鄧振山

(延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西 延安 716000)

?

苦馬豆根瘤中內(nèi)生細(xì)菌遺傳多樣性分析

鄧振山

(延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西 延安 716000)

苦馬豆(Sphaerophysasalsula)是西北荒漠區(qū)重要的豆科植物。本研究采用16S rDNA PCR-RFLP和16S rDNA全序列分析方法，對(duì)西北部分地區(qū)苦馬豆根瘤中內(nèi)生細(xì)菌的遺傳多樣性及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，115株供試菌株產(chǎn)生了28種遺傳圖譜類型，對(duì)每種圖譜類型的代表性菌株進(jìn)行了16S rDNA全序列分析，其中的根瘤菌分別歸屬于中華根瘤菌屬(Sinorhizobium)、根瘤菌屬(Rhizobium)、中慢生根瘤菌屬(Mesorhizobium)；其余的內(nèi)生菌分別歸屬于副球菌屬(Paracoccus)、鞘脂單胞菌屬(Sphingomonas)、固氮螺菌屬(Inquilinus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、沙雷氏菌屬(Serratia)、分枝桿菌屬(Mycobacterium)、諾卡氏菌屬(Nocardia)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)、短短芽孢桿菌屬(Brevibacillus)、Lysinibacillus、葡萄球菌屬(Staphylococcus)和芽孢桿菌屬(Bacillus)，這表明苦馬豆根瘤中內(nèi)生細(xì)菌具有豐富的多樣性。

苦馬豆; 16S rDNA PCR-RFLP; 遺傳多樣性; 系統(tǒng)發(fā)育

豆科植物廣泛分布于世界各地，它們通過根瘤菌的侵染和誘導(dǎo)，形成了稱之為根瘤或莖瘤的固氮共生體。根瘤菌在植物根瘤中受到保護(hù)并從植物體內(nèi)獲得碳源，同時(shí)把空氣中的氮?dú)廪D(zhuǎn)化為氨，并供給植物生長(zhǎng)。與根瘤菌相同，其它的非共生細(xì)菌也已大范圍地從多種豆科植物根瘤中分離出來[1-15]。這些內(nèi)生菌在根瘤中只能與共生菌共存，而且不會(huì)引起植物結(jié)瘤，也不固氮。但是，至少有一部分生命周期是存在于根瘤中的，并且不會(huì)對(duì)植物產(chǎn)生明顯的損害作用，所以，這些非共生細(xì)菌是生活在根瘤中的內(nèi)生菌[15]。研究者從根瘤中分離出不同種類的內(nèi)生細(xì)菌，包括芽孢桿菌(Bacillus)、假單胞菌(Pseudomonas)和腸桿菌(Enterobacter)[9,14]。根瘤中的內(nèi)生菌，分布在不同的綱和門，有變形菌門(革蘭氏陰性)，放線菌門、厚壁菌門[15]。目前，屬于α-變形菌綱的這些根瘤菌被鑒定為Rhizobium，Bradyrhizobium，Sinorhizobium，Mesorhizobium，Azorhizobium和Allorhizobium[15]。還有些屬于α-和β-變形菌綱以及一些未被分類的變形菌綱的細(xì)菌也從多種豆科植物的根瘤中被分離得到。

苦馬豆(Sphaerophysasalsula)屬于豆科，蝶形花亞科，苦馬豆屬，為多年生草本植物，主要分布于中亞和東亞，僅有2個(gè)種，其中1個(gè)種產(chǎn)自我國(guó)，為非引進(jìn)種?？囫R豆多生于海拔960-3 180 m的山坡、草原、荒地、沙灘、地埂、溝渠旁及鹽池周圍，耐鹽耐堿、耐瘠耐澇，是改良鹽堿地的先鋒植物。

與植物其它組織中的內(nèi)生菌相比，根瘤中的內(nèi)生菌研究還比較少，對(duì)它們所發(fā)揮的生態(tài)作用的了解還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。豆科作為地球上植物界最大的科之一，包括的植物種類大約有19 000種(http://www.ildis.org/ leguminosae/)[15-16]，但僅有少數(shù)種類(大多為農(nóng)業(yè)主栽品種)[17]被研究過，根瘤中內(nèi)生菌的相關(guān)研究就更少。研究者對(duì)西北部分地區(qū)的苦馬豆根瘤菌進(jìn)行了遺傳多樣性及系統(tǒng)發(fā)育分析， 但主要對(duì)苦馬豆根瘤菌多樣性進(jìn)行了描述[16]。目前相關(guān)研究主要集中在其它豆科植物根瘤內(nèi)生菌的研究上[1-14]，而針對(duì)苦馬豆根瘤內(nèi)生菌的研究尚未見報(bào)道，其內(nèi)生菌的多樣性與系統(tǒng)發(fā)育地位還不明確。鑒于此，本研究采用16S rDNA PCR-RFLP和16S rDNA 全序列分析方法，對(duì)西北部分地區(qū)苦馬豆根瘤中內(nèi)生細(xì)菌的遺傳多樣性及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)行研究，旨在分析苦馬豆根瘤中內(nèi)生細(xì)菌的多樣性，確定其系統(tǒng)發(fā)育地位，加深對(duì)苦馬豆根瘤中內(nèi)生細(xì)菌資源分布的認(rèn)識(shí)，為進(jìn)一步發(fā)掘和在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)恢復(fù)中充分利用性狀優(yōu)良的內(nèi)生菌種質(zhì)資源提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

