東方科技發(fā)展有限公司)；SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司)；冰箱(青島澳柯瑪集團(tuán))；OLYMPUS倒置顯微鏡；Guava Soft流式細(xì)胞儀。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組 使用無菌雙蒸水溶解LPS、原花青素和天麻素，用甲醇溶解黃芩素，用DMSO溶解芹菜素，分別將濃度調(diào)整為1 mg/ml。采用倍比稀釋法將1 mg/ml原花青素用無血清培養(yǎng)基分別稀釋成10、20、40、80 μg/ml 4個(gè)濃度梯度，將1 mg/ml天麻素用無血清培養(yǎng)基分別稀釋成15、30、60、120 μg/ml 4個(gè)濃度梯度，將1 mg/ml黃芩素和芹菜素用無血清培養(yǎng)基分別稀釋成25、50、100、200 μg/ml 4個(gè)濃度梯度，將1 mg/ml的LPS用無血清培養(yǎng)基稀釋成 6 μg/ml。制備RAW264.7和DC2.4細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1.5×106ml-1，RAW264.7和DC2.4細(xì)胞分別鋪96孔板，每孔100 μl，24 h后細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)棄掉舊培養(yǎng)液，每孔加入100 μl含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基。加入20 μl不同種類、不同濃度的中藥單體作為藥物處理組，加入20 μl 6 μg/ml的LPS作為陽性對(duì)照組，加入20 μl含10%胎牛血清的培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照組，每孔溶液終體積為120 μl，每組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.2.2 四種中藥單體對(duì)RAW264.7和DC2.4.7細(xì)胞免疫刺激活性的檢測(cè) 上述96孔細(xì)胞培養(yǎng)板做好標(biāo)記之后，置于含有5% CO2的37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；細(xì)胞加藥處理48 h后，細(xì)胞用PE anti-mouse H-2Kb(MHCⅠ)，PE anti-mouse I-A/I-E(MHCⅡ)，PE anti-mouse CD80，PE anti-mouse CD86染色( 每100 μl每106個(gè)細(xì)胞≤1.0 μg)，于4°C避光染色30 min；用PBS清洗一次，棄上清，每孔加300 μl PBS重懸并分別收集于1.5 ml離心管中，用Guava Soft流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 原花青素對(duì)RAW264.7和DC2.4細(xì)胞有較強(qiáng)的免疫刺激活性 與陰性對(duì)照相比，80μg/ml的原花青素作用于RAW264.7細(xì)胞后，細(xì)胞表面CD80、CD86、MHCⅡ的表達(dá)量顯著增加，40μg/ml和20μg/ml的原花青素只對(duì)CD80的表達(dá)量有顯著作用，原花青素對(duì)RAW264.7細(xì)胞MHCⅠ表達(dá)沒有顯著作用；而原花青素作用于DC2.4細(xì)胞后，80μg/ml和40μg/ml的原花青素對(duì)CD80、CD86、MHCⅠ、MHCⅡ表達(dá)都有顯著作用，10μg/ml的原花青素只對(duì)CD86有顯著的免疫刺激活性，其他濃度差異不顯著，原花青素對(duì)兩種細(xì)胞系的免疫刺激活性隨著濃度的增加呈上升趨勢(shì)，對(duì)比數(shù)據(jù)得出80μg/ml比40μg/ml免疫效果更顯著，即篩選出原花青素對(duì)RAW264.7和DC2.4細(xì)胞有較強(qiáng)的免疫刺激活性的濃度為80μg/ml(如圖1)。

2.2 天麻素對(duì)RAW264.7和DC2.4細(xì)胞有免疫刺激活性 與陰性對(duì)照相比，天麻素作用于RAW264.7細(xì)胞后，4個(gè)濃度對(duì)RAW264.7細(xì)胞表面CD86都有相當(dāng)顯著的免疫刺激活性，120μg/ml的天麻素對(duì)細(xì)胞表面CD80、CD86、MHCⅠ的表達(dá)有顯著作用，60μg/ml的天麻素只對(duì)CD86、MHCⅠ的表達(dá)量有顯著作用，但天麻素對(duì)RAW264.7細(xì)胞MHCⅡ表達(dá)并無顯著作用；而作用于DC2.4細(xì)胞后，120μg/ml的天麻素對(duì)MHCⅡ有極顯著刺激活性，30μg/ml的天麻素對(duì)CD86有極顯著刺激活性，15μg/ml的天麻素對(duì)CD80、CD86有極顯著的免疫刺激活性，其他濃度差異不顯著，天麻素的4個(gè)濃度對(duì)細(xì)胞免疫刺激活性沒有明顯規(guī)律，對(duì)比數(shù)據(jù)得出120μg/ml比其他3個(gè)濃度激活了更多的細(xì)胞表面標(biāo)志，即天麻素對(duì)RAW264.7和DC2.4細(xì)胞有較強(qiáng)的免疫刺激活性的濃度為120μg/ml(如圖2)。

