劉 偉，張欣欣

(東北林業(yè)大學(xué)鹽堿地生物資源環(huán)境研究中心, 黑龍江 哈爾濱 150040)

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堿茅PutSnRK2基因表達(dá)、克隆及其蛋白純化

劉 偉，張欣欣

(東北林業(yè)大學(xué)鹽堿地生物資源環(huán)境研究中心, 黑龍江 哈爾濱 150040)

從NaHCO3逆境脅迫下堿茅(Puccinelliatenuiflora)的cDNA文庫中克隆得到PutSnRK2基因全長cDNA。PutSnRK2基因序列中存在1 077 bp的開放閱讀框，編碼358個氨基酸，預(yù)測蛋白分子量為41.11 kDa，等電點為5.63。實時熒光定量PCR分析表明，在NaHCO3、NaCl、ABA和PEG脅迫下，PutSnRK2基因在堿茅葉、根中均受到顯著誘導(dǎo)(P<0.05)。同時用pGEX-6p-3載體構(gòu)建了PutSnRK2基因的原核表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)純化得到GST-PutSnRK2融合蛋白，為后續(xù)試驗分析PutSnRK2蛋白的激酶活性、驗證蛋白間的相互作用等研究奠定了基礎(chǔ)。

堿茅；SnRK2；非生物脅迫；基因表達(dá)；蛋白表達(dá)與純化

蔗糖非酵解型蛋白激酶2 [SNF1(sucrose non-fermenting-1)-related protein kinase 2，SnRK2]是植物特有的一類Ser/Thr類蛋白激酶，蛋白激酶SnRK2家族成員受滲透脅迫激活，在脫落酸(abscisic acid，ABA)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中有重要作用[1]。在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中已經(jīng)確定了10個SnRK2，它們中的9個被高滲和鹽脅迫激活，并且這9個中的5個被ABA激活，但都不受冷脅迫誘導(dǎo)[2]。過表達(dá)AtSnRK2.8、AtSnRK2C后能增強擬南芥的抗旱性[3]。擬南芥SnRK2.6、SnRK2E、OST1和蠶豆(Viciafaba)ABA-activated serine-threonine protein kinase (AAPK)被ABA激活，它們都參與ABA調(diào)節(jié)的氣孔關(guān)閉和ABA調(diào)節(jié)的基因表達(dá)[4-6]。在水稻(Oryzasativa)中，10個成員已經(jīng)被鑒定并且命名為SAPK1-10。它們都可以被高滲脅迫激活，并且SAPK8-10被ABA激活[7]。過表達(dá)SAPK4能顯著增強水稻的抗鹽性[8]。在玉米中，10個SnRK2已經(jīng)被克隆，大多數(shù)玉米SnRK2基因能被一種或更多非生物脅迫誘導(dǎo)[9]。在大豆(Glycinemax)中，鑒定出4個SnRK2成員，都可以被高滲脅迫誘導(dǎo)[10-11]。在小麥中，只有一個SnRK2成員PKABA1可以被高滲脅迫和ABA誘導(dǎo)。并且在大麥糊粉層中瞬時過表達(dá)時抑制赤霉素誘導(dǎo)型啟動子的活性[12-15]。以往的研究結(jié)果表明，許多SnRK2成員參與對環(huán)境刺激的反應(yīng)。不同成員具有不同的表達(dá)模式，這表明它們可能在非生物逆境脅迫應(yīng)答中扮演不同的角色。

