孫 楠，杜 娜，王 霆

(東北林業(yè)大學(xué)化學(xué)系，黑龍江 哈爾濱 150040)

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微生物發(fā)酵法制備的豆粕中大豆分離蛋白提取

孫 楠，杜 娜，王 霆

(東北林業(yè)大學(xué)化學(xué)系，黑龍江 哈爾濱 150040)

采用堿提酸沉法對微生物發(fā)酵法制備的豆粕中提取大豆分離蛋白，并用凱氏定氮法測算大豆分離蛋白含量。研究堿提溫度、液固比和堿提pH值及酸沉溫度、時間和pH值對大豆分離蛋白提取率的影響。結(jié)果表明堿提的最佳工藝條件為：溫度50 ℃、時間50 min、液固比10:1、pH=9.0。酸沉的工藝參數(shù)為：溫度45 ℃、時間40 min、pH=4.5。所得大豆分離蛋白最高提取率為79.29%。

微生物發(fā)酵；豆粕；分離蛋白

目前，市售大豆油主要采用壓榨[1-2]浸提[3-4]等傳統(tǒng)工藝提取，提油率雖高，但某些營養(yǎng)成分會被嚴(yán)重破壞，且副產(chǎn)物豆粕經(jīng)常被當(dāng)作動物飼料，蛋白成分未能充分利用，引起生物資源浪費。近年來，新型工藝如水代法[5]、水酶法[6]和微生物發(fā)酵法[7]等克服了傳統(tǒng)工藝的不足，這其中微生物發(fā)酵法提油以其生產(chǎn)成本低、菌種生長繁殖速度快、蛋白質(zhì)不會被破壞等優(yōu)點被廣泛應(yīng)用。

本文探討從微生物發(fā)酵法制備的豆粕中提取大豆分離蛋白的適宜堿提酸沉條件，為脫脂豆粕的進一步開發(fā)利用提供理論支撐。

1 實 驗

1.1 原料及試劑

大豆，產(chǎn)地黑龍江；枯草芽孢桿菌(Bacillusvallismortis；B9)，東北林業(yè)大學(xué)實驗室保存(可產(chǎn)蛋白酶的性能穩(wěn)定菌株)；搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基，大豆粉:水=1:9，pH=5；其它試劑均為分析純。

微生物發(fā)酵豆粕粉由實驗室自制，將大豆洗凈晾干后粉碎并過80目篩，120 ℃、30 min 條件下對培養(yǎng)基進行滅菌，按接種量10%接入枯草芽孢桿菌種B9，36 ℃恒溫搖床培養(yǎng)19 h，大豆的平均出油率為30.38%，副產(chǎn)物豆粕即為實驗所需微生物發(fā)酵豆粕粉。

1.2 主要儀器

PHS-25CpH計，上海雷磁儀器廠；HZQ-X100振蕩培養(yǎng)箱，哈爾濱市東明醫(yī)療器械廠；5030-PVL高壓滅菌鍋、DH6000A電熱恒溫培養(yǎng)箱，天津市泰斯特儀器有限公司；凱氏定氮裝置，實驗室自制。

1.3 堿提酸沉工藝提取大豆分離蛋白

豆粕粉粉碎過篩并干燥處理，稱取10 g，按一定的液固比加水混合，用NaOH調(diào)節(jié)pH值，分別在不同溫度的水浴鍋中加熱、攪拌一定時間，混合物離心。用稀鹽酸調(diào)節(jié)上清液pH值，于一定溫度下沉淀一段時間，離心分離，收集蛋白質(zhì)凝乳沉淀物，水洗，中和多余的酸，冷凍干燥，制得大豆分離蛋白粉，平行3次，評價各因素對蛋白質(zhì)提取率的影響。

1.4 蛋白質(zhì)提取率測定

采用凱氏定氮法測定豆粕中大豆分離蛋白的含量。稱取豆粕粉1 g于燒瓶中，加入0.2 g CuSO4，3 g K2SO4，20 mL H2SO4，加熱至溶液呈藍綠色澄清透明，再加熱30 min，冷卻，移入100 mL容量瓶中作為備用消化液樣品。

