吳姍++++虞惠貞++++任明興++++方瑩

摘要：為提高用PCR法鑒定鴨絨鵝絨的準(zhǔn)確度，提高羽絨中DNA的提取效率，優(yōu)化了DNA提取方法；同時為了便于對羽絨制品的真?zhèn)舞b別，建立了羽絨中鵝絨鴨絨等的定量計算方法。通過比較5種前處理方法和4種抽提試劑盒及其組合間的抽提效率，建立最佳的抽提程序。利用熒光PCR定量的優(yōu)勢，建立了羽絨中的鵝絨鴨絨比例定量計算的方法，并將計算得到的值與預(yù)設(shè)的混合比例加以比較。經(jīng)驗證，本研究建立的鵝絨鴨絨等定量計算方法能準(zhǔn)確反映含量變化的趨勢，可作為一種有效的輔助手段對羽絨制品進行真?zhèn)握鐒e。

關(guān)鍵詞：羽絨；DAN提??；熒光PCR；定量檢測；真?zhèn)握鐒e

我國是世界上最大的羽絨及制品的生產(chǎn)國和出口國，也是最大的消費國[1]。目前市場上羽絨產(chǎn)品主要是鵝絨、鴨絨兩大類，兩種絨在外觀上并無明顯區(qū)別，但在保暖性能上，相同含量的鵝絨要優(yōu)于鴨絨，鵝絨的價格要高于鴨絨[2]。因此出現(xiàn)了將鴨絨或其他陸禽的毛絨摻在鵝毛絨中進行銷售，以牟取暴利的現(xiàn)象。鴨、鵝毛絨的鑒別是羽毛絨檢測中重要一項，相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，如GB/T 10288—2003《羽絨羽毛檢驗方法》，F(xiàn)Z/T 80001—2002《水洗羽毛羽絨試驗》等為鵝、鴨毛絨的種類鑒定提供依據(jù)。但在日常檢測中，一方面，相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)基本上都是一些文字性說明，檢驗人員難以準(zhǔn)確掌握；另一方面，鴨、鵝毛絨以各種形式存在，羽毛分為正常和損傷兩種，羽絨主要指絨子和絨絲，絨子還分為朵絨、未成熟絨、類似絨和損傷絨等，微觀顯微結(jié)構(gòu)存在交叉、雷同現(xiàn)象，給檢驗造成了困難[3]。

陳國培等[4]設(shè)計了鴨和鵝物種特異性的引物探針，并通過建立熒光PCR的方法對鴨絨和鵝絨進行鑒定，該方法克服了顯微鏡觀察法主觀性大的缺點，可作為顯微鏡法有效的輔助檢測手段。以DNA為目標(biāo)檢測物的PCR方法，其前期DNA的提取質(zhì)量直接關(guān)系到整個檢測過程的成敗。該文獻報道使用SDS-異硫氰酸胍-β-巰基乙醇的提取方法能滿足檢測的需求，但該方法比較耗時費力，整個提取步驟僅水浴就耗時6個小時，而DNA還需要沉淀過夜進行收集。除此以外，關(guān)于從羽絨制品中提取DNA的方法則鮮有報道。為提高用PCR法鑒定鴨絨鵝絨的準(zhǔn)確度，我們嘗試了不同前處理方法和不同抽提試劑盒，以提高鴨絨、鵝絨提取DNA的效率。在此基礎(chǔ)上，我們利用熒光PCR可定量的特性，建立了羽絨制品中鵝絨、鴨絨等比例的計算方法。

1 材料和方法

1.1 羽絨

羽絨樣品來自浙江中大技術(shù)進出口集團有限公司和浙江出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心微生物實驗室。在各種前處理和DNA提取方法的比較試驗中，選用了“北京白鴨絨”“波蘭白鴨絨”和“東北白鵝絨”3個樣品；在后續(xù)的羽絨樣品DNA提取和物種成分檢測試驗中所用的樣品見表1。