堿茅(Puccinelliatenuiflora)是一種禾本科單子葉鹽生植物，主要分布在我國的東北松嫩鹽堿草甸草原上。與其它鹽生植物相比，它在極端鹽惡劣的鹽堿環(huán)境下(pH 9～10)可以完成其整個生命周期。且具有一套獨特的適應(yīng)鹽堿逆境的生理機制，同時也具有潛在的實用價值[16]。因此，堿茅是一種理想的研究耐鹽機制的鹽生植物。本研究對PutSnRK2基因的生物信息學(xué)以及在非生物脅迫下的表達(dá)量進(jìn)行分析，有助于揭示PutSnRK2基因在非生物脅迫下的表達(dá)以及在調(diào)控植物生長發(fā)育中所起到的作用，為進(jìn)一步研究和利用基因工程技術(shù)培育抗鹽堿作物提供理論依據(jù)。另外，原核表達(dá)并純化了的GST-PutSnRK2蛋白，可為繼續(xù)開展其激酶活性、驗證蛋白相互作用等研究提供材料，從而為進(jìn)一步闡明PutSnRK2在響應(yīng)其它非生物脅迫時的功能機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和試劑

1.1.1 植物材料 堿茅種子采自東北林業(yè)大學(xué)鹽堿地生物資源環(huán)境研究中心安達(dá)野外實驗基地。25 ℃室溫，相對濕度60%，光照6 000 lx，光照時間為16 h/8 h條件下，水培養(yǎng)3周的堿茅幼苗為試材。

1.1.2 菌株和質(zhì)粒 pMD18-T快速連接試劑盒購自TaKaRa公司；pGEX-6p-3載體購自GE公司。試驗所需菌株大腸桿菌 JM109和BL21(DE3)來自本實驗室。

1.1.3 試劑 Trizol試劑購自Invitrogen公司；實時定量染料購自北京全式金公司；Glutathione SepharoseTM4B購自GE公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自TaKaRa公司；PureLink?Quick Gel Extraction Kit、restriction enzymes、ExpressLinkTMT4 DNA Ligase、低分子量蛋白Marker購自Thermo Fisher Scientific公司；GST抗體、堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(H+L)抗體購自碧云天公司。引物合成及測序由華大基因完成。試驗中所用到的化學(xué)藥品和培養(yǎng)基等試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 堿茅總RNA的提取和cDNA第一鏈的合成 用Trizol試劑法提取堿茅總RNA[17]。用TaKaRa公司的PrimeScriptTMRT Reagent Kit(Perfect Real Time)反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA。具體操作步驟如下：在無RNA酶的0.5 mL Ep管中加入2 μL 5×PrimeScript Buffer(for Real Time)，0.5 μL PrimeScript RT Enzyme Mix I，0.5 μL Oligo dT Primer(50 μmol·L-1)，0.5 μL Random 6 mers(100 μmol·L-1)，500 ng Total RNA，用RNase-free的ddH2O補足至10 μL，將混合液至于37 ℃ PCR儀上15 min，而后85 ℃ 5 s終止反應(yīng)。產(chǎn)物保存于-20 ℃冰箱中備用。

1.2.2PutSnRK2基因的生物信息學(xué)分析 利用差異顯示法，在NaHCO3逆境下，從堿茅cDNA文庫中克隆得到堿茅逆境誘導(dǎo)蛋白激酶PutSnRK2基因全長cDNA[18]。該cDNA全長為1 726 bp。利用在線ORF finder軟件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)分析PutSnRK2基因的ORF；利用DNAMAN軟件進(jìn)行序列比對和分析；利用在線ExPASy Compute pI/Mw tool軟件對PutSnRK2蛋白進(jìn)行等電點及分子量預(yù)測；利用MEGA6.0軟件進(jìn)行多序列比對，再用鄰接算法(Neighbor-Joining)構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹，其中Bootstrap值設(shè)為1 000重復(fù)；利用NCBI-BLAST及DNAMAN軟件進(jìn)行多重比對分析。