向圓底燒瓶中加入50 mL蒸餾水，2 mL H2SO4，滴加甲基紅指示劑使水溶液保持粉紅色，移取10 mL消化液樣品于凱氏定氮儀反應(yīng)瓶中，加入10 mL 400 g/L的NaOH溶液，防止裝置漏氣。加熱并移取10 mL 20 g/L的硼酸溶液于小燒杯中，加入甲基紅和溴甲基藍混合指示劑，吸收釋放出的NH3至溶液變?yōu)樗{綠色，停止加熱，用0.048 mol/L的鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至溶液變?yōu)闇\紅色，記下消耗鹽酸體積，平行3次，蛋白質(zhì)含量按公式(1)計算。

(1)

式中：X——豆粕中蛋白質(zhì)含量，gV1——樣品消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液體積，mLV2——試劑空白消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，mLc——鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，mol/Lm——豆粕質(zhì)量，gF——氮換算為蛋白質(zhì)系數(shù)，5.71

蛋白質(zhì)提取率按照公式(2)計算。

(2)

2 結(jié)果與討論

為探究堿提溫度、時間、液固比以及pH值對蛋白質(zhì)提取率的影響，設(shè)定酸沉溫度45 ℃、時間40 min、pH=4.5不變，重復(fù)實驗3次并計算在不同堿提條件下的蛋白質(zhì)提取率；同理，在探究酸沉溫度、時間和pH值對蛋白質(zhì)提取率的影響時，設(shè)定堿提溫度為50 ℃，按液固比10:1、pH=9.0并浸提50 min，計算不同酸沉條件下蛋白質(zhì)提取率，結(jié)果如表1所示。

表1 不同堿提酸沉條件對蛋白質(zhì)提取率的影響

2.1 堿提溫度對蛋白質(zhì)提取率的影響

表1中，當(dāng)堿提溫度在40～50 ℃，蛋白質(zhì)提取率隨溫度升高而升高，蛋白質(zhì)提取率提高11.47%；當(dāng)溫度上升到70 ℃時，蛋白質(zhì)提取率逐漸下降，但下降幅度僅為6.83%。這表明在一定溫度范圍內(nèi)，溫度升高會使蛋白質(zhì)的溶解度增大，使得蛋白質(zhì)提取率增大，因此堿提溫度控制為50 ℃。

2.2 堿提時間對蛋白質(zhì)提取率的影響

表1中，隨著堿提時間延長，蛋白質(zhì)的提取率提高，當(dāng)堿提時間超過50 min時，蛋白質(zhì)提取率趨于穩(wěn)定。堿提時間的延長有利于充分提取豆粕中蛋白質(zhì)，但過長時間會導(dǎo)致工作效率下降。考慮到超過50 min蛋白質(zhì)提取率提升較小，選擇堿提時間為50 min。

2.3 堿提液固比對蛋白質(zhì)提取率的影響

表1中，隨著液固比從6:1變化到10:1，蛋白質(zhì)提取率提高14.39%。然而當(dāng)液固比大于10:1后，蛋白質(zhì)的提取率降低。這是因為更多的堿提取液有利于蛋白質(zhì)脫離豆粕基體，蛋白質(zhì)的提取更完全。但過高液固比卻會給后續(xù)固液分離操作造成負擔(dān)，導(dǎo)致蛋白提取率下降因此控制液固比在10:1。

2.4 堿提pH對蛋白質(zhì)提取率影響

表1中，當(dāng)堿提pH值低于9.0時，蛋白質(zhì)提取率隨著pH值的升高而增加。這是由于pH值的升高會顯著增加蛋白質(zhì)在堿中的溶解度。當(dāng)pH值從9.0變化到10.0時，蛋白質(zhì)提取率增速變緩，僅提高1.18%；此外當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處于強堿條件下，其固有肽鍵會被打破，引起蛋白質(zhì)的變性，因此pH值控制在9.0。

2.5 酸沉溫度對蛋白質(zhì)提取率的影響

表1中，酸沉溫度為45 ℃時，蛋白質(zhì)提取率最高，為79.29%。而當(dāng)酸沉溫度從45 ℃變化到55 ℃時，蛋白質(zhì)提取率呈現(xiàn)下降趨勢，酸沉溫度越高，所需能耗也越高，因此酸沉溫度設(shè)定為45 ℃。