2.3 黃芩素對(duì)RAW264.7和DC2.4細(xì)胞有極強(qiáng)的免疫刺激活性 與陰性對(duì)照相比，黃芩素作用于RAW264.7細(xì)胞后，200、100和50μg/ml3個(gè)濃度對(duì)細(xì)胞表面CD80、MHCⅠ、MHCⅡ的表達(dá)有極顯著作用，25μg/ml的黃芩素只對(duì)CD80的表達(dá)量有極顯著作用，黃芩素對(duì)RAW264.7細(xì)胞CD86表達(dá)沒有顯著作用；而作用于DC2.4細(xì)胞后，4個(gè)濃度對(duì)CD80、MHCⅠ、MHCⅡ表達(dá)量都有極顯著作用，50μg/ml和25μg/ml的黃芩素對(duì)CD86表達(dá)沒有顯著作用，黃芩素對(duì)兩種細(xì)胞系的免疫刺激活性隨著濃度的增加呈上升趨勢(shì)，對(duì)比200、100μg/ml激活的細(xì)胞表面標(biāo)志，得出100μg/ml就有極顯著的免疫刺激活性，即篩選出黃芩素對(duì)RAW264.7和DC2.4細(xì)胞有較強(qiáng)的免疫刺激活性較好的濃度為100μg/ml(如圖3)。

2.4 芹菜素對(duì)RAW264.7和DC2.4細(xì)胞有較強(qiáng)的免疫刺激活性 與陰性對(duì)照相比，芹菜素作用于RAW264.7細(xì)胞后，4個(gè)濃度對(duì)細(xì)胞表面CD80、CD86都有極顯著的免疫刺激活性，200、100μg/ml的芹菜素對(duì)MHCⅠ、MHCⅡ的表達(dá)有顯著增強(qiáng)作用，其他兩個(gè)濃度對(duì)MHCⅠ、MHCⅡ表達(dá)沒有顯著作用；而芹菜素作用于DC2.4細(xì)胞后，4個(gè)濃度對(duì)細(xì)胞表面MHCⅡ表達(dá)量都有極顯著作用，另外，200、100μg/ml的芹菜素對(duì)CD80、MHCⅠ也有顯著的免疫刺激活性，25μg/ml的芹菜素對(duì)MHCⅠ的表達(dá)有顯著增強(qiáng)作用，4個(gè)濃度對(duì)CD86表達(dá)沒有顯著作用，芹菜素對(duì)兩種細(xì)胞系的免疫刺激活性隨著濃度的增加基本呈上升趨勢(shì)，對(duì)比數(shù)據(jù)得出200μg/ml與100μg/ml具有較強(qiáng)的免疫刺激活性，而且200μg/ml的免疫刺激活性更顯著，即篩選出芹菜素對(duì)RAW264.7和DC2.4細(xì)胞有較強(qiáng)的免疫刺激活性的濃度為200μg/ml(如圖4)。

圖1 原花青素和LPS刺激RAW264.7和DC2.4細(xì)胞Fig.1 Effects of procyanidin and LPS on RAW264.7 and DC2.4 activation Note:Macrophage line RAW264.7 and DC line DC2.4 were treated with LPS(6 μg/ml) as positive control or procyanidin(10，20，40，80 μg/mL) for 48 h and cells were immunostained for CD80,CD86,MHCⅠ and MHCⅡ and analyzed by FACS.

圖2 天麻素和LPS刺激RAW264.7和DC2.4細(xì)胞Fig.2 Effects of gastrodin and LPS on RAW264.7 and DC2.4 activationNote:Macrophage line RAW264.7 and DC line DC2.4 were treated with LPS(6 μg/ml) as positive control or gastrodin(15，30，60，120 μg/ml) for 48 h and cells were immunostained for CD80,CD86,MHCⅠ and MHCⅡ and analyzed by FACS.