經(jīng)過系統(tǒng)研究和綜合考慮，于2008年7月(苦馬豆的花期，有利于植物體的鑒定和有效瘤的采集)選擇了分布廣泛和最適合苦馬豆生長(zhǎng)的兩個(gè)不同的生態(tài)區(qū)(我國(guó)西北地區(qū)的甘肅省和寧夏回族自治區(qū))作為采樣地。生態(tài)區(qū)Ⅰ(甘肅省)為典型的溫帶季風(fēng)性氣候，具有砂質(zhì)土和鹽/堿土壤,年降水量45～132 mm，年平均溫度7～9 ℃；生態(tài)區(qū)Ⅱ(寧夏回族自治區(qū))為大陸季風(fēng)性氣候，位于半干旱溫帶地區(qū)，黏質(zhì)土,年降水量179～260 mm，年平均溫度8～9 ℃。分別記錄各采樣地的土壤類型，海拔、地理坐標(biāo)(使用GPS記錄)(表1)，并對(duì)所采集的植物樣本進(jìn)行照相和標(biāo)本壓制，以備鑒定所用。

1.2 試驗(yàn)材料

依據(jù)苦馬豆生長(zhǎng)所在的不同生態(tài)型和地理?xiàng)l件，于2008年7月從6個(gè)采樣點(diǎn)采集了苦馬豆根瘤、植株、果實(shí)、種子及原始土樣，這6個(gè)樣點(diǎn)的根瘤采集數(shù)分別為：甘肅省張掖市，45個(gè)根瘤；甘肅省高臺(tái)縣,48個(gè)根瘤；甘肅省瓜洲縣,63個(gè)根瘤；甘肅省民勤縣,61個(gè)根瘤，甘肅省采樣覆蓋面積為305 km×665 km(南北×東西)。寧夏中衛(wèi)市,51個(gè)根瘤；寧夏青銅峽市,55個(gè)根瘤，寧夏回族自治區(qū)采樣覆蓋面積為90 km×68 km。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 植物根瘤的采集方法 每個(gè)采樣點(diǎn)之間的距離大于50 km，并在每個(gè)采樣點(diǎn)隨機(jī)選擇地理坐標(biāo)不同的3個(gè)小采樣點(diǎn)，每個(gè)小采樣點(diǎn)至少采集30～50個(gè)不同的植株，每個(gè)植株間距離大于30 m，并在須根上隨機(jī)選擇3～4個(gè)沒有損傷、健康、大小相近的有效根瘤，存放于滅過菌、干燥的、裝有變色硅膠和棉塞的1.5 mL離心管或馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面中，置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆肹18]。

1.3.2 土壤樣品的采集方法 每個(gè)采樣點(diǎn)取樣量大體一致，均勻混合后，取約2 kg裝入滅菌的封口聚乙烯袋，帶回實(shí)驗(yàn)室于-70 ℃保存?zhèn)溆?，待測(cè)定土壤理化性質(zhì)。pH用酸度計(jì)法，總碳用重鉻酸鉀氧化法，總氮用半微量開氏法，總磷用鹽酸氟化銨-鉬銻抗比色法，總鉀用原子吸收分光光度法[15]。

表1 供試土壤樣品的地理來源和理化性質(zhì)Table 1 The geographical origin and physicochemical characteristics of the studied soilsa

1.3.3 菌株的培養(yǎng)及分離純化 將根瘤放在無菌水中充分浸泡濕脹后，用吸水紙吸干根瘤表面的殘留水分，95%的乙醇中浸泡30 s，隨即浸入5%的NaClO 3 min，之后滅菌水洗10次，最后用經(jīng)火焰滅菌后的無菌鑷子夾破根瘤，隨即將菌懸液分別用劃線法接種于yeast-mannitol agar(YMA)、Potato Dextrose Agar(PDA)、King’s B和Nutrient Agar(NA)4種不同的培養(yǎng)基平板上[8]，于28 ℃培養(yǎng)兩周，獲得其純培養(yǎng)單菌落后，將其分別轉(zhuǎn)接于相應(yīng)的試管斜面培養(yǎng)基中，部分置于4 ℃冰箱中暫時(shí)保存，部分在30%(v/v)甘油中于-80 ℃長(zhǎng)期保存?zhèn)溆?。為了確定根瘤表面消毒是否徹底，各處理均分別以最后一次沖洗液涂抹平板設(shè)置為對(duì)照(CK)，培養(yǎng)4 d后平板上無菌體生長(zhǎng)，表明表面消毒徹底，相應(yīng)平板的根瘤可用于內(nèi)生菌的分離[8]。

1.3.4 16S rDNA全序列分析 總DNA的提取方法參見文獻(xiàn)[18]，fD1和rD1(Escherichia coli 16S rRNA基因序列的8-27 bp和1 524-1 540 bp)用作PCR擴(kuò)增的引物[19]，PCR擴(kuò)增的方法見文獻(xiàn)[20]。

1.3.5 16S rDNA PCR-RFLP分析 選用擴(kuò)增較好的PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切。本試驗(yàn)選用了4種限制性內(nèi)切酶，分別為HaeⅢ、HinfⅠ、MspⅠ和HhaⅠ。酶切反應(yīng)體系均為20 μL，在37 ℃水浴中酶切4 h。全部酶切產(chǎn)物與2.5 μL上樣緩沖液溴酚蘭(10×Loading buffer)混勻，用2%的瓊脂糖凝膠分離，70 V水平電泳4 h，電泳結(jié)束后UV掃描，文件以JPG格式保存，并對(duì)4種酶的酶切結(jié)果進(jìn)行分析、記錄，4種酶的酶切結(jié)果一樣的菌株被看作同一種酶切類型，統(tǒng)計(jì)各菌株的酶切組合類型。

1.3.6 16S rDNA序列測(cè)定及其系統(tǒng)發(fā)育分析 根據(jù)16S rDNA PCR-RFLP遺傳圖譜組合類型，選取代表菌株(共25株)的16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。把得到的序列提交到Genbank(NCBI)申請(qǐng)并獲得各菌株序列號(hào)為：GU129566到GU129569和GU201840到GU201863。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，用BLAST軟件與從Genbank(NCBI)中獲得的已知種及相關(guān)種16S rDNA的全序列進(jìn)行多重序列比對(duì)，應(yīng)用Clustal-X 1.81和TREECONW version 1.3b軟件包分析，構(gòu)建以16S rDNA全序列為基礎(chǔ)的系統(tǒng)發(fā)育樹狀圖，并使用DNAMAN 6.0.40計(jì)算各測(cè)試菌株間16S rDNA序列的相似值。根據(jù)代表性菌株的16S rDNA的全序列與已知種的參比菌株序列比較，計(jì)算各菌株之間的遺傳距離，采用Neighbor-joining方法和Jukes-Cantor模型構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹狀圖。自展數(shù) (bootstrap)為100。

