吳永潔+王元素+李莉

摘 要 通過(guò)觀測(cè)19份野生白三葉形態(tài)指標(biāo)，比較同一花序及不同海拔高度的貴州野生白三葉形態(tài)多樣性.結(jié)果表明：同一花序及不同海拔高度的貴州野生白三葉形態(tài)都存在較大差異；各指標(biāo)總變異系數(shù)從大到小為中葉面積、地上生物量、匍匐莖長(zhǎng)度、生長(zhǎng)點(diǎn)數(shù)、株高、中葉長(zhǎng)、中葉寬、生長(zhǎng)習(xí)性、有無(wú)“V”斑；不同海拔區(qū)域白三葉形態(tài)形狀居群間存在不同程度的差異.進(jìn)行聚類(lèi)統(tǒng)計(jì)顯示分類(lèi)與海拔高度沒(méi)有明顯的關(guān)系.

關(guān)鍵詞 喀斯特；貴州；白三葉；同一花序；形態(tài)多樣性

中圖分類(lèi)號(hào) S651 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1000-2537（2016）05-0038-06

Abstract By observing the shape index of 19 wild Trifolium repens， we compared the morphological diversity of the same inflorescence at different altitudes. Our results imply that the morphological diversity of 19 wild Trifolium repens on the same inflorescence at different altitudes has a markedly difference. The total coefficient variation of all above indices obeys the following order： leaf area>above-ground biomass>stolon length>growing point>height >leaf length>leaf width> growth habit>V shape stripe. Between different altitudes in Trifolium repens form shape in the group have difference degrees of variations. The clustering analysis found little correlation with the altitude origin.

Key words Karst region； Guizhou； Trifolium repens； the same inflorescence； morphological diversity

基因漂移、遺傳漂變、遺傳瓶頸、自然選擇和地方適應(yīng)性等因素，可以通過(guò)在不同時(shí)空尺度上的動(dòng)態(tài)變化來(lái)影響并改變生物適應(yīng)性和多樣化的進(jìn)程[1].目前，花粉污染、基因漂移等問(wèn)題已經(jīng)在實(shí)驗(yàn)中得到普遍證實(shí)，而大部分研究只是針對(duì)一些基礎(chǔ)性工作，如花粉傳播因素、基因漂移距離、雜交親和性等[2-5].空間分離群體之間的隔離和基因流動(dòng)的程度決定了遺傳差異、生殖隔離和物種形成的潛在能力.遺傳漂變和自然選擇都會(huì)使群體之間的差異增加，而基因流的作用會(huì)使群體之間的差異減小[5].研究同一花序水平上植物形態(tài)多樣性，可以減少以上因素的影響，使其表型性狀與其生態(tài)適應(yīng)性的研究更趨于一致.

白三葉（Trifolium repens L.）是多年生草本優(yōu)質(zhì)牧草，屬異化授粉植物，廣泛分布于世界各地，在農(nóng)牧業(yè)中地位重要.貴州是中國(guó)發(fā)育最典型的喀斯特地貌之一，不僅地勢(shì)起伏大、切割強(qiáng)、相對(duì)高度常達(dá)到300～700 m，且喀斯特廣泛發(fā)育，地貌類(lèi)型較復(fù)雜.其次，貴州具有高原峽谷地貌結(jié)構(gòu)特征，導(dǎo)致水土資源分布不平衡，形成了多種特殊的生態(tài)位.白三葉在長(zhǎng)期的演化過(guò)程中，不斷向著適應(yīng)其生境的方向進(jìn)化.本研究收集貴州省境內(nèi)19份白三葉種質(zhì)為試驗(yàn)材料，比較其不同海拔高度居群間和同一花序水平上的多樣性，為下一步選育優(yōu)質(zhì)高效白三葉新品種提供指導(dǎo).