圖3 黃芩素和LPS刺激RAW264.7和DC2.4細(xì)胞Fig.3 Effects of baicalein and LPS on RAW264.7 and DC2.4 activation Note:Macrophage line RAW264.7 and DC line DC2.4 were treated with LPS(6 μg/ml) as positive control or baicalein(25，50，100，200 μg/mL) for 48 h and cells were immunostained for CD80,CD86,MHCⅠ and MHCⅡ and analyzed by FACS.

圖4 芹菜素和LPS刺激RAW264.7和DC2.4細(xì)胞Fig.4 Effects of apigenin and LPS on RAW264.7 and DC2.4 activationNote:Macrophage line RAW264.7 and DC line DC2.4 were treated with LPS(6 μg/ml) as positive control or apigenin(25，50，100，200 μg/ml) for 48 h and cells were immunostained for CD80,CD86,MHCⅠ and MHCⅡ and analyzed by FACS.

圖5 四種中藥單體和LPS刺激RAW264.7細(xì)胞和DC2.4細(xì)胞Fig.5 Effects of four kinds of Chinese herbal monomer and LPS on RAW264.7 and DC2.4 activationNote:Macrophage line RAW264.7 and DC line DC2.4 were treated with LPS as positive control or four kinds of Chinese herbal monomer for 48 h and cells were immunostained for CD80,CD86,MHCⅠ and MHCⅡ and analyzed by FACS.

2.5 原花青素和黃芩素是具有潛在應(yīng)用價(jià)值的腫瘤細(xì)胞疫苗佐劑 根據(jù)以上結(jié)論得出對(duì)兩種細(xì)胞系都有較強(qiáng)免疫刺激活性的最佳濃度的中藥單體分別是80μg/ml的原花青素，120μg/ml的天麻素，100μg/ml的黃芩素和200μg/ml的芹菜素。與陰性對(duì)照相比，四種中藥作用于RAW264.7細(xì)胞后，原花青素對(duì)CD80、CD86、MHCⅡ有顯著的免疫刺激活性，天麻素對(duì)CD80、CD86、MHCⅠ有顯著的免疫刺激活性，黃芩素對(duì)CD80、MHCⅠ、MHCⅡ有顯著的免疫刺激活性；芹菜素對(duì)CD80、CD86、MHCⅠ、MHCⅡ都有顯著的免疫刺激活性；四種中藥作用于DC2.4細(xì)胞后，原花青素對(duì)CD80、CD86、MHCⅠ、MHCⅡ四種細(xì)胞表面標(biāo)志都有極其顯著的免疫刺激活性，天麻素只對(duì)MHCⅡ有極其顯著的免疫刺激活性，黃芩素對(duì)CD80、MHCⅠ、MHCⅡ有極其顯著的免疫刺激活性，芹菜素對(duì)CD80、MHCⅠ、MHCⅡ有極其顯著的免疫刺激活性，即四種中藥天麻素的免疫刺激活性最弱。在加藥處理及細(xì)胞培養(yǎng)過程中，通過顯微鏡觀察，加入芹菜素的細(xì)胞培養(yǎng)基中有大量黑褐色斑點(diǎn)，推測(cè)可能為芹菜素稀釋于DMSO后不溶于培養(yǎng)基，在應(yīng)用過程中受限。綜合以上分析四種中藥對(duì)RAW264.7細(xì)胞和DC2.4細(xì)胞的免疫刺激活性，得出原花青素和黃芩素免疫激活效果最好，是兩種具有潛在應(yīng)用價(jià)值的腫瘤細(xì)胞疫苗佐劑(如圖5、6)。

圖6 四種中藥單體和LPS刺激DC2.4細(xì)胞，24 h后觀察細(xì)胞形態(tài)Fig.6 Effects of LPS and four kinds of Chinese herbal monomer on DC2.4 cell line activation,morphology of different groups was observed at 24 h after activation