1.3.7 各采樣點(diǎn)可操作分類單位(OTUs) 的分離頻率和豐富度 可操作分類單位(operational taxonomic units,OTUs) 相似標(biāo)準(zhǔn)定義為16S rDNA基因序列差異小于3%[21]。每一種OTU的分離頻率用公式F=n/N計(jì)算，其中n代表采樣點(diǎn)的同一種OTU分離數(shù)；N代表所有采樣點(diǎn)總數(shù)。在一個(gè)采樣點(diǎn)，每一種OTUs的豐富度用公式R=s/S計(jì)算，其中，s表示同一種OTUs的菌株數(shù)；S表示在同一個(gè)采樣點(diǎn)的所有菌株數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 根瘤中內(nèi)生菌的分離與純化

從4種不同配方的培養(yǎng)基中分離得到的根瘤內(nèi)生細(xì)菌經(jīng)過純化和鏡檢，根據(jù)菌落和菌體的差異，最終共獲得內(nèi)生細(xì)菌115株，其中66株分離自生態(tài)區(qū)Ⅰ， 49株分離自生態(tài)區(qū)Ⅱ(表2)。

2.2 16S rDNA PCR-RFLP分析

用引物P1和P6對(duì)115株供試菌株的16S rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，其擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，均產(chǎn)生了約1.5 kb的DNA條帶(以100 bp DNA Ladder Marker 作標(biāo)記)。該結(jié)果表明，供試菌株與其它細(xì)菌16S rDNA的片段大小基本一致。

擴(kuò)增產(chǎn)物分別用4種限制性內(nèi)切酶酶切后，經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳成像。對(duì)應(yīng)每一個(gè)酶切電泳圖譜照片，凡是電泳圖譜上不同菌株間遷移率相同的帶被認(rèn)為是同一個(gè)性狀。4種限制性內(nèi)切酶酶切圖譜代表類型及遺傳圖譜類型結(jié)果如表3所示，西北地區(qū)苦馬豆根瘤中菌體的16S rDNA擴(kuò)增片段的RFLP遺傳圖譜比較豐富。供試菌株的16S rDNA PCR產(chǎn)物經(jīng)HinfⅠ、HhaⅠ、HaeⅢ、MspⅠ這4種限性內(nèi)切酶組合在一起所得到的16S rDNA遺傳圖譜類型共有25種(表3)，每一種定義為一個(gè)16S rDNA遺傳圖譜類型?？囫R豆根瘤中內(nèi)生細(xì)菌16S rDNA擴(kuò)增片段的RFLP電泳圖譜存在較大差異，說明16S rDNA基因具有豐富的遺傳多樣性。綜合分析可知，供試的115株苦馬豆根瘤中的內(nèi)生細(xì)菌，類型4(dcaa)占主要地位，由23 株供試菌株組成，并且在6個(gè)采樣點(diǎn)均有分布(9株來自寧夏中衛(wèi)市，4株來自寧夏青銅峽市，4株來自甘肅省高臺(tái)縣，3株來自甘肅省民勤縣，2株來自甘肅省瓜洲縣，1株來自甘肅省張掖市)；其次是類型20(jbfe)，共由21株菌組成，并且在5個(gè)采樣點(diǎn)均有分布(9株來自甘肅省高臺(tái)縣，4株來自甘肅省瓜洲縣，2株來自寧夏中衛(wèi)市，2株來自寧夏青銅峽市，4株來自甘肅省民勤縣)；類型1(jhac)，共由10株菌組成，分布在2個(gè)采樣點(diǎn)(8株來自寧夏青銅峽市，2株來自甘肅省民勤縣)；類型2(bakn)，共由6株菌組成，分布在2個(gè)采樣點(diǎn)(3株來自寧夏青銅峽市，3株來自甘肅省張掖市)；類型5(ecab)，共由7株菌組成，分布在3個(gè)采樣點(diǎn)(3株來自寧夏青銅峽市，2株來自甘肅省瓜洲縣，2株來自寧夏中衛(wèi)市)；類型9(cakn)，共由2株菌組成，分布在2個(gè)采樣點(diǎn)(1株來自甘肅省張掖市，1株來自寧夏中衛(wèi)市)；類型12(ijek)，共由5株菌組成，分布在3個(gè)采樣點(diǎn)(1株來自寧夏青銅峽市，3株來自甘肅省張掖市，1株來自甘肅省瓜洲縣)；類型13(miha)，由6 株供試菌株組成，分布在3個(gè)采樣點(diǎn)(3株來自寧夏中衛(wèi)市，1株來自寧夏青銅峽市，1株來自甘肅省高臺(tái)縣， 1株來自甘肅省瓜洲縣)；類型14(afgg)，由3株供試菌株組成，分布在2個(gè)采樣點(diǎn)(2株來自寧夏青銅峽市，1株來自甘肅省民勤縣)；類型17(cbej)，由3株供試菌株組成，分布在2個(gè)采樣點(diǎn)(2株來自甘肅省高臺(tái)縣，1株來自甘肅省民勤縣)；類型21(nmfd)，由8株供試菌株組成，分布在3個(gè)采樣點(diǎn)(2株來自甘肅省高臺(tái)縣，4株來自甘肅省瓜洲縣，2株來自寧夏中衛(wèi)市)；類型23(bebe)，由7株供試菌株組成，全部來自甘肅省高臺(tái)縣；類型24(ecfb)，由2株供試菌株組成，全部來自寧夏青銅峽市；類型3(ecam)、類型6(igdk)、類型7(dcab)、類型8(hhae)、類型10(ejal)、類型11(emih)、類型15(aldd)、類型16(lkji)、類型18(kbco)、類型19(bbbe)、類型22(fbbf)和類型25(fdbf)，分別都是由1株菌組成。