1 材料和方法

1.1 貴州地理與氣候

試驗(yàn)在貴州貴陽(yáng)市貴州牧草推廣站溫室大棚內(nèi)進(jìn)行，種子收集于貴州省不同海拔區(qū)域.貴州全省大部分地區(qū)氣候溫和，四季分明.全省平均氣溫的最高值出現(xiàn)在7月，平均22～25 ℃；最低值出現(xiàn)在1月，平均為4～6 ℃；年平均氣溫為14～19 ℃.全年極端最高氣溫為34.0～36.0 ℃，極端最低氣溫為-6.0～-9.0 ℃.常年雨量充沛，時(shí)空分布不均.全省各地多年平均年降水量大部分地區(qū)為1 100～1 300 mm，最大值接近1 600 mm，最小值約為850 mm.一年中的大多數(shù)雨量集中在夏季.全省大部分地區(qū)年日照1 200～1 600 h，氣候特點(diǎn)是垂直方向差異較大，立體氣候明顯.

1.2 材料收集

2013年5～8月在全省范圍內(nèi)采集野生白三葉種子，有效樣本19份，見(jiàn)表1.

1.3 栽培與觀測(cè)

1.3.1 溫室栽培 2014年9月20日在貴州省牧草推廣站溫室大棚播種.從19份材料中各選取一個(gè)果實(shí)飽滿(mǎn)的花序，將來(lái)自同一花序的種子播入有32個(gè)小格的育苗培養(yǎng)盤(pán)，孔穴大小60 mm×60 mm.每小格播2粒種子，覆土1 cm，澆水.培養(yǎng)基質(zhì)為m（石英砂）∶m（細(xì)土）∶m（腐殖質(zhì)）=3∶4∶3混合而成，高壓滅菌冷卻后裝盤(pán).待長(zhǎng)出小苗后留選長(zhǎng)勢(shì)較好的一株苗用于觀察研究.

1.3.2 施肥和管理 每隔3個(gè)月施復(fù)合肥1次，每次施用量0.03 kg/m2，苗期施尿素1次，使用量折合0.012 kg/m2，及時(shí)除雜草，適時(shí)澆水.

1.3.3 測(cè)量指標(biāo) 2015年5月1日，參照《牧草種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》[6]及前人研究方法觀測(cè)V型斑紋、葉面積、株高、中葉寬、中葉長(zhǎng)、匍匐莖長(zhǎng)度、生長(zhǎng)點(diǎn)個(gè)數(shù)及地上生物量等指標(biāo).為便于分析，將非量化性狀特征進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化賦值.海拔：1=1 000 m以下，2=1 000～1 500 m，3=1 500～2 000 m，4=2 000 m以上；有無(wú)V型斑：有斑=1，無(wú)斑=2；生長(zhǎng)習(xí)性：1=直立生長(zhǎng)，2=匍匐分枝生長(zhǎng)，3=匍匐不分枝生長(zhǎng).

1.4 數(shù)據(jù)分析

用Excel和SPSS 16.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，分析不同海拔高度區(qū)域白三葉種內(nèi)、同一花序水平上各個(gè)性狀的差異程度.各形態(tài)變異性以變異系數(shù)CV表示，CV（%）=100×S/M（S為標(biāo)準(zhǔn)差，M為平均值）.用Person相關(guān)系數(shù)分析各個(gè)性狀之間的相關(guān)性，并對(duì)各個(gè)指標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)化后用算術(shù)平均法（UPGMA）聚類(lèi)分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 白三葉形態(tài)學(xué)分析