3 討論

隨著腫瘤發(fā)生率的不斷增加，各種治療方法層出不窮，其中免疫治療能夠提高腫瘤細(xì)胞的免疫原性和對(duì)效應(yīng)細(xì)胞殺傷的敏感性，激發(fā)和增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤免疫應(yīng)答，并應(yīng)用免疫細(xì)胞和效應(yīng)分子輸注宿主體內(nèi)，協(xié)同機(jī)體免疫系統(tǒng)殺傷腫瘤、抑制腫瘤生長(zhǎng)從而引起了越來越多的關(guān)注，多種文獻(xiàn)報(bào)道疫苗療法對(duì)很多腫瘤均有一定的治療效果[18-20]。在瘤細(xì)胞疫苗治療中，由于腫瘤特異性抗原表達(dá)低下，經(jīng)常無法有效地誘導(dǎo)抗腫瘤免疫應(yīng)答，因此在全細(xì)胞瘤苗治療中佐劑是最關(guān)鍵的成份，應(yīng)用最早、當(dāng)前應(yīng)用最廣泛的是卡介苗或其衍生物，但引起組織壞死、潰瘍等不可避免的副作用，阻礙了其臨床應(yīng)用[21]，因此尋找開發(fā)新的、無毒副作用的新型佐劑成為亟待解決的問題。

近年來中藥現(xiàn)代化的應(yīng)用研究成為熱點(diǎn)，由于其毒副作用小、安全性高、不易產(chǎn)生依賴性等特點(diǎn)，越來越多的中藥被發(fā)現(xiàn)有佐劑作用[22,23]。本文以LPS作為陽性對(duì)照，不同種類、不同濃度的中藥單體刺激RAW264.7和DC2.4細(xì)胞系，流式檢測(cè)細(xì)胞表面CD80、CD86、MHCⅠ、MHCⅡ表達(dá)量變化;實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示四種中藥對(duì)RAW264.7和DC2.4細(xì)胞表面CD80、CD86、MHCⅠ、MHCⅡ不同程度表達(dá)上調(diào)，原花青素和黃芩素在細(xì)胞水平具有較強(qiáng)的免疫刺激活性。本文研究為原花青素、黃芩素作為潛在的腫瘤細(xì)胞疫苗佐劑奠定了細(xì)胞水平的理論基礎(chǔ)，中藥原花青素和黃芩素是具有潛在應(yīng)用價(jià)值的腫瘤細(xì)胞疫苗佐劑。

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[收稿2015-10-08]

(編輯 張曉舟)

Screening tumor vaccine adjuvants from four kinds of Chinese herbal monomer in vitro

ZHANG Li-Na,WANG Shuang,LIU Ze-Yuan,ZHANG Li,LI Ling,HU Ming,WANG Bin.Lab of Pathogenic Organisms,College of Medicine,Qingdao University,Qingdao 266071,China

Objective:To detect immunological effects of procyanidin,gastrodin,baicalein and apigenin on antigen presenting cells of RAW264.7 and DC2.4 and search for new tumor vaccine adjuvant.Methods: After different concentrations of four kinds of Chinese herbal monomer and LPS were used to stimulate RAW264.7 or DC2.4 cells for 48 hours,cells were obtained and stained with CD80,CD86,MHCⅠ and MHCⅡ antibody.Then protein expression levels of CD80,CD86,MHCⅠ and MHCⅡ on RAW264.7 and DC2.4 cells were analyzed by flow cytometry.Results: Results showed that after 48 hours stimulated with different concentrations of four kinds of Chinese herbal monomer on RAW264.7 or DC2.4 cells,the expression levels of CD80,CD86,MHCⅠ,MHCⅡ were all up-regulated in comparison with control,procyanidin and baicalein exhibited stronger immunological stimulating activity on a cellular level.Conclusion: Procyanidin and baicalein were found having potential application value in clinical treatment as tumor vaccine adjuvants.

Chinese herbal monomers;Procyanidin；Baicalein；Immunological effects;Screening;Adjuvant

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.04.012

張麗娜(1989年-)，女，在讀碩士，主要從事腫瘤免疫學(xué)研究，E-mail：zhanglina0412@126.com。

及指導(dǎo)教師：王 斌(1962年-)，男，醫(yī)學(xué)博士，教授，博士生導(dǎo)師，泰山學(xué)者，主要從事分子病毒學(xué)與基因工程藥物的研究，E-mail：wangbin532@126.com。

R392.12

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1000-484X(2016)04-0504-05