1.2 DNA抽提

（1）DNA抽提前的處理

在用試劑盒抽提DNA前，先用剪刀將羽絨盡可能地剪碎剪小，然后再進行以下前處理：前處理A——不再做任何前處理，直接按照試劑盒步驟進行DNA抽提；前處理B——振蕩研磨法：將剪碎的羽絨放入帶有磁珠（Φ3mm，Sigma，美國）的管子中，用振蕩研磨儀進行研磨（5500 r/min 振蕩20s，重復(fù)4～6次）；前處理C——手工液氮研磨法：將剪碎的羽絨放入研缽，加入液氮，手工研磨至細末；前處理D——振蕩研磨法+手工液氮研磨法：即經(jīng)過振蕩研磨處理后的樣品，再用液氮研磨處理；前處理E——機器液氮研磨法：使用冷凍研磨儀進行研磨，研磨程序設(shè)置為：研磨循環(huán)數(shù)為1，預(yù)冷時間7min，研磨時間2min，研磨間隔時間2min，運行頻率12次/min。

經(jīng)過上述前處理的樣本各取50 mg，用DNA抽提試劑盒K1按照說明書進行抽提，最后將抽提得到的DNA溶解在50μL水中。重復(fù)3次。

將上述抽提得到的DNA，進行濃度、純度檢測，同時進行熒光PCR檢測。

（2）DNA抽提試劑盒

通過DNA濃度、純度比較和熒光PCR檢測結(jié)果比較，在A、B、C、D、E中選擇一種較理想的方法，作為統(tǒng)一的前處理的方法，在此前基礎(chǔ)上，再比較不同DNA抽提試劑盒的提取效果。各種試劑盒如下：K1試劑盒：Promega（美國）FF3750抽提試劑盒，該方法是磁珠吸附法，整個過程耗時1.5h～2h，取樣量為50 mg，最后抽提得到DNA溶解在50 μL水中。K2試劑盒：Promega（美國）DC6740抽提試劑盒，該方法是磁珠吸附法，整個過程耗時不超過2h，取樣量為50 mg，最后抽提得到DNA溶解在50 μL水中。K3試劑盒：QIAamp（美國）56304抽提試劑盒，一管取樣10 mg（試劑盒要求一次取樣量不超過10 mg），共抽提5管（5個樣），最后5個管抽提得到DNA都用同一50 μL水重復(fù)洗脫，作為一個樣品。K4試劑盒：QIAamp（美國）51304抽提試劑盒，取樣25 mg（試劑盒要求一次取樣量不超過25 mg），共抽提兩管（兩個樣），最后兩個管抽提得到的DNA都用同一50 μL水重復(fù)洗脫，作為一個樣品。

上述K3和K4方法是膜柱法，根據(jù)說明書，樣品中加入裂解液后，一般水浴分別為1h～3h和4h～6h，但為了裂解充分建議裂解過夜，我們在K3和K4的抽提過程中都采用了過夜的方法，但裂解后的抽提程序相對簡單，整個過程不超過1.5h。上述不同試劑盒抽提各重復(fù)3次。

1.3 熒光PCR反應(yīng)

對上述抽提得到的DNA進行鴨、鵝和雞等物種檢測，檢測方法參照標(biāo)準(zhǔn)SNT 2727—2010《飼料中禽源性成分檢測方法 實時熒光PCR方法》。熒光PCR擴增體系配制及擴增溫度和時間見標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

為檢測熒光PCR檢測體系的檢出限和線性范圍，對鴨和鵝肉中抽提得到的DNA進行梯度稀釋，并利用DNA濃度和Ct（Ct表示每個反應(yīng)管內(nèi)熒光信號到達設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)）值之間的相關(guān)性繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。鴨肉和鵝肉的DNA抽提方法采用前處理B和K1提取試劑盒的組合，抽提得到的兩種DNA，都統(tǒng)一調(diào)節(jié)濃度至20 ng/μL，后進行4倍梯度稀釋。變量相關(guān)性公式[5]：Ct = b·log[DNA濃度] + a，其中：b是斜率；a是截距。

1.5 混合樣的制備，以及計算鴨成分和鵝成分的計算

取波蘭白鴨絨和東北白鵝絨為材料，將鴨絨和鵝絨按不同的質(zhì)量比進行混合，后采用前處理B和K4提取試劑盒的組合進行DNA抽提。熒光PCR后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得到每個樣品中鴨和鵝的DNA濃度，計算兩者間比例，并與設(shè)置的鴨絨與鵝絨的比例進行比較。