2.1.1 同一花序白三葉形態(tài)學(xué)性狀差異分析 同一花序水平上和不同種群間白三葉形態(tài)存在較大差異（表2）.總變異系數(shù)大于300%的有7個(gè)居群，其中W16總變異系數(shù)最大，高達(dá)429.74%，其次是W12，W1，W9，W6，W3，W10；最小的是W7，總變異系數(shù)為236.9%.各指標(biāo)總變異系數(shù)從大到小為中葉面積、地上生物量、匍匐莖長(zhǎng)度、生長(zhǎng)點(diǎn)數(shù)、株高、中葉長(zhǎng)、中葉寬、生長(zhǎng)習(xí)性、有無(wú)“V”斑.株高變異系數(shù)最大的是W10和W18，分別為37.93%和37.51%，W2最小，只有12.63%.地上生物量變異系數(shù)最大的是W3和W1，分別為98.48%和81.67%，W14和W7的最小，為38.31%和38.55%.匍匐莖長(zhǎng)度的變異范圍為30.95%～65.75%，變異系數(shù)最大和最小分別是W7和W3.中葉寬的變異范圍主要為10.89%～32.11%，只有居群W8的變異系數(shù)高達(dá)60.61%.中葉長(zhǎng)的變異范圍為13.33%～32.77%，變異系數(shù)最大的為W16，最小為W7.中葉面積的總變異系數(shù)比其他指標(biāo)大，其中W16，W12，W3和W6的變異系數(shù)均大于100%，最小的是W11，只有30.33%.生長(zhǎng)習(xí)性的變異范圍為0～35.33%，其中W14，W18和W19的變異系數(shù)均為0，即這幾個(gè)居群都是匍匐分枝生長(zhǎng).有無(wú)“V”形斑中只有W1，W5，W11，W13和W19發(fā)生了變異，其余居群全都有“V”斑.生長(zhǎng)點(diǎn)個(gè)數(shù)最大變異是W1，為64.09%，其次是W16，W9，W12和W10，最小的是W2，僅為0.75%.

2.1.2 不同海拔高度白三葉形態(tài)學(xué)數(shù)量性狀分析 不同海拔區(qū)域白三葉形態(tài)形狀居群間存在顯著差異，見(jiàn)表3.總體上，隨著海拔的提升，白三葉植株越來(lái)越高，生長(zhǎng)點(diǎn)數(shù)越來(lái)越多，地上生物量也越來(lái)越大；而匍匐莖長(zhǎng)度、中葉寬、中葉長(zhǎng)和中葉面積則隨著海拔的提升而增大，高于2 000 m的區(qū)域則有所減小.在低于1 000 m的區(qū)域，匍匐莖長(zhǎng)度的變異系數(shù)最大，高達(dá)102.87%，其次是地上生物量、中葉面積，最小的是中葉寬，僅為25.49%.在1 000～1 500 m區(qū)域，變異范圍為21.43%～80.46%，最大的為匍匐莖長(zhǎng)度，其次是地上生物量、生長(zhǎng)點(diǎn)個(gè)數(shù)、中葉面積，最小的是中葉寬.在1 500～2 000 m區(qū)域，變異范圍是21.29%～49.62%，其中變異最大的為地上生物量，其次是中葉面積，中葉寬變異最小.在大于2 000 m的區(qū)域，匍匐莖長(zhǎng)度的變異系數(shù)最大，為61.37%，其次是地上生物量、中葉面積、株高，最小為中葉長(zhǎng)，僅為23.21%.

2.2 形態(tài)學(xué)形狀相關(guān)性分析

白三葉的株高與地上生物量、匍匐莖長(zhǎng)度、中葉寬、中葉長(zhǎng)、中葉面積、生長(zhǎng)習(xí)性及生長(zhǎng)點(diǎn)數(shù)呈極顯著相關(guān)性（見(jiàn)表4），與有無(wú)“V”形斑和海拔高度無(wú)顯著相關(guān)；地上生物量與匍匐莖長(zhǎng)度、中葉寬、中葉長(zhǎng)、中葉面積及生長(zhǎng)習(xí)性呈極顯著相關(guān)，與海拔高度呈顯著相關(guān)；匍匐莖長(zhǎng)度與生長(zhǎng)點(diǎn)數(shù)極顯著相關(guān)；中葉寬與中葉長(zhǎng)、中葉面積、生長(zhǎng)習(xí)性及生長(zhǎng)點(diǎn)數(shù)呈極顯著相關(guān)；中葉長(zhǎng)與中葉面積、生長(zhǎng)點(diǎn)數(shù)及生長(zhǎng)習(xí)性呈極顯著相關(guān)；中葉面積與生長(zhǎng)習(xí)性及生長(zhǎng)點(diǎn)數(shù)極顯著相關(guān)；生長(zhǎng)習(xí)性與生長(zhǎng)點(diǎn)數(shù)呈極顯著相關(guān)；生長(zhǎng)點(diǎn)數(shù)與海拔呈極顯著相關(guān)性.即隨海拔的提高，地上生物量也隨之增大，生長(zhǎng)習(xí)性有由直立生長(zhǎng)到匍匐分枝到匍匐不分枝生長(zhǎng)的趨勢(shì).