表2 根瘤中細(xì)菌的分離頻率和豐富度Table 2 Isolation frequency and richness of the nodule bacteria

注：s，同一種OUT的菌株數(shù)。

Note：s, number of strains with the same OUT。

表3 供試苦馬豆根瘤分離菌及其16S rDNA PCR-RFLP圖譜類型和16S rDNA相似菌株Table 3 Isolates obtained from Sphaerophysa salsula and results of 16S rDNA gene RFLP and 16S rRNA gene sequencing of the most similar strains

續(xù)表3(1)

菌株編號(hào)No.ofstrain圖譜類型RFLPtype分離地 Location 最相似菌株 Themost similarstrain 登錄號(hào)Accessionnumber相似性SimilarityZw-1115中衛(wèi)ZhongweiQtx-215青銅峽QingtongxiaZy-2(GU201844)6(ijdk)張掖ZhangyeM.tianshanenseA-1BSAF04144799%Qtx-24(GU201840)7(dcab)青銅峽QingtongxiaM.mediterraneumUPM-Ca36L3882599%中華根瘤菌屬SinorhizobiumQtx-8-1(GU129566),Qtx-828(hhae)青銅峽QingtongxiaS.melilotiLMG6133X67222)99%副球菌屬ParacoccusZy-3H-(GU129567)9(cakn)張掖ZhangyeP.halophilusHN-182DQ42348296%Zw-119(cakn)中衛(wèi)Zhongwei鞘脂單胞菌屬SphingomonasGuashi-1(GU201847)10(ejal)瓜州GuazhouS.pruniIFO15498Y0963798%固氮螺菌屬InquilinusMq-10(GU201848)11(emih)民勤MinqinI.limosusAU476NR_02904699%假單胞菌屬PseudomonasZy-2-1(GU201849)12(ijek)張掖ZhangyeP.fluorescens2P24AY44704599%Zy-2212張掖ZhangyeZy-2312張掖ZhangyeGz-2012瓜州GuazhouQtx-25212青銅峽Qingtongxia沙雷氏菌屬SerratiaZw-22(GU201850),Zw-221,Zw-8213(miha)中衛(wèi)ZhongweiS.plymuthicaDSM4540AJ23343399%Gt-10113高臺(tái)GaotaiGz-17113瓜州GuazhouQtx-3013青銅峽Qingtongxia分枝桿菌屬M(fèi)ycobacteriumQtx-19(GU201853)14(afgg)青銅峽QingtongxiaM.sacrumBN3151AY235429100%Mq-2114民勤MinqinQtx-2514青銅峽Qingtongxia諾卡氏菌屬NocardiaGt-25(GU201852)15(aldd)高臺(tái)GaotaiN.uniformisDSM43136AF430044100%鏈雷菌屬StreptomycesGt-10(GU201851),Gt-2016(lkji)高臺(tái)GaotaiS.bottropensisMBRC13023AB184262100%

續(xù)表3(2)

菌株編號(hào)No.ofstrains圖譜類型RFLPtype分離地 Location 最相似菌株 Themost similarstrains 登錄號(hào)Accessionnumber相似性Similarity類芽孢桿菌屬PaenibacillusGt-1(GU201854)17(cbej)高臺(tái)GaotaiP.amylolyticusNRRLNRS-290NR_02588299%Mq-3117民勤MinqinGt-1117高臺(tái)Gaotai短短芽孢桿菌屬BrevibacillusMq-17(GU201855)18(kbco)民勤MinqinB.borstelensisLMG15536AF378230100%LysinibacillusZw-13-3(GU201856)19(bbbe)中衛(wèi)ZhongweiL.fusiformisNBRC15717AB245423100%芽孢桿菌屬BacillusQtx-11(GU201860),Qtx-1220(jbfe)青銅峽QingtongxiaB.simplexLMG21002(AJ628745)100%Gz-220瓜州GuazhouMq-10120民勤MinqinGt-191,Gt-5120高臺(tái)GaotaiGz-22,Gz-120瓜州GuazhouZw-1320中衛(wèi)ZhongweiGt-1920高臺(tái)GaotaiGt-820高臺(tái)GaotaiZw-22-2(GU201861)21(nmfd)中衛(wèi)ZhongweiB.safensisKL-052AY030327)100%Gt-49,Gt-6,Gt-62,Gt-7221高臺(tái)GaotaiZw-13221中衛(wèi)ZhongweiGz-4121瓜州GuazhouMq-143,Mq-144,Mq-1921民勤MinqinZw-1121中衛(wèi)ZhongweiGz-621瓜州GuazhouGt-61,Gt-13,Gt-23,Gt-4221高臺(tái)GaotaiGz-20121瓜州GuazhouGt-12,Gt-41,Gt-21,Gt-71,Gt-31,Gt-5221高臺(tái)GaotaiGzn-9-1(GU201863)22(fbbf)瓜州GuazhouB.licheniformisCICC10104DQ082997100%Gaoshi-1(GU201858)23(bebe)高臺(tái)GaotaiB.cereusQD232EF488087100%Qtx-10(GU201862),Qtx-1624(ecfb)青銅峽QingtongxiaB.pumilusB402DQ523500100%葡萄球菌屬StaphylococcusGaoshi-7(GU201857)25(fdbf)高臺(tái)GaotaiS.saprophyticusATCC15305D83371100%