1.2.3PutSnRK2基因在非生物脅迫下的表達(dá)特性分析 用實時熒光定量PCR來分析PutSnRK2基因在不同非生物脅迫下的相對表達(dá)水平，具體方法如下：4個處理分別選取30粒種子，每個處理3次重復(fù)，以25 ℃室溫，相對濕度60%，光照6 000 lx，光照/黑暗時間為16 h/8 h，水培養(yǎng)3周的堿茅幼苗為試材[19]。分別經(jīng)300 mmol·L-1NaCl、150 mmol·L-1NaHCO3、50 μmol·L-1ABA、10% PEG6000處理0、6、12、24 h后，收集葉部組織、根部組織，液氮速凍后迅速保存于-80 ℃超低溫冰箱[20]。堿茅total RNA的提取及cDNA的合成同1.2。根據(jù)引物設(shè)計原則設(shè)計實時熒光定量PCR引物，引物由Primer Premier 5軟件設(shè)計,序列上游：5’-ACTACAAGAGAGACAACAGC-3’，下游：5’-GTGGACGAAGGAGGTGGTTT-3’；內(nèi)參基因選用堿茅PutTublin基因，序列上游：5’-GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG-3’，下游：5’-AACGACCTTAATCTTCATGCTGC-3’，反應(yīng)在Mx3000P型熒光定量PCR儀上進(jìn)行，采用SYBR Green I染料法進(jìn)行相對熒光定量檢測。反應(yīng)體系：2×TransStart Tip Green qPCR SuperMix 10 μL，Primer上游(10 μmol·L-1) 0.4 μL，下游(10 μmol·L-1) 0.4 μL，cDNA 1 μL，Passive Reference Dye 0.4 μL，ddH2O補足20 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性30 s，94 ℃變性5 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s，40個循環(huán),最后根據(jù)反應(yīng)的溶解曲線來判斷擴增結(jié)果是否特異。每個反應(yīng)3個平行，每次試驗制備不含cDNA的陰性樣品，得到的Ct值用2-ΔΔCt法來計算基因的相對表達(dá)水平。

1.2.4PutSnRK2基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建及目的蛋白的表達(dá)與純化 堿茅的cDNA文庫(150 mmol·L-1NaHCO3處理)由本實驗室構(gòu)建完成。用文庫載體通用引物擴增堿茅PutSnRK2基因全長片段。上游為：5’-ACTGCTCCTCAGTGGATGTT-3’，下游為：5’-CCCTCACTAAAGGGAGATCC-3’。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸120 s，30個循環(huán)后，72 ℃延伸10 min。反應(yīng)體系：TaKaRa Ex Taq(5 U·μL-1) 0.25 μL,10×Ex Taq Buffer 5 μL，dNTP Mixture(2.5 mmol·L-1) 4 μL，Template 1 μL，上游引物(10 μmol·L-1) 1 μL，下游引物 (10 μmol·L-1) 1 μL，ddH2O補足至50 μL。純化后的PCR產(chǎn)物連接pMD18-T載體。為了將PutSnRK2基因構(gòu)建到原核表達(dá)載體pGEX-6p-3的EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位點之間，在上下游引物中分別設(shè)計有EcoRⅠ和XhoⅠ識別切割位點。引物由Primer Premier 5軟件設(shè)計，序列上游：5’-GAATTCGATGGAGAGGTACG-3’，下游：5’-CTCGAGTCAGGTGATGTGGA-3’；以實驗室保存的連接到pMD18-T載體上的PutSnRK2基因為模版對PutSnRK2進(jìn)行擴增。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，30個循環(huán)后，72 ℃延伸10 min。反應(yīng)體系：TaKaRa Ex Taq(5 U·μL-1) 0.25 μL,10×Ex Taq Buffer 5 μL，dNTP Mixture(2.5 mmol·L-1) 4 μL，Template 1 μL，上游引物(10 μmol·L-1) 1 μL，下游引物 (10 μmol·L-1) 1 μL，ddH2O 補足至50 μL。將PCR產(chǎn)物電泳并回收目的條帶，然后將純化后的PutSnRK2連接pMD18-T載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109并過夜培養(yǎng)。將提質(zhì)粒酶切鑒定的陽性克隆送華大基因測序。測序正確的帶酶切位點的PutSnRK2基因和pGEX-6p-3質(zhì)粒用EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切后電泳回收目的片段和載體片段，ExpressLinkTMT4 DNA Ligase連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，氨芐青霉素篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切鑒定，正確的重組質(zhì)粒進(jìn)行下游試驗。

