張志堅 管紅霞# 楊琨 肖伯奎 廖華 江洋 周濤 華清泉

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·實驗研究·

特異性損傷內(nèi)耳螺旋神經(jīng)元小鼠模型的建立*

張志堅1管紅霞1#楊琨1肖伯奎1廖華1江洋1周濤1華清泉1

目的 建立小鼠內(nèi)耳螺旋神經(jīng)元損傷的耳聾模型，為研究干細胞移植治療感音神經(jīng)性聾奠定基礎。方法 成年雌性SPF級CBA/J小鼠60只，隨機分為實驗組和生理鹽水組，每組30只，實驗組動物經(jīng)圓窗滲透給予10 μl哇巴因(ouabain)，生理鹽水組同法給予等量生理鹽水。每組于給藥前及給藥后7、14及30天分別檢測小鼠聽性腦干反應(ABR)和畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射(DPOAE)，并用免疫組織熒光技術和基底膜鋪片技術分別觀察耳蝸螺旋神經(jīng)元(spiral ganglion neurons，SGNs)細胞及內(nèi)耳毛細胞(hair cells，HCs)的變化。結果 ①與生理鹽水組比較，實驗組給藥后各時間點ABR反應閾均明顯升高，波Ⅰ潛伏期延長，振幅明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。②實驗組及生理鹽水組小鼠DPOAE均可正常引出。③與生理鹽水組相比，實驗組耳蝸各回螺旋神經(jīng)元的數(shù)量及密度顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。④實驗組在給藥后不同時間點，耳蝸各回內(nèi)、外毛細胞均排列整齊、形態(tài)完整、未見明顯損傷或丟失。結論 哇巴因經(jīng)圓窗滲透給藥可特異性損傷CBA/J小鼠內(nèi)耳螺旋神經(jīng)元及其功能，而不損傷內(nèi)、外毛細胞，是一種理想的研究干細胞移植治療感音神經(jīng)性聾的動物模型。

哇巴因； 螺旋神經(jīng)元； 感音神經(jīng)性聾； 動物模型； 干細胞治療； 小鼠

內(nèi)耳毛細胞及螺旋神經(jīng)元受損導致的感音神經(jīng)性聾(sensorineural hearing loss, SNHL)是人類最常見的多發(fā)病之一，可導致嚴重的交流障礙，嚴重影響患者工作、學習及生活質量；因此，建立合適的感音神經(jīng)性聾動物模型，對研究耳聾及其治療具有十分重要的意義[1]。傳統(tǒng)動物造模多選用氨基糖苷、順鉑、慶大霉素類等藥物經(jīng)肌肉或腹腔注射誘導其內(nèi)耳感覺細胞的損傷，但這種造模方式不僅損傷耳蝸結構，且因其有全身毒性還可能損傷其他組織或器官。哇巴因(ouabain)是一種Na+-K+-ATP酶抑制劑，可抑制耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)、螺旋緣、毛細胞和血管紋的Na+-K+-ATP酶，有效阻斷其離子轉運而降低內(nèi)淋巴電位，從而損傷內(nèi)耳，造成感音神經(jīng)性聾[2～5]。

本研究擬通過使用ouabain經(jīng)小鼠內(nèi)耳圓窗滲透給藥，并在給藥后動態(tài)觀察ouabain對小鼠聽功能、內(nèi)耳毛細胞及螺旋神經(jīng)元的影響，建立小鼠內(nèi)耳螺旋神經(jīng)元損傷的耳聾模型，探討該方法用于內(nèi)耳螺旋神經(jīng)元損傷動物模型造模的可行性，為進一步研究干細胞移植治療感音神經(jīng)性聾奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 選擇北京華阜康公司提供的成年雌性SPF級的CBA/J小鼠(8～10周齡，體重22～25克)60 只，其外耳形態(tài)及耳廓發(fā)射正常，所有小鼠均常規(guī)飼養(yǎng)于武漢大學第一臨床學院實驗動物中心。將實驗動物隨機分為實驗組及對照組，每組30只小鼠；各組按給藥后時間再分為7、14和30天組，每組10只小鼠。

1.2 內(nèi)耳螺旋神經(jīng)節(jié)損傷小鼠造模 兩組小鼠完成術前聽性腦干反應(ABR)和畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射(DPOAE)測試后，所有動物均以右耳為手術耳。實驗組小鼠麻醉后，使用動物剃毛刀剃除小鼠術耳后的毛發(fā)，將小鼠頭部固定，75%酒精消毒術野皮膚，切開小鼠耳后皮膚，在解剖顯微鏡的直視下鈍性分離皮下脂肪及肌肉，充分暴露聽泡；用鼓膜切開刀于聽泡下方挑開聽泡，暴露耳蝸底回、圓窗龕及鐙骨動脈等解剖標志；用微量注射器將10 μl ouabain溶液分次注入圓窗龕，切勿刺破圓窗膜；在60分鐘內(nèi)完成給藥，給藥過程避光操作。對照組以生理鹽水代替ouabain溶液，余步驟相同。給藥完成后用棉球蘸干術腔的液體，以薄層骨蠟封閉聽泡，仔細檢查術腔有無出血，關閉術腔，縫合皮膚；待其清醒后放回飼養(yǎng)籠中。注意術中、術后保溫及術后營養(yǎng)支持。