2 結(jié)果

2.1 不同前處理對DNA質(zhì)量的影響

處理A，即羽毛絨僅做剪碎處理，該處理的DNA濃度都非常低，僅2 ng/μL左右，而OD260/OD280的值在2.4～3.0之間（見表1），說明所抽提的DNA純度較低。經(jīng)過B的磁珠研磨和C的液氮研磨處理，抽提得到的DNA濃度有所上升，平均值達到4 ng/μL左右，而OD260/OD280的值雖未達到理想的1.8，但平均值介于1.5～2.3之間，純度優(yōu)于A處理。D是B和C處理的組合，即經(jīng)過磁珠研磨和液氮研磨兩重處理；而E是通過液氮研磨儀處理的，其過程也是將樣品浸入在液氮環(huán)境中進行物理機械研磨，即集液氮處理和機械研磨于一體，且實現(xiàn)同步化。如表1所示，經(jīng)過D和E的處理，所得到的DNA濃度達到7 ng/μL左右，雖然比其他方法有所提高，但仍停留在個位數(shù)。而D和E的處理對DNA純度的提高則更加明顯，所得DNA的OD260/OD280的值都落在1.6～2.1之間，更加接近理想的1.8。

熒光PCR的結(jié)果（見表2）和測得的DNA濃度純度的結(jié)果較為吻合，表現(xiàn)為濃度純度較低的，對應(yīng)的Ct值大，若濃度純度相應(yīng)較高，得到的Ct值則相對小，即相同的樣品前處理從A到E，對應(yīng)熒光PCR測得的Ct值逐步降低，特別是在檢測北京白鴨絨和波蘭白鴨絨的鴨成分時，A處理檢測得到的Ct值在37左右，B和C在32～35之間，D和E則在30左右，陽性增強的趨勢較明顯。在檢測東北白鵝絨的鵝成分時，只有A處理的Ct值高達37.7，B和C處理的Ct值降至30左右，D和E處理的Ct值則都接近28，也充分體現(xiàn)了DNA的品質(zhì)對PCR檢測的重要性。

根據(jù)以上檢測結(jié)果，D和E的前處理往往能得到濃度和純度較高的DNA，而相應(yīng)PCR結(jié)果的陽性也較強。但D處理同時需要儀器振蕩研磨處理和人工液氮研磨處理，工序相對繁瑣，因此在后續(xù)的試驗中，不特別說明的情況下，我們選擇E處理作為統(tǒng)一的前處理方式，以此比較不同抽提試劑盒的DNA抽提性能。

此外，從不同物種的檢測結(jié)果看（表2），鴨絨和鵝絨中都沒有檢測到雞源性成分，鴨絨中只檢測到鴨源性成分，但在檢測鵝絨的時候，發(fā)現(xiàn)鵝絨中不但檢測到鵝源性DNA，還檢測到了鴨源性DNA成分，但Ct值較高在35左右。

2.2 不同抽提試劑盒對DNA質(zhì)量的影響

在前處理都相同的情況下，比較了不同試劑盒的DNA提取效率。如表3所示，K1試劑盒提取的DNA質(zhì)量與表2中對應(yīng)的值接近，即DNA濃度在7ng/μL～10ng/μL之間，OD260/OD280的值在1.5～2.0之間。K2試劑盒抽提得到的DNA，濃度有較大幅度的提升，最低的濃度也達到了19.8 ng/μL，而最高濃度則達到了28.7ng/μL，但該處理的DNA純度不高，OD260/OD280值較低，介于1.1～1.4之間，該方法雖然DNA的得率較高，但同時也未能有效去除蛋白質(zhì)、酚等的污染。K3和K4用的都是QIAamp的試劑盒，抽提得到的DNA品質(zhì)也相仿，即濃度多在10ng/μL～15 ng/μL之間，OD260/OD280值在1.6～1.9之間，雖然這兩種處理得到的DNA濃度只有K2處理的一半，但純度較高，即OD260/OD280的值都接近理想的1.8。