從寧夏青銅峽市分離獲得29株菌，共發(fā)現(xiàn)有11種類型，其中有24株分別屬于類型1(jhac)、類型2(bakn)、類型4(dcaa)、類型5(ecab)、類型12(ijek)、類型14(afgg)和類型20(jbfe)，且這些類型在其它樣地也有分布，剩余的5株分別屬于類型3(ecam)、類型7(dcab)、類型8(hhae)和類型24(ecfb)，且這幾種類型在其它樣地沒有發(fā)現(xiàn)，為該樣地的特有類型。從甘肅省高臺(tái)縣共分離得到30株菌，共發(fā)現(xiàn)有9種類型，其中類型20(jbfe)有9株菌，類型21(nmfd)有4株菌，類型4(dcaa)有4株菌，類型17(cbej)有2株菌，類型13(miha)有1株菌，剩余的為該樣地的特有類型，包括類型15(aldd)、類型16(lkji)、類型25(fdbf)分別各有1株菌，類型23(bebe)有7株菌。從甘肅省瓜洲縣分離獲得14株菌，多樣性比較豐富，共發(fā)現(xiàn)有8種類型，其中有12株分別屬于類型5(ecab)、類型10(ejal)、類型12(ijek)、類型13(miha)、類型20(jbfe)和類型21(nmfd)，且這些類型在其它樣地也有分布，剩余的2株分別屬于類型4(dcaa)和類型22(fbbf)，且這2種類型在其它樣地再?zèng)]有發(fā)現(xiàn)，為該樣地的特有類型。從甘肅省民勤縣分離獲得13株菌，共發(fā)現(xiàn)有7種類型，其中有11株分別屬于類型1(jhac)、類型4(dcaa)、類型14(afgg)類型17(cbej)和類型18(kbco)，且這些類型在其它樣地也有分布，剩余的2株分別屬于類型11(emih)和類型20(jbfe)，且這2種類型在其它樣地沒有發(fā)現(xiàn)，為該樣地的特有類型。從甘肅省張掖市分離獲得9株菌，共發(fā)現(xiàn)有5種類型，其中有8株分別屬于類型2(bakn)、類型9(cakn)、類型4(dcaa)和類型12(ijek)，且這些類型在其它樣地也有分布，剩余的1株屬于類型6(igdk)，為該樣地的特有類型。從寧夏中衛(wèi)市分離并獲得20株菌，共發(fā)現(xiàn)有7種類型，其中有19株分別屬于類型4(dcaa)、類型5(ecab)、類型9(cakn)、類型13(miha)、類型20(jbfe)和類型21(nmfd)，且這些類型在其它樣地也有分布，剩余的1株屬于類型19(bbbe),為該樣地的特有類型。

2.3 16S rDNA全序列相似性及系統(tǒng)發(fā)育分析

根據(jù)16S rDNA PCR-RFLP遺傳圖譜組合類型，115株內(nèi)生細(xì)菌可以被分為25種RFLP類型。選取代表菌株(共25株分別代表25種RFLP類型)的16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。由測(cè)序得到其近全長(zhǎng)序列(1 337～1 491 bp)，用BLAST軟件與從Genbank(NCBI)中檢索到的已知及相似度最高的菌種進(jìn)行多重序列比對(duì)。結(jié)果表明，其中50株分別屬于中華根瘤菌屬、根瘤菌屬、中慢生根瘤菌屬；剩余65株明顯區(qū)別于豆科植物結(jié)瘤細(xì)菌(legume-nodulating bacteria，LNB)，分別屬于副球菌屬、鞘脂單胞菌屬、固氮螺菌屬、假單胞菌屬、沙雷氏菌屬、分枝桿菌屬、諾卡氏菌屬、鏈霉菌屬、類芽孢桿菌屬、短短芽孢桿菌屬、Lysinibacillus、葡萄球菌屬和芽孢桿菌屬。

根據(jù)代表菌株的16S rDNA序列與相似度最高的菌株的序列構(gòu)建出系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)。可知，25株代表菌株中有8株在系統(tǒng)分類上分別歸屬于中華根瘤菌屬、根瘤菌屬和中慢生根瘤菌屬；剩余的17株分別歸屬于副球菌屬、鞘脂單胞菌屬、 固氮螺菌屬、假單胞菌屬、沙雷氏菌屬、分枝桿菌屬、諾卡氏菌屬、鏈霉菌屬、類芽孢桿菌屬、短短芽孢桿菌屬、Lysinibacillus、葡萄球菌屬和芽孢桿菌屬的系統(tǒng)發(fā)育分支上(圖1)。

分支1為中華根瘤菌屬，有1株菌。菌株Qtx-8-1與S.meliloti構(gòu)成一個(gè)小的分支，Qtx-8-1與S.meliloti的相似率為99.78%。

分支2為根瘤菌屬。菌株Qtx-3采自寧夏青銅峽市，經(jīng)比對(duì)Qtx-3與屬內(nèi)其它參比菌株的最大相似率為97.36%，可能為潛在的新種。菌株Qtx-10-1與R.leguminosarum形成另一小分支，Qtx-10-1與R.leguminosarum的相似率為100%。說明Qtx-10-1與R.leguminosarum是同一種菌。Zy-3-3與R.galegae的相似率為99.61%。

分支3為中慢生根瘤菌屬，共有Qtx-24、Zw-2-1、Zy-2和Gz-34四株菌。經(jīng)比對(duì)，Qtx-24與M.mediterraneum相似率為99.71%；Zw-2-1與M.gobiense相似率為100%，說明它們?yōu)橥环N菌；Zy-2與M.tianshanense的相似率為99.21%；Gz-34與M.amorphae相似率為99.88%； Zw-2-1與M.mediterraneum的相似率為99.85%。

分支4為副球菌屬，由Zy-3與其它參比菌株組成。Zy-3形成一單獨(dú)的小分支，它與分支內(nèi)其它參比菌株的最大相似率為96.58%，可能為副球菌屬內(nèi)潛在的新種。