將測序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，挑取陽性克隆接種于LB液體培養(yǎng)基中(含Amp 100 μg·L-1)，37 ℃震蕩培養(yǎng)過夜。次日按1%比例轉(zhuǎn)接后，37 ℃震蕩培養(yǎng)使OD600 nm達(dá)到0.5后，加入IPTG至終濃度1 mmol·L-1，37 ℃誘導(dǎo)0、15、30、60、120和210 min，并離心收集每個時間的菌體，進(jìn)行10% SDS-PAGE鑒定[21]。

將含有pGEX-6p-3-PutSnRK2質(zhì)粒的大腸桿菌過夜培養(yǎng)物加入到200 mL液體LB培養(yǎng)基中，25 ℃振蕩培養(yǎng)。當(dāng)菌液的OD600 nm達(dá)到0.5時，取700 μL菌液，離心收集菌體，凍入-80 ℃冰箱中。其他菌液加入IPTG 使其終濃度為0.5 mmol·L-1，依然25 ℃振蕩培養(yǎng)，6 h后取700 μL菌液，離心收集菌體，凍入-80 ℃冰箱中。其他菌液離心收集菌體后加入裂菌緩沖液并進(jìn)行超聲波碎菌，隨后收集上清進(jìn)行純化。具體純化操作參照Glutathione SepharoseTM4B純化試劑說明書。Western Blotting鑒定，方法參照文獻(xiàn)[22]及碧云天GST抗體、堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG(H+L)抗體說明書。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)分析采用Mx 3000P型熒光定量PCR系統(tǒng)軟件和Excel 2007軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)錄入、計算、做圖；采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件中AVONA對PutSnRK2表達(dá)量數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，LSD多重比較法分析處理樣品間差異，顯著水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 PutSnRK2基因的生物信息學(xué)分析

對PutSnRK2進(jìn)行ORF分析，PutSnRK2基因序列中的開放閱讀框大小為1 077 bp，編碼358個氨基酸。利用ExPASy Compute pI/Mw tool軟件預(yù)測PutSnRK2蛋白等電點為5.63，分子量為41.11 kDa。搜索SnRK2家族已克隆基因的氨基酸序列，用DNAMAN軟件進(jìn)行氨基酸序列比對并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。系統(tǒng)進(jìn)化樹表明，PutSnRK2蛋白與擬南芥、水稻等作物聚類在一起，系統(tǒng)進(jìn)化親緣關(guān)系在76%左右(圖1)。堿茅是禾本科的植物，系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果也表明它與水稻親緣關(guān)系較近。其中PutSnRK2與水稻SAPK7有很高的相似性，同屬于SnRK2b亞家族[18]。運用DNAman軟件將隨機挑選的水稻SAPK進(jìn)行氨基酸多重性比較(圖2)，比較結(jié)果顯示，堿茅與水稻的SnRK2相比較蛋白的N-末端是相對保守的，并且在蛋白激酶的結(jié)合區(qū)域和絲氨酸、蘇氨酸蛋白激酶活性位點十分保守；C-末端較為多樣。2.2 PutSnRK2基因在非生物脅迫下的表達(dá)特性分析

以堿茅中的Tublin為內(nèi)參基因，通過對PutSnRK2基因在幾種非生物脅迫下表達(dá)的情況的實時熒光定量PCR的分析發(fā)現(xiàn)(圖3)，堿茅葉、根中PutSnRK2在300 mmol·L-1NaCl、150 mmol·L-1NaHCO3、50 μmol·L-1ABA和10% PEG脅迫下均

圖1 PutSnRK2蛋白與擬南芥、水稻同源蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.1 Phylogenetic analysis of PutSnRK2 protein with Arabidopsis thaliana, Oryza sativa protein

圖2 PutSnRK2與水稻蛋白的多重比對分析Fig.2 Multiple sequences alignment of PutSnRK2 with Oryza sativa protein

注：蛋白激酶結(jié)合區(qū)和絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶活性位點分別在紅框和緑框內(nèi)表示。保守的ATP結(jié)合位點(K，賴氨酸殘基)和活性位點(D，天冬氨酸殘基)分別用紅色的三角形和綠色的五角星表示。

Note: Protein kinases ATP-binding region signature and serine/threonine protein kinases active-site signature are indicated by a red box and a green box, respectively. The conserved ATP binding site (K, lysine residue) and the active site (D, aspartic acid residue) are marked with a red triangle and a green pentacle, respectively.