1.3 ABR及DPOAE測試 兩組動物分別于給藥前及給藥后7、14、30天檢測ABR、DPOAE。以1% 戊巴比妥鈉按(50 mg/kg)腹腔注射麻醉小鼠，使用Tucker Davis Technologies equipment III (TDT, USA) 行聽性腦干反應(ABR)和畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射(DPOAE)檢測。在隔聲屏蔽室內(nèi)，將麻醉好的實驗小鼠置于37 ℃的熱水袋上。ABR檢測：記錄電極置于兩外耳道連線中點處的頭皮下，參考電極置于檢測耳乳突皮下，接地電極置于對側耳乳突皮下，聲源置于檢測耳外耳道口水平的1.0 cm處，click短聲刺激，持續(xù)時間100 ms，刺激頻率為21.1次/秒，疊加次數(shù)為1 024次；低通濾波為50 Hz，高通濾波為3 000 Hz，刺激強度從80 dB SPL至10 dB SPL，依次遞減10 dB， ABR閾值以波Ⅰ作為觀察指標，隨著刺激聲強度的遞減，當波Ⅰ消失時，將刺激聲強度遞增5 dB SPL，重復2次，以確定閾值；同時，分別記錄不同強度下ABR波Ⅰ的振幅和潛伏期。DPOAE檢測：將連接有刺激聲的耳塞塞入檢測耳內(nèi)，給與刺激強度分別為65和55 dB SPL的純音f1、f2，設置f0依次為1、2、3、4、8、12、16、20、24以及32 kHz，f1=0.911×f0，f2=1.099×f0，f2與f1的頻率比值為1.2，并記錄各頻率DPOAE的幅值。

1.4 分離耳蝸并制作切片 兩組動物完成各時間點ABR及DPOAE檢測后分別斷頭處死，小心分離并取出聽泡，分離耳蝸，挑破蝸尖骨質、前庭窗和圓窗膜，各組部分耳蝸以0.5%的硝酸銀從蝸頂灌流，再以4%多聚甲醛灌流，并置于固定液中室內(nèi)光照下放置2小時，以備基底膜鋪片使用；其余耳蝸4%多聚甲醛經(jīng)蝸頂灌流后置于固定液中4 ℃冰箱過夜，以備切片使用。第二天將4 ℃固定的耳蝸用PBS沖洗2遍，再將其放入盛有10% EDTA脫鈣液的標本瓶中，4 ℃脫鈣3天，于10%、20%、30%蔗糖溶液中梯度脫水，放入OCT中浸泡后用冰凍切片機沿蝸軸切片，切片厚度為10 μm。

1.5 免疫熒光染色 每只耳蝸間隔取出多張切片；用預先配置的0.01 mM的PBS漂洗3次，每次5分鐘；將切片置于0.2% TritonX-100溶液浸泡10分鐘；用0.01 mM的PBS漂洗3次，每次5分鐘；加5%正常山羊血清，室溫封閉30分鐘；移液器吸去封閉液，直接加上預先檢測好工作濃度的一抗(兔多抗，beta-III tubulin, 1:500，ab18207，Abcam)稀釋液，并置于4 ℃冰箱孵育過夜；0.01 mM的PBS漂洗3次，每次5分鐘；濾紙吸去標本周圍水珠，加相應的熒光二抗(1:500)，室溫暗盒孵育1小時；0.01 mM的PBS漂洗3次，每次5分鐘；DAPI溶液染核，室溫暗盒孵育10分鐘；0.01 mM的PBS漂洗3次，每次5分鐘；加抗熒光淬滅封片劑封片；暗室內(nèi)使用正置熒光顯微鏡觀察拍照。運用ImageJ圖片處理軟件計數(shù)Rosenthal’s canal內(nèi)耳蝸螺旋神經(jīng)元細胞(spiral ganglion neurons,SGNs)細胞的數(shù)量和面積。以神經(jīng)特異性抗體β Ⅲ tubulin陽性染色的細胞計為SGNs細胞，引入校正因子Abercromie[6]以減小計數(shù)偏差，計算公式為A=T/(T+D)，T是切片厚度，D是細胞直徑。本實驗底、中、頂回校正因子分別為0.667、0.669、0.673。螺旋神經(jīng)元細胞數(shù)=計數(shù)數(shù)量×A。

1.6 耳蝸基底膜鋪片 將固定好的耳蝸置于PBS(0.01 mM)的培養(yǎng)皿中，顯微鏡直視下運用顯微鑷小心剔除骨性外殼、螺旋韌帶、血管紋及蓋膜，小心將基底膜從骨螺旋板上分離，用虹膜刀將基底膜分為三段，并將其正面朝上平鋪于中間涂有甘油的載玻片上，封片；光學顯微鏡下觀察內(nèi)、外毛細胞形態(tài)并拍照保存。