2.6 酸沉?xí)r間對蛋白質(zhì)提取率的影響

表1中，在20～40 min內(nèi)，蛋白質(zhì)提取率會隨著酸沉?xí)r間延長而提高。當(dāng)酸沉?xí)r間為40 min時，蛋白質(zhì)提取率達到最大值，從40 min升到50 min后，蛋白質(zhì)提取率趨于平穩(wěn)，因此酸沉?xí)r間為40 min。

2.7 酸沉pH值對蛋白質(zhì)提取率影響

表1中，當(dāng)酸沉pH值在3.5～4.5，隨著pH值的升高，蛋白質(zhì)提取率逐漸上升；而當(dāng)pH值在4.5～5.0時，隨著pH值升高提取率下降。這是因為蛋白質(zhì)的溶解度會隨著溶液pH值變化，pH值為4.5時處于蛋白質(zhì)的等電點，此時蛋白質(zhì)的溶解度最小，最有利于蛋白質(zhì)的沉降，因此酸沉pH值為4.5。

3 結(jié) 論

采用堿提酸沉法對微生物發(fā)酵法制備的豆粕中大豆分離蛋白進行提取。用凱氏定氮法測算產(chǎn)物豆粕中大豆分離蛋白含量，以蛋白質(zhì)提取率為考察指標(biāo)，研究堿提溫度、時間、液固比和pH值及酸沉溫度、時間和pH值對蛋白質(zhì)提取率的影響。結(jié)果表明堿提最佳工藝條件為：堿提溫度50 ℃、時間50 min、液固比10:1、堿提pH值為9.0；酸沉最佳工藝條件為：酸沉溫度為45 ℃、時間為40 min、pH值為4.5，在此條件下蛋白質(zhì)最高提取率為79.29%。

[1] 葛含靜.蘋果籽油提取、理化性質(zhì)測定以及脂肪酸分析研究[D].陜西師范大學(xué),2006.

[2] 賈富國.用于浸油的大豆擠壓膨化的基礎(chǔ)研究[D].東北農(nóng)業(yè)大學(xué),2000.

[3] 王文俠,任健.植物油水酶法浸提工藝研究進展[J].現(xiàn)代食品科技,2005,21(2):182-185.

[4] 韓金志.大豆油精煉新工藝的研究[D].福建農(nóng)林大學(xué),2012.

[5] 郭玉寶,湯斌,裘愛泳,等.水代法從油茶籽中提取茶油的工藝[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報,2008,24(9):249-252.

[6] Ranalli A, Mattia G D. Characterization of olive oil produced with a new enzyme processing aid [J]. J.Am.Oil Chem.Soc.,1997,74(9):1105-1113.

[7] 于妍,張智,王楠,等.微生物發(fā)酵法制取大豆油脂及發(fā)酵條件優(yōu)化[J].食品工業(yè)科技,2012,33(14):231-234.

Study on Extraction Conditions of Isolated Soybean Protein in Microbial Fermentation Soybean Meal*

SUNNan,DUNa,WANGTing

(Department of Chemistry, Northeast Forestry University, Heilongjiang Harbin 150040, China)

Alkaline extraction and acid precipitation were used to extract isolated protein from soybean meal produced by microbial fermentation. The content of isolated protein was calculated by kjeldahl method. Meanwhile, the extraction conditions of the isolated protein were studied. The optimum conditions of alkaline extractions were as follow: the temperature of extraction was 50 ℃, extracting time was 50 min, the ratio of liquid and solid was 10:1 and pH was 9.0. The optimum conditions of acid depositions were as follows: the temperature was 45 ℃, acid deposition time was 40 min and pH was 4.5. The highest extraction yield of isolated protein was 79.29%.

microbial fermentation; soybean meal; isolated protein

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(No：2572014CB32)。

孫楠(1990-)，女，碩士研究生，主要大豆蛋白分離研究。

王霆。

O652.7

A

1001-9677(2016)021-0040-03