圖3 PutSnRK2基因在非生物脅迫下的表達(dá)特性Fig.3 Expression characteristic of PutSnRK2 under abiotic stress

注：*表示各處理與對照間差異顯著(P<0.05)。

Note: *indicated significant difference between the treatment and control at 0.05 level.

受到了顯著(P<0.05)的誘導(dǎo)。在葉中，PutSnRK2在NaCl、NaHCO3、ABA、PEG脅迫下顯著(P<0.05)下調(diào)。其中在NaHCO3脅迫24 h時，葉中下調(diào)了20%左右；而在NaCl、ABA、PEG脅迫24 h時，其表達(dá)量已經(jīng)下調(diào)了75%以上。在根中，PutSnRK2在NaCl、NaHCO3、ABA、PEG脅迫下表達(dá)均顯著上調(diào)(P<0.05)。其中在NaHCO3脅迫6 h時，根中PutSnRK2表達(dá)量已到最高，上調(diào)了3倍左右；在NaCl、ABA、PEG脅迫12 h時，表達(dá)量達(dá)到最高，上調(diào)1.5～2.5倍。

2.3 PutSnRK2基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建及其融合蛋白的表達(dá)與純化

采用設(shè)計的引物通過PCR擴增獲得帶有酶切位點的PutSnRK2基因(圖4A)。連接T載體后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，對酶切鑒定的陽性克隆測序。分別將連接到T載體上的PutSnRK2與提取的質(zhì)粒pGEX-6p-3用EcoRⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切、膠回收。再用ExpressLinkTMT4 DNA Ligase進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，將過夜培養(yǎng)后篩選到的陽性克隆搖菌，用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒并對其進(jìn)行雙酶切驗證(圖4B)，得到重組質(zhì)粒。

將重組質(zhì)粒pGEX-6p-3-PutSnRK2轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，過夜培養(yǎng)后搖菌，吸取1 μL的菌液作為模版進(jìn)行菌液PCR并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，挑選鑒定正確的陽性克隆進(jìn)行小量誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示(圖5A)，誘導(dǎo)出分子量大約為60 kDa的蛋白。其中GST標(biāo)簽分子量約為26 kDa，目標(biāo)蛋白預(yù)測分子量為41.1 kDa，與預(yù)測的融合蛋白67 kDa偏小。對融合蛋白進(jìn)行總平均疏水指數(shù)分析(圖6)。進(jìn)行大量誘導(dǎo)后結(jié)果表明：GST-PutSnRK2融合蛋白是可溶蛋白，并且在上清中表達(dá)。大量誘導(dǎo)及純化后得到的蛋白質(zhì)(圖5B)，經(jīng)過Western Blotting檢測 (圖5C)有信號，表明成功純化得到了原核表達(dá)的純化蛋白GST-PutSnRK2。

圖4 PutSnRK2基因的克隆和雙酶切驗證重組質(zhì)粒Fig.4 Cloning of PutSnRK2 gene from Puccinellia tenuifloraand double restriction enzymes digestion and verification of recombinant vector

注：M為DNA Marker，A(1，2)為擴增產(chǎn)物；B(1，2)為pGEX-6p-3-PutSnRK2。

Note：M, DNA Marker; A(1，2), amplification products; B(1，2), pGEX-6p-3-PutSnRK2).