2.3 基于白三葉形態(tài)性狀的聚類(lèi)分析

根據(jù)貴州野生白三葉的形態(tài)鑒定數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類(lèi)分析，在歐氏距離為14.5截距處，可將19份白三葉劃分為3個(gè)聚類(lèi)（圖1），3個(gè)聚類(lèi)性狀平均值見(jiàn)表5.第Ⅰ類(lèi)包括8份材料，平均株高最矮，地上生物量、匍匐莖長(zhǎng)度、中葉寬、中葉長(zhǎng)、中葉面積和生長(zhǎng)點(diǎn)數(shù)的平均值最小，只有少數(shù)無(wú)“V”形斑點(diǎn)；第Ⅱ類(lèi)包括10份材料，其生長(zhǎng)點(diǎn)數(shù)最多，其余性狀指標(biāo)的平均值介于第Ⅰ、Ⅲ類(lèi)之間，少數(shù)無(wú)“V”形斑點(diǎn)，大多是匍匐分枝生長(zhǎng)；第Ⅲ類(lèi)只有材料7（匯川區(qū)董公市鎮(zhèn)，987 m）獨(dú)自成一類(lèi)，除匍匐莖長(zhǎng)度最短外，生長(zhǎng)點(diǎn)數(shù)介于第Ⅰ、Ⅱ類(lèi)之間，全部有“V”形斑點(diǎn)，均匍匐分枝生長(zhǎng)，其余形狀指標(biāo)的平均值均大于第Ⅰ、Ⅱ類(lèi).由此可知，聚類(lèi)分組與海拔高度沒(méi)有明顯的關(guān)系.

3 討論與結(jié)論

3.1 巖溶地區(qū)不同海拔野生白三葉同一花序形態(tài)多樣性

種質(zhì)資源是生物遺傳變異和生物多樣性遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)，運(yùn)用形態(tài)學(xué)標(biāo)記研究植物外部形態(tài)，受基因及所處生態(tài)環(huán)境的共同影響.目前，關(guān)于開(kāi)花植物花序內(nèi)變異原因的研究有很多[7]，有研究證明，對(duì)不同生態(tài)環(huán)境下的同種植物的形態(tài)學(xué)研究，可以了解環(huán)境對(duì)基因表達(dá)的影響[8]，而不同海拔區(qū)域帶來(lái)的環(huán)境差異會(huì)使各類(lèi)昆蟲(chóng)的活動(dòng)受到限制或促進(jìn)，導(dǎo)致不同海拔地區(qū)訪花者種類(lèi)和訪問(wèn)比例的差異[9].在同一花序水平上研究不同海拔區(qū)域白三葉表型特征，既可以減少基因漂移、花粉污染等外部影響，還可了解由海拔帶來(lái)的環(huán)境差異對(duì)其形態(tài)的影響，為下一步研究工作提供更精密的數(shù)據(jù).本研究結(jié)果顯示，貴州19份野生白三葉同一花序水平上總變異系數(shù)大于300%的有7個(gè)居群，其中W16總變異系數(shù)最大，無(wú)論是居群內(nèi)還是居群間貴州白三葉形態(tài)差異都比新疆[10]白三葉的大；各指標(biāo)中總變異系數(shù)為最大的是中葉面積，其次是地上生物量、匍匐莖長(zhǎng)度、生長(zhǎng)點(diǎn)數(shù)、株高，說(shuō)明其可塑性較大.貴州因地勢(shì)起伏較大，生境復(fù)雜，蘊(yùn)藏著豐富的野生植物資源，例如鐘理[11]發(fā)現(xiàn)貴州野生匐剪股穎各形態(tài)學(xué)性狀均存在較大的變異，形態(tài)遺傳變異多產(chǎn)生于居群內(nèi).本研究材料采集地間海拔跨度較大，小氣候類(lèi)型多樣，生境差異明顯，為適應(yīng)不同的生境，白三葉在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，形態(tài)性狀也隨之改變.