分支5為鞘脂單胞菌屬，經(jīng)比對(duì)，Guashi-1與S.pruni、S.macrogoltabida和S.ginsengisoli的相似率分別為99.18%、98.92%、98.63%。

分支6為固氮螺菌屬，由Mq-10與I.limosus組成，Mq-10與I.limosus的相似率為99.69%。

分支7為假單胞菌屬，經(jīng)比對(duì)，Zy-2-1與P.brassicacearum、P.fluorescens和P.kilonensis的相似率依次為99.79%、99.72%、99.72%。

分支8為沙雷氏菌屬，Zw-22與S.plymuthica構(gòu)成一小分支，它們之間的相似率為99.98%，Zw-22與S.grimesii和S.ficaria的相似率分別為98.52%、98.45%。

分支9為鏈霉菌屬，Gt-10與S.bottropensis形成一小支，相似率為100%。Gt-10與S.europaeiscabiei相似率為99.03%；與S.stelliscabiei相似率為98.75%。

分支10為諾卡氏菌屬，Gt-25與N.uniformis組成一單獨(dú)的小分支，經(jīng)比對(duì)它們之間的相似率達(dá)到100%。

分支11為分枝桿菌屬，Qtx-19與M.sacrum構(gòu)成一小分支，它們之間相似度為100%。Qtx-19與M.diernhoferi、M.lacticola和M.wolinskyi的相似率依次為98.79%、98.93%和98.00%。

分支12為類芽孢桿菌屬，Gt-1與P.amylolyticus組成一單獨(dú)的小分支，其相似率為99.64%；與P.tylopili相似率為99.49%。

3 討論與結(jié)論

經(jīng)過比對(duì)16S rDNA近全長(zhǎng)的序列(1 337～1 491 bp)， 表明65株內(nèi)生菌具有豐富的遺傳多樣性，并分別歸屬于3個(gè)不同的菌門：變形菌門(Proteobacteria，革蘭氏陰性菌)，放線菌門(Actinobacteria)和厚壁菌門(Firmicutes，革蘭氏陽性菌)。在變形菌門中有4個(gè)菌株屬于α-變形菌綱(Paracoccus，Sphingomonas和Inquilinus)；11個(gè)屬于γ-變形菌綱(Pseudomonas和Serratia)；6個(gè)菌株分別歸屬于放線菌門中的Mycobacterium，Nocardia和Streptomyces；有45株分別歸屬于厚壁菌門中的Paenibacillus,Brevibacillus，Staphylococcus，Lysinibacillus和Bacillus，其中芽孢桿菌屬是優(yōu)勢(shì)根瘤內(nèi)生菌，占苦馬豆根瘤中所有內(nèi)生細(xì)菌的58.5%?；?6S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析表明，38株芽孢桿菌分別歸屬于5個(gè)種(Bacillussimplex，Bacillussafensis，Bacilluscereus，Bacilluspumilus，Bacilluslicheniformis)。Serratiaplymuthica，Lysinibacillusfusiformis和Staphylococcussaprophyticus這幾個(gè)菌種是沒有從根瘤中分離到的內(nèi)生菌。另外，Qtx-14 和Zy-3 與最近的已知種序列相似率小于97%，預(yù)示著它們?yōu)闈撛诘男路N。

有研究者從黑龍江地區(qū)大豆根瘤中分離出的菌株經(jīng)16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析鑒定為泛菌屬(Pantoea)、沙雷氏菌屬、不動(dòng)菌屬(Acinetobacter)、芽孢桿菌屬、土壤桿菌(Agrobacterium)和伯克氏菌屬(Burkholderia)，其中泛菌屬(Pantoea)為大豆根瘤中的優(yōu)勢(shì)菌株[9]。沙雷氏菌屬和芽孢桿菌屬在本研究結(jié)果中也有發(fā)現(xiàn)，除此之外，本研究還發(fā)現(xiàn)了副球菌屬、鞘脂單胞菌屬、固氮螺菌屬、假單胞菌屬等其它內(nèi)生菌，這些內(nèi)生菌群體組成的差異可能是由于黑龍江地區(qū)與西北地區(qū)的環(huán)境條件及寄主植物的不同所引起的。已有研究從多種豆科植物中分離出土壤桿菌，并把它們鑒定為根瘤中非共生內(nèi)生細(xì)菌[5]。然而，在本研究中，從苦馬豆根瘤中沒有分離到土壤桿菌，說明土壤桿菌對(duì)于西北地區(qū)苦馬豆植物來說不是優(yōu)勢(shì)菌種。在豆科植物根瘤和其他植物組織中P.agglomerans是普遍存在的內(nèi)生菌[7]。另外，有報(bào)道稱P.agglomerans可以在Hedysarum上結(jié)瘤[4]，但在本研究中也沒有分離到。這些差異可能是因?yàn)楦鲋袃?nèi)生菌的群體組成受寄主植物、地理環(huán)境共同作用的結(jié)果，這與根瘤菌類似[22]。從不同的地理位置，同一寄主植物中分離到的內(nèi)生菌歸于不同的屬或種，說明了環(huán)境條件對(duì)根瘤中細(xì)菌分類地位的影響大于寄主專一性的影響，這種現(xiàn)象已經(jīng)普遍存在，在內(nèi)生菌和根瘤菌的研究中都有過報(bào)道[4]。本研究從苦馬豆根瘤中分離出的根瘤菌大多屬于中慢生根瘤菌屬，在中華根瘤菌屬、根瘤菌屬中也均有分布但很少，這點(diǎn)徐琳等[22]的研究結(jié)論一致。

圖1 采用鄰接法(Neighbor-joining method)繪制的代表菌株16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹狀圖Fig.1 16S rRNA gene sequence-based dendrogram generated by the neighbor-joining method.