圖5 GST-PutSnRK2蛋白的誘導(dǎo)與純化Fig.5 Induction and purification of GST-PutSnRK2 Protein

A:M，低分子量蛋白Marker；泳道1-6，分別為IPTG誘導(dǎo)0、15、30、60、120、210 min的BL21總蛋白);B、C：M，低分子量蛋白Marker；1，誘導(dǎo)0 min的BL21總蛋白；2，誘導(dǎo)6 h的BL21總蛋白；3，誘導(dǎo)6 h的BL21上清；4，純化的GST-PutSnRK2蛋白)。

A: M, low molecular weight standard proteins marker; Lane 1-6,the total protein of BL21, induced in 0,15,30,60,120,210 min by IPTG； B, C: M, low molecular weight standard proteins marker; Lane 1, the total protein ofBL21, induced 0 min; Lane 2, the total protein of BL21, induced 6 h; Lane 3, the supernatant of BL21, induced 6 h; Lane 4,the purification of GST-PutSnRK2.

圖6 GST-PutSnRK2融合蛋白的總平均疏水指數(shù)分析Fig.6 Grand average of hydropathicity analysis of GST-PutSnRK2 Protein

3 討論與結(jié)論

導(dǎo)致植物生長發(fā)育緩慢的主要非生物脅迫因素有干旱、鹽堿和低溫等。而我國鹽堿地面積逐漸增加，土壤鹽害嚴(yán)重影響作物的生長發(fā)育和產(chǎn)量提高，因此，克隆鹽脅迫應(yīng)答相關(guān)基因，研究耐鹽機理，對于培育耐鹽品種(系)、提高鹽脅迫下作物產(chǎn)量有重要的意義。堿茅因為有一套獨特的生理機制使它在鹽堿逆境下能比其它物種更好的生長發(fā)育。因此，它對于研究耐鹽機制的研究具有潛在的使用價值。SnRK2基因家族在植物多種信號傳導(dǎo)和抗逆過程中發(fā)揮重要作用[23]。系統(tǒng)進(jìn)化分析(圖1)和氨基酸多重比對(圖2)發(fā)現(xiàn)SnRK2蛋白激酶是一類非常保守的蛋白，結(jié)果顯示堿茅與水稻的SnRK2比較蛋白的N-末端是相對保守的，并且在蛋白激酶的結(jié)合區(qū)域和絲氨酸、蘇氨酸蛋白激酶活性位點十分保守；C-末端較為多樣。此結(jié)果表明，SnRK2蛋白N-末端的保守區(qū)是響應(yīng)脅迫的重要部分[18]，而C-末端可能與不同脅迫下產(chǎn)生不同表達(dá)模式有關(guān)。

大量研究表明，SnRK2蛋白激酶影響植物的生長發(fā)育，并且在響應(yīng)各種非生物脅迫中起重要作用[2,7,9,23-26]。本研究發(fā)現(xiàn)PutSnRK2基因在轉(zhuǎn)錄水平上受到NaCl、NaHCO3、ABA和PEG等多種非生物脅迫的誘導(dǎo)。在葉中PutSnRK2表達(dá)均受到顯著抑制，在根中表達(dá)均顯著上調(diào)，說明它可能在響應(yīng)非生物脅迫過程中起一定的作用。在NaCl和NaHCO3脅迫下根的表達(dá)量較高，顯示出對鹽堿脅迫有較強的響應(yīng)。但是，其逆境脅迫下的抗逆相關(guān)功能需進(jìn)一步驗證。此研究為以后構(gòu)建轉(zhuǎn)基因株系探究堿茅SnRK2基因在非生物脅迫下的確切功能提供參考。