3.2 巖溶地區(qū)同一花序野生白三葉的多樣性與育種

在育種工作中，借助部分表型性狀及其組合，可實(shí)現(xiàn)對(duì)白三葉目標(biāo)性狀的有效選擇.本研究中不同海拔區(qū)域甚至同一花序白三葉栽培群體內(nèi)都存在較豐富的遺傳變異，可塑性較大，可為優(yōu)良類(lèi)型的選擇提供材料.目前，對(duì)白三葉形態(tài)農(nóng)藝性狀已有較多研究，但主要集中在居群間和居群內(nèi)水平上[10，12-13]，在花序水平上的研究還未見(jiàn)報(bào)道.目前分子生物學(xué)技術(shù)已成為植物育種研究的有效工具，如李潤(rùn)芳[14]運(yùn)用細(xì)胞學(xué)方法和SRAP分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)8種三葉草的種質(zhì)資源遺傳多樣性進(jìn)行了初步評(píng)價(jià)，張婧源[15]對(duì)來(lái)自30個(gè)國(guó)家的70份野生白三葉從表型性狀、SRAP分子標(biāo)記和SSR分子標(biāo)記上進(jìn)行了不同產(chǎn)地白三葉種質(zhì)資源遺傳多樣性研究.在花序水平上研究其形態(tài)多樣性，通過(guò)人工選育成的優(yōu)良品種經(jīng)濟(jì)性狀整齊、遺傳基因穩(wěn)定.因此，對(duì)白三葉進(jìn)行優(yōu)良品種選育，最終建立良種繁育體系成為獲得質(zhì)量穩(wěn)定、可控優(yōu)質(zhì)白三葉的必經(jīng)之路.

3.3 巖溶地區(qū)貴州野生白三葉的利用價(jià)值和開(kāi)發(fā)前景

貴州地處我國(guó)云貴高原，屬長(zhǎng)江、珠江上游地區(qū)，是我國(guó)典型喀斯特區(qū)域之一，地理位置特殊，其生態(tài)環(huán)境的優(yōu)劣將直接影響整個(gè)長(zhǎng)江、珠江流域的生態(tài)環(huán)境安全.目前，對(duì)喀斯特地區(qū)生態(tài)系統(tǒng)植物恢復(fù)多集中在森林生態(tài)系統(tǒng)的恢復(fù)研究[16]，對(duì)喀斯特山地草地相關(guān)研究還比較少[17].對(duì)貴州野生白三葉種質(zhì)資源進(jìn)行研究，揭示喀斯特地區(qū)白三葉種質(zhì)資源豐富度、多樣性、蘊(yùn)藏量等特征，可為喀斯特石漠化地區(qū)草地植被恢復(fù)提供支持.本研究通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析白三葉同一花序水平上形態(tài)多樣性，發(fā)現(xiàn)其可塑性較大，在育種工作中可利用差異較大的材料W16和W12作為親本培育優(yōu)質(zhì)高效品種.還可利用白三葉進(jìn)行礦山植被修復(fù)，有研究發(fā)現(xiàn)其能同時(shí)富集污染土壤中的銅、鎘、鉛，且富集量大[18]，是很好的礦山修復(fù)植被之一.此外，白三葉還是重要的優(yōu)質(zhì)豆科牧草之一，影響當(dāng)?shù)剞r(nóng)牧業(yè)發(fā)展.因此，下一步將全面系統(tǒng)地調(diào)查和收集貴州、四川、廣西、新疆及云南等地區(qū)野生白三葉種質(zhì)資源，增加其多樣性，為充分發(fā)揮白三葉資源的生態(tài)和經(jīng)濟(jì)效益提供支持.

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（編輯 WJ）