在隨后的熒光PCR檢測中，也證實了雖然K2處理所得到的DNA濃度較高，但檢測得到的Ct值并沒有比K3、K4處理有更多優(yōu)勢。如表4所示，K3、K4的Ct值在24～26之間，低于K2處理的26～27之間，說明與濃度一樣，DNA的純度對PCR的擴增同樣重要。而K1處理檢測到的Ct值和表2中對應(yīng)的值接近，該試劑盒的表現(xiàn)較為穩(wěn)定。

表4中熒光PCR的物種檢測結(jié)果和表3的一致，即：鴨絨中只檢測到鴨的DNA成分；鵝絨中除了檢測到鵝的DNA，還檢測到了鴨的DNA，而這次鵝絨中鴨源性成分的Ct值也達到了30左右，陽性明顯。

經(jīng)過上述試驗，我們發(fā)現(xiàn)本試驗中抽提試劑盒對DNA抽提效率的影響要大于前處理對抽提效率的影響，因此，為了簡化操作又增加了前處理A與K3、K4試劑盒的組合，即僅將羽絨剪小剪碎處理的情況下，檢測試劑盒提取效率，且K3、K4試劑盒提取時在裂解液中統(tǒng)一處理3h。提取的結(jié)果如表5所示：不進行前處理對K3試劑盒抽提得到DNA的濃度影響不大，但對純度影響較大，OD260/OD280值達到了3左右，可能存在大分子雜質(zhì)產(chǎn)生了光吸收，或存在RNA雜質(zhì)；K4抽提得到的DNA，不經(jīng)過前處理（A前處理）與經(jīng)過E前處理比較，濃度下降40%左右，表示純度的OD260/OD280值也從比較完美的1.8左右升至2.0以上。盡管如此，從熒光PCR的檢測結(jié)果看（表6），鴨絨中鴨成分的Ct值在25～27之間，鵝絨中鵝成分的Ct值在27～30之間，鵝絨中鴨成分的Ct值在31左右，雖然比對應(yīng)的經(jīng)過E處理的Ct值都有所升高，但擴增曲線陽性特征明顯（圖略），可以滿足物種鑒定的檢測需求。因此在后續(xù)的對其他樣本的檢測中，我們采用了前處理A（無前處理）和K4的組合。

2.3 對11個鴨絨、鵝絨樣本的物種成分檢測

在對其余11個樣本檢測后，發(fā)現(xiàn)即便不經(jīng)過研磨等前處理，DNA濃度在8ng/μL～14ng/μL之間，濃度尚可（見表7）。但OD260/OD280值低至1.2，或者高至2.8，偏離1.8的理想值較遠。特別是灰鴨絨和灰鵝絨，相比較白鴨絨和白鵝絨，所抽提得到的DNA的純度更低，這可能是不能有效除去灰絨的色素所導(dǎo)致。但所有抽提得到的DNA都能滿足熒光PCR檢測的需求：11個樣品熒光PCR檢測得到目標(biāo)物種的Ct值在27～31之間，灰鴨絨、灰鵝絨的Ct值高于白鴨絨、白鵝絨的Ct值，與對應(yīng)的DNA質(zhì)量相符。

對11個樣品的物種檢測發(fā)現(xiàn)，所有樣本中都未能檢測到雞源性DNA成分，鴨絨中都檢測到了鴨，鵝絨中也都檢測到了鵝，在一個鵝絨樣本中也檢測到了鴨的DNA成分。新的發(fā)現(xiàn)是，在一個鴨絨的樣本中檢測到了鵝的成分。鵝絨中檢測到了鴨，一般會懷疑以次充好，以價低的鴨絨冒充相對價高鵝絨，但鴨絨中檢測到了鵝絨，一般不會是商家有意為之，而往往是因為生產(chǎn)過程中無意識混入。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及鵝絨中鴨絨含量的計算

對從鴨肉和鵝肉中抽提得到的DNA進行4倍梯度稀釋，檢測引物探針的靈敏度，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果顯示（表8，圖1），當(dāng)DNA濃度大于等于0.005ng/μL時，鴨和鵝得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2值分別為0.9835和0.9815，都較接近0.99，理論上，該濃度以上的檢測結(jié)果較為可靠（圖1）。