注：分支上的數(shù)值表示大于70%的Bootstrap值。

Note:Bootstrap values(1 000 replicates) are indicated above the branches(>70%) showing the phylogenetic positions of representative strains(shown in bold) associated withSphaerophysasalsularoot nodules. Scale bar indicates 1% substitution of nucleotide

本研究結(jié)果表明，從同一樣地苦馬豆根瘤中分離的內(nèi)生細(xì)菌基因型有可能比較相似，也可能差異很大，表現(xiàn)出豐富的多樣性，不同樣地分離的菌株可能各不相同，也可能有較好的一致性。每個(gè)樣地中都分別存在明顯的優(yōu)勢(shì)種和特有種群，樣地間兩兩比較可以發(fā)現(xiàn)，有一部分基因型是樣地間所共有的，特別是在性狀上相近的樣地間具有更多相似的基因型，而有些基因型則是有些樣地所特有的。6個(gè)樣地苦馬豆根瘤中分離的內(nèi)生細(xì)菌均具有明顯的多樣性，而且不同苦馬豆根瘤中分離的內(nèi)生細(xì)菌的遺傳的多樣性與其地理來源具有不同的相關(guān)性，此結(jié)果與前人[8-9]的研究結(jié)果一致。

本研究中，在一些根瘤中只分離出了內(nèi)生菌，如：Gaoshi-1(B.cereus)和Gaoshi-7(Staphylococcussaprophyticus)，此可能是在同一根瘤中由于內(nèi)生菌生長(zhǎng)的過快或者產(chǎn)生抗生素，從而影響了共生菌的生長(zhǎng)[24-25]；也可能是與根瘤菌有關(guān)的不可培養(yǎng)或難培養(yǎng)狀態(tài)的存在導(dǎo)致了其不可培養(yǎng)，處于該狀態(tài)下的根瘤菌可以通過直接PCR分析的方法進(jìn)行檢測(cè)，這還需進(jìn)一步深入研究，以更好地深刻揭示其細(xì)菌遺傳多樣性的信息。

在野生豆科植物苦馬豆的根瘤中，非共生的內(nèi)生菌是普遍存在的；寄主植物的遺傳背景和地理環(huán)境的共同作用是導(dǎo)致根瘤內(nèi)生細(xì)菌遺傳多樣性的主要因素；在西北部分地區(qū)，苦馬豆植物根瘤中的最優(yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌為芽孢桿菌屬。本研究對(duì)確定根瘤內(nèi)生菌特殊的系統(tǒng)發(fā)育地位及根瘤內(nèi)生菌、根瘤菌、寄主植物和環(huán)境因子間互作關(guān)系的研究提供了基本信息。

References：

[1] Bai Y M,Daoust F,Smith D L,Driscoll B T.Isolation of plant-growth-promotingBacillusstrains from soybean root nodules.Candian Journal of Microbiology,2002,48(2):230-238.

[2] Bai Y,Zhou X,Smith D.Enhanced soybean plant growth due to coinoculation ofBacillusstrains withBradyrhizobiumjaponicum.Crop Science,2003,43(1):1774-1781.

[3] Barrett C F,Parker M A.Coexistence ofBurkholderia,Cupriavidus,andRhizobiumsp. nodule bacteria on twoMimosaspp. in Costa Rica.Applied and Environmental Microbiology,2006,72(7):1198-1206.

[4] Benhizia Y,Benhizia H,Benguedouar A,Muresu R,Giacomini A,Squartini A.Gamma proteobacteria can nodulate legumes of the genusHedysarum.Systematic and Applied Microbiology,2004,27(2):462-468.

[5] De Lajudie P,Willems A,Nick G,Mohamed T S,Torck U,Filai-Maltouf A,Kersters K,Dreyfus B,Lindstr?m K,Gillis M.Agrobacteriumbv. 1 strains isolated from nodules of tropical legumes.System and Applied Microbiology,1999,22(1):119-132.

[7] Kan F L,Chen Z Y,Wang E T,Tian C F,Sui X H,Chen W X.Characterization of symbiotic and endophytic bacteria isolated from root nodules of herbaceous legumes grown in Qinghai-Tibet Plateau and in other zones of China.Archives of Microbiology,2007,188(10):103-115.

[8] Li L,Sinkko H,Montonen L,Wei G H,Lindstr?m K,R?s?nen L A.Biogeography of symbiotic and other endophytic bacteria isolated from medicinalGlycyrrhizaspecies in China.FEMS Microbiology Ecology,2012,79(2):46-68.

[9] Li J H,Wang E T,Chen W F,Chen W X.Genetic diversity and potential for promotion of plant growth detected in nodule endophytic bacteria of soybean grown in Heilongjiang Province of China.Soil Biology and Biochemistry,2008,40(7):238-246.

[10] Philipson M N,Blair I D.Bacteria in clover root tissue.Candian Journal of Microbiology,1957,3:125-129.

[11] Sturz A V,Christie B R,Matheson B G,Nowak J.Biodiversity of endophytic bacteria which colonize red clover nodules,roots,stems and foliage and their influence on growth.Biology and Fertility Soils,1997,25(3):13-19.

[12] Tokala R K,Strap J L,Jung C M,Crawford D L,Hamby Salove M,Deobald L A,Bailey F,Morra M J.Novel plantmicrobe rhizosphere interaction involvingStreptomyceslydicusWYEC108 and the pea plant(Pisumsativum).Applied and Environmental Microbiology,2002,68(1):2161-2171.

[13] Vandamme P,Goris J,Chen W M,De vos P,Willems A.Burkholderiatuberumsp. nov. andBurkholderiaphymatumsp.nov.,nodulate the roots of tropical legumes.Systematic and Applied Microbiology,2002,25(9):507-512.

[14] Zakhia F,Jeder H,Willems A,Gillis M,Dreyfus B,de Lajudie P.Diverse bacteria associated with root nodules of spontaneous legumes in Tunisia and first report fornifH-like gene within the generaMicrobacteriumandStarkeya.Microbiology and Ecology,2006,51(7):375-393.