獲得大量高純度的蛋白質(zhì)是對蛋白質(zhì)進(jìn)行生物化學(xué)分析的基礎(chǔ)，在原核表達(dá)蛋白系統(tǒng)中比較容易快速獲取大量高純度的蛋白質(zhì)，且有多種親和純化標(biāo)簽可以選擇，因此原核表達(dá)蛋白被廣泛地用于表達(dá)真核生物的蛋白質(zhì)[27]。本研究將PutSnRK2基因構(gòu)建到pGEX-6p-3原核表達(dá)載體上，并轉(zhuǎn)入BL21(DE3)中。結(jié)果表明，誘導(dǎo)的融合蛋白比預(yù)測值偏小，利用ExPASyProtParam tool軟件(http://web.expasy.org/protparam/)對融合蛋白分析，它的親水性平均系數(shù)為-0.462，疏水性低，導(dǎo)致泳動速度偏快，電泳結(jié)果比預(yù)測值偏小。對于GST-PutSnRK2融合蛋白，用0.5 mmol·L-1IPTG、25 ℃誘導(dǎo)6 h，獲得的蛋白質(zhì)經(jīng)過還原型谷光氨肽的洗脫，收集到有足夠純度和足夠量的GST-PutSnRK2融合蛋白。這種方法為通過生物化學(xué)方法分析PutSnRK2的激酶活性、驗證蛋白間的相互作用等功能，深入研究PutSnRK2提供材料。

本研究發(fā)現(xiàn)，PutSnRK2具備植物SnRK2基因家族的固有特征，同時RT-PCR分析表明其能夠響應(yīng)鹽、堿、ABA和干旱等非生物脅迫，說明它可能在響應(yīng)非生物脅迫過程中起一定的作用。同時，本研究得到了純化的PutSnRK2蛋白，為分析它的功能提供了材料。要揭示堿茅SnRK2基因在非生物逆境脅迫中的確切功能尚需要借助轉(zhuǎn)基因植物等手段開展大量深入細(xì)致的研究，目前有關(guān)工作正在進(jìn)行中。

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(責(zé)任編輯 茍燕妮)

Expression, cloning of PutSnRK2 gene and its protein purification ofPuccinelliatenuiflora

Liu Wei, Zhang Xin-xin

(Alkali Soil Natural Environmental Science Centre (ASNESC), Northeast Forestry University, Harbin 150040, China)

In the present study, the full length cDNA ofPutSnRK2 gene was cloned from the cDNA library ofPuccinelliatenuifloraunder the NaHCO3stress.PutSnRK2 gene contains an open reading frame (ORF) of 1 077 bp, encodes 358 deduced amino acid residues (AARs) with a calculated molecular mass of 41.1 kDa and predicted pI of 5.63. Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) analysis showed that the expression of PutSnRK2 gene was significantly induced (P<0.05) in leaves and roots of theP.tenuifloraunder stress of NaHCO3, NaCl, ABA, and PEG. At the same time, the prokaryotic expression plasmid of pGEX-6p-3-PutSnRK2 was constructed and transformed intoEscherichiacoliBL21 (DE3), and GST-PutSnRK2 fusion protein was induced and purified. These results provide foundation for further analyzing the activity ofPutSnRK2 and protein-protein interaction.

Puccinelliatenuiflora; SnRK2; abiotic stress; gene expression; protein expression and purification

Zhang Xin-xin E-mail:xxzhang@nefu.edu.cn

10.11829/j.issn.1001-0629.2015-0707

植物生產(chǎn)層

2015-12-12 接受日期：2016-06-13

長江學(xué)者和創(chuàng)新團隊發(fā)展計劃(IRT13053)第一作者：劉偉(1989-)，男，河北唐山人，在讀碩士生，研究方向為植物逆境分子生物學(xué)。E-mail：tangshanliuwei@yeah.net

張欣欣(1979-)，女，黑龍江哈爾濱人，教授，博士，研究方向為植物逆境分子生物學(xué)。E-mail：xxzhang@nefu.edu.cn

S543+.903;Q943.2

A

1001-0629(2016)10-2004-08*

劉偉，張欣欣.堿茅PutSnRK2基因表達(dá)、克隆及其蛋白純化.草業(yè)科學(xué),2016,33(10)：2004-2011.

Liu W,Zhang X X.Expression,cloning ofPutSnRK2gene and its protein purification ofPuccinelliatenuiflora.Pratacultural Science，2016,33(10)：2004-2011.