按照一定的比例（表9），配制了波蘭白鴨絨和東北白鵝絨的混合樣，將混合樣的DNA進行熒光PCR檢測。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得到樣品中鴨和鵝的濃度，并計算鴨成分占樣品的比例，將計算得到的比例和最初設(shè)置的比例進行比較。如表9所示，100%的東北白鵝絨（0%鴨質(zhì)量百分比）中檢測到3.7%的鴨成分，理論上鴨質(zhì)量百分比分別為10%～50%的樣品中，分別檢測到了11.4%、20.9%、31.7%、44.3%和56.7%的鴨成分，檢測值與理論值相近，但都高于理論值。

本研究采用的東北白鵝絨是“90絨”，即保證該批鵝絨中至少90%的成分是鵝絨，其余10%可能是毛片、飛絲等其他成分，也可能是鴨絨或其他陸禽絨。統(tǒng)計了表4、表6和表9中，“100%東北白鵝絨”時檢測到的鴨的含量，得到的平均值為5.4%（表9中調(diào)整后鴨質(zhì)量百分比理論值）。假設(shè)“100%的鵝絨”中5.4%鴨成分是真實值，則之前所得到的10%～50%的鴨質(zhì)量百分比的理論值則有待調(diào)整，即原來10%的值調(diào)整后為 [（10+90×0.054）]%=14.6%，其余以此類推，調(diào)整后鴨質(zhì)量百分比理論值如表9所示。與對應(yīng)的鴨質(zhì)量百分比計算值比較發(fā)現(xiàn)，雖然兩個值并不完全相同，但也較相近，計算值和調(diào)整后的理論值的差距在-21.6%到7.6%之間，隨著鴨含量的增高，差距有所減小，計算值越靠近理論值?？偟膩碚f，本研究計算得到的鴨絨的添加量能準(zhǔn)確反映含量變化的趨勢，可作為一種有效的輔助手段在品質(zhì)鑒定時加以采用。利用本研究建立的計算方法，計算了表7中“白鵝絨”樣品中鴨的成分，發(fā)現(xiàn)鴨絨含量高達10.3%。

3 總結(jié)與討論

比較了各種前處理方法對羽絨中提取DNA的影響，得出：高強度的物理研磨，或者在有液氮條件下的研磨都有助于提高DNA的得率。因此，若實驗室具備液氮研磨儀或者振蕩研磨儀等設(shè)備，建議在抽提前進行一定的研磨處理；但若不具相關(guān)設(shè)備，手動液氮研磨耗時費力，則建議省略該步，可把重點放到選擇合適的提取試劑盒。研究發(fā)現(xiàn)，與研磨等前處理相比，DNA提取試劑盒對抽提效果影響更加明顯。結(jié)合本研究，在具備相關(guān)設(shè)備的情況下，抽提模式可選擇B/D+K3/K4（B或D加K3或K4），否則可選擇A+K3/K4的模式，一般兩種模式得到的DNA濃度都可達10 ng/μL左右，但前一種模式純度更高，因此在進行目標(biāo)物種成分熒光PCR檢測時，所得到的Ct值前者24、25左右，后者27、28左右。陳國培等[4]用SDS-異硫氰酸胍-β-巰基乙醇法提取得到的DNA濃度在20ng/μL～200ng/μL之間，明顯高于本研究得到的DNA濃度，但陳等所選用的是帶毛囊的羽絨，且真正用于提取DNA的僅僅是取樣品中的毛囊部位，本研究所采用的是隨機選取的完整羽絨，不區(qū)分是否帶有毛囊；而動物纖維中的DNA主要存在于毛囊部位，毛干中存有少量線粒體DNA[6]，因此得到的DNA濃度低于前者與取樣部位有很大關(guān)系，但本研究取樣的隨機性簡化了操作，更符合實際檢測的需求。