[15] Zakhia F,de Lajudie P.Taxonomy ofRhizobia.Agronomie,2001,21(5):569-576.

[16] Sprent J I.Nodulation in Legumes.In:Janet S.(ed).London:Royal Botanic Gardens,2001.

[17] Terefework Z,Kaijalainen S,Lindstr?m K.AFLP fingerprint as a tool to study the genetic diversity ofRhizobiumgalegaeisolated fromGalegaorientalisandGalegaofficinalis.Journal Biotechnology,2001,91(6):169-180.

[18] Weisburg W G,Barns S M,Pelletior D A,Lane D J.16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study.Journal of Bacteriology,1991,173(4):697-703.

[19] υan Berkum P,Beyene B,Eardly B D.Phylogenetic relationships amongRhizobiumspecies nodulating the common bean (PhaseolusvulgarisL.).International Journal Systematic Bacteriology,1996,46(3):240-244.

[20] Vinuesa P,Silva C,Lorite M J,Izaguirre-Mayoral M L,Bedmar E J,Martínez-Romero E.Molecular systematics of rhizobia based on maximum likelihood andBayesianphylogeniesinferred fromrrs,atpD,recAandnifHsequences,and their use in the classification ofSesbaniamicrosymbiontsfromVenezuelanwetlands.Systematic and Applied Microbiology,2005,28:702-716.

[21] Tlusty B,van Berkum P,Graham P H.Characteristics of the rhizobia associated withDaleaspp. in the Ordway,Kellogg-Weaver Dunes and Hayden prairies.Canadian Journal of Microbiology,2005,51(2):15-23.

[22] 徐琳,徐佳潔,劉巧莉,謝瑞美,韋革宏.中國(guó)西北不同地區(qū)苦馬豆根瘤菌的遺傳多樣性.生物多樣性,2009,17(1):69-75.

Xu L,Xu J J,Liu Q L,Xie R M,Wei G H.Genitic diversity in rhizobia isolated fromSphaerophysasalsulain several regions of northwestern of China.Biodiversity Science,2009,17(1):69-75.(in Chinese)

[23] 李振東，陳秀蓉,楊成德.珠芽蓼內(nèi)生菌Z17抑菌能力測(cè)定及其鑒定.草業(yè)科學(xué),2011,28(12):2096-2101.

Li Z D,Chen X R,Yang C D.Identification ofPolygonumviviparumendophytic bacteria Z17 and its capacity to antagonistic towards pathogenic fungi.Pratacutural Science,2011,28(12):2096-2101.(in Chinese)

[24] 畢江濤,王小霞,陳衛(wèi)民,王靜,賀達(dá)漢.甘草內(nèi)生真菌分離及其抑菌活性初探.草業(yè)科學(xué),2013,30(3):357-364.

Bi J T,Wang X X,Chen W M,Wang J,He D H.Isolation of endophytic fungi from medicinal plantGlycyrrhizauralensisand its microbial inhibition activity.Pratacutural Science,2013,30(3):357-364.(in Chinese)

[25] 鄧振山,李軍.豆科植物根瘤中非共生的內(nèi)生菌遺傳多樣性研究進(jìn)展.微生物學(xué)雜志,2012,32(4):63-68.

Deng Z S,Li J.Genentic diversity of nonsymbiosis endophytic bacteria in leguminous root nodules.Journal of microbiology,2012,32(4):63-68.(in Chinese)

(責(zé)任編輯 茍燕妮)

Genetic diversity of endophytic bacteria in nodule ofSphaerophysasalsula

Deng Zhen-shan

(College of Life Sciences, Yan’an University, Yan’an 716000, China)

Sphaerophysasalsulais an important legume distributed in northwestern China. In order to better understand the diversity and phylogeny of endophytic bacteria collected from nodules ofSwainsoniasalsulain different regions of northwestern China, genetic diversity of these isolated endophytic bacteria was estimated using 16S rDNA PCR-RFLP and 16S rDNA sequencing. The results showed that these 115 bacteria strains had 28 genetic types which were further identified by 16S rDNA sequencing. These strains belonged to the following genera:Mesorhizobium,Rhizobium,Sinorhizobium,Paracoccus,Sphingomonas,Inquilinus,Pseudomonas,Serratia,Mycobacterium,Nocardia,Streptomyces,Paenibacillus,Brevibacillus,Lysinibacillus,Staphylococcus,Bacillus. These results demonstrated that endophytic bacteria in nodule had rich genetic diversity inS.salsula.

Sphaerophysasalsula; 16S rDNA PCR-RFLP; genetic diversity; phylogeny

Deng Zhen-shan E-mail:zhenshandeng214@163.com

10.11829/j.issn.1001-0629.2015-0688

2015-12-04 接受日期：2016-05-24

陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程項(xiàng)目(2012CGX7);陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程項(xiàng)目(2012KTZB03-02-03);陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程項(xiàng)目 (2012KTZB03-02-03);陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程項(xiàng)(2016TTC-N-3-1);延安市科技局重大專項(xiàng)項(xiàng)目(2014CGZH-06);陜西省教育廳服務(wù)服務(wù)地方專項(xiàng)計(jì)劃項(xiàng)(16JF029);延安大學(xué)“陜北微生物資源與利用研究中心”科研機(jī)構(gòu)專項(xiàng)基金

鄧振山(1969-)，男，陜西黃陵人，副教授，博士，主要從事微生物資源與利用和環(huán)境微生物研究。E-mail:zhenshandeng214@163.com

S154.3+1;Q943

A

1001-0629(2016)10-1951-12*

鄧振山.苦馬豆根瘤中內(nèi)生細(xì)菌遺傳多樣性分析.草業(yè)科學(xué),2016,33(10)：1951-1962.

Deng Z S.Genetic diversity of endophytic bacteria in nodule ofSphaerophysasalsula.Pratacultural Science，2016,33(10)：1951-1962.