熒光PCR檢測結(jié)果顯示：雖然從羽絨羽毛中抽提DNA的報道不多，但也有一些類似的研究，如從鳥的羽毛基部[6]和羽枝[7]中提取DNA，從哺乳動物的毛發(fā)中提取DNA[8]，從羊絨羊毛制品中提取DNA[6]，從人的染色的頭發(fā)中提取DNA[10]等。上述研究中，邵碧英等[6]和Speller等[7]認(rèn)為合適的試劑盒可有效地從羊絨羊毛和羽毛中提取DNA；此外，上述報道中還較多地提到了Chelex 100的提取方法，認(rèn)為該方法可有效地提取哺乳動物毛發(fā)中[8]和染色頭發(fā)中[9]的DNA，該方法操作相對簡便，可在后續(xù)的研究中進行嘗試。

物種特異性檢測結(jié)果顯示，鴨絨、鵝絨中摻雜雞絨的情況在本次研究的樣本中并沒有發(fā)現(xiàn)，但有發(fā)現(xiàn)鵝絨中摻雜鴨絨和鴨絨中摻雜鵝絨的現(xiàn)象。陳國培等[4]對25個鴨絨樣品進行鴨源性和鵝源性成分的熒光PCR檢測，所有樣品都檢測到了鴨源性成分，而未檢測到鵝源性成分；由于無鵝絨樣品，因此檢測結(jié)果無法體現(xiàn)是否有摻假行為，同時也未對雞源性成分進行檢測。從經(jīng)濟角度而言，鴨絨中摻雜鵝絨，無利可圖，應(yīng)該是一種無意識的混入；鵝絨中摻雜鴨絨，是以次充好，是有經(jīng)濟驅(qū)動力的，但若摻入的量很低，則也可能是一種無意的行為，如使用相同的器具或流水線導(dǎo)致的混入。本研究進一步利用熒光PCR定量的優(yōu)勢，對同一樣本中兩種絨含量的比例進行計算，計算得到的值與預(yù)設(shè)值（表9中“鴨質(zhì)量百分比理論值”或“調(diào)整后鴨質(zhì)量百分比理論值”）接近，基本能顯現(xiàn)含量變化的趨勢。特別是當(dāng)形態(tài)學(xué)檢測存在困難時，如將幼鴨的鴨絨充當(dāng)鵝絨時，本方法可作為一種輔助檢測方法。

參考文獻：

[1]王敦洲. 我國羽絨生產(chǎn)現(xiàn)狀及外貿(mào)出口展望[J]. 水禽世界，2006（4）： 4-6.

[2]王華雄， 林德康， 付勁. 羽絨及其制品的質(zhì)量與檢驗[M]. 北京： 中國紡織出版社， 2000.

[3]朱峰， 翁春艷， 涂貌貞， 等. 我國羽絨羽毛現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中羽毛絨種類鑒定方法研究[J]. 中國纖檢， 2011（8）： 54-56.

[4]陳國培， 賴心田， 唐復(fù)潤， 等. 鴨絨及鵝絨制品實時熒光PCR鑒定方法研究[J]. 中國纖檢， 2013（12）： 60-62.

[5]Pegels N， González I， García T， etal. Avian-specific real-time PCR assay for authenticity control in farm animal feeds and pet foods. Food Chem. 2014， 1（142）：39-47.

[6]邵碧英， 林志武， 陳文炳， 等. 高效的羊絨羊毛織品DNA提取方法的建立[J]. 生物技術(shù)， 2009， 19（5）：38-39.

[7] Speller CF， Nicholas GP， Yang DY. Feather barbs as a good source of mtDNA for bird species identification in forensic wildlife investigations [J]. Investigative Genetics. 2011（2）：16-23.

[8]徐艷春， 馬立新， 白素英， 等. 應(yīng)用PCR方法通過毛發(fā)進行哺乳動物性別鑒定[J]. 東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報， 2000， 28（6）：72-77.

[9]高林林， 唐暉， 嚴(yán)江偉， 等. 染色毛干mtDNA不同提取方法的研究[J]. 中國法醫(yī)學(xué)雜志， 2006， 21（5）：284-286.

（作者單位：吳姍、虞惠貞、方瑩，浙江省檢驗檢疫科學(xué)技術(shù)研究院；任明興，紹興出入境檢驗檢疫局）