1.7 統(tǒng)計學方法 運用Graphpad prism 5.0統(tǒng)計學軟件對ABR、DPOAE各檢測指標和SGNs細胞計數(shù)進行統(tǒng)計學分析，采用單因素方差分析(ANOVA)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 ABR及DPOAE檢測結果 各組動物給藥前后ABR檢測結果見表1，可見給藥前實驗組和對照組間ABR反應閾、波Ⅰ潛伏期及振幅的差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05);給藥后7、14、30天，對照組ABR反應閾、波Ⅰ潛伏期振幅與給藥前比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；實驗組給藥后與自身給藥前比較及與同時間點對照組比較，其ABR反應閾均明顯升高，潛伏期均明顯延長，振幅均明顯降低，甚至在80 dB SPL時未引出波形，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

DPOAE結果顯示(表2)，實驗組和對照組間術前及給藥后兩組間同時間點比較，DPOAE幅值差異均無統(tǒng)計學意義(均為P>0.05)。

表1 兩組給藥前后ABR反應閾(dB SPL)、波I振幅(μV)、潛伏期(ms)比較

注：*與對照組同一時間點比較,P<0.05；▲與同組給藥前對應指標比較,P<0.05；#與同組給藥后30 d組比較，P<0.05

表2 各頻率對照組和實驗組不同時間DPOAE幅值(μV)比較

注：*對照組給藥后30 d測試結果

2.2 免疫熒光染色SGNs計數(shù)結果 對照組在術后7、14和30天其β-Ⅲ tubulin 染色陽性細胞數(shù)無明顯改變，其骨螺旋板內(nèi)神經(jīng)纖維密度也未見明顯降低。而與對照組相比，實驗組耳蝸各回Rosenthal’s canal內(nèi)β-Ⅲ tubulin 染色陽性細胞在給藥后7天后細胞數(shù)量明顯減少，術后30天，Rosenthal’s canal內(nèi)僅見少數(shù)β Ⅲ tubulin陽性細胞存在，可見實驗組SGNs數(shù)在給藥后明顯減少，且與同時間點對照組比較其SGNs數(shù)顯著減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，在給藥后14天及30天實驗組底回仍有SGNs細胞死亡發(fā)生，給藥后30天底回SGNs數(shù)降至最低(表3，圖1)。

表3 對照組及實驗組耳蝸各回螺旋神經(jīng)元細胞的密度(個/mm2)

注：△對照組給藥后30 d測試結果；*與對照組比較，P<0.05；#與同組7、14 d組比較，P<0.05

圖1 對照組和實驗組給藥后耳蝸螺旋神經(jīng)元細胞變化

a～c顯示實驗組耳蝸底回螺旋神經(jīng)元(綠色細胞，紅色箭頭所示)，d為對照組給藥后30天螺旋神經(jīng)元，可見實驗組螺旋神經(jīng)元細胞數(shù)在給藥后明顯減少，給藥后30天神經(jīng)元細胞數(shù)降至最低，與同時間點對照組比較神經(jīng)元數(shù)量顯著減少

2.3 基底膜鋪片內(nèi)、外毛細胞形態(tài)觀察 在術后7、14和30天時，實驗組及對照組耳蝸底、中及頂回的內(nèi)、外毛細胞均排列整齊，未見明顯形態(tài)異?；蛉笔?；給藥30天后小鼠基底膜鋪片可見內(nèi)外毛細胞結構完整(圖2)。

圖2 給藥后30天小鼠耳蝸底回基底膜鋪片

給藥30天后，耳蝸底回內(nèi)毛細胞(黃色箭頭指示)及外毛細胞(白色箭頭指示)結構完整，未見缺失

3 討論

耳蝸螺旋神經(jīng)元存在于耳蝸蝸軸螺旋管( Rosenthal’s canal)內(nèi)，分2型，Ⅰ型螺旋神經(jīng)節(jié)細胞是雙極神經(jīng)元，占神經(jīng)元細胞的絕大部分，約95%，胞體大，軸突有髓鞘，每10～20個Ⅰ型神經(jīng)元的傳入纖維與一個內(nèi)毛細胞建立聯(lián)系；Ⅱ型螺旋神經(jīng)元為單極神經(jīng)元，數(shù)量少，約占神經(jīng)元細胞的5%，胞體較小，軸突無髓鞘，每根Ⅱ型傳入神經(jīng)纖維與數(shù)十個外毛細胞聯(lián)系。耳蝸螺旋神經(jīng)元細胞是聽覺系統(tǒng)非常重要的結構之一，任何原因造成其損傷均可導致感音神經(jīng)性聾。目前感音神經(jīng)性聾的治療方法有助聽器、人工耳蝸植入等人工聽覺技術，但是其功能的有效發(fā)揮仍有賴于殘余一定數(shù)量的螺旋神經(jīng)元[7]。近年來，以修復耳蝸螺旋神經(jīng)元為手段來治療感音神經(jīng)性聾的干細胞替代治療越來越受到關注[8]，因此，建立精準的相關動物模型，對研究干細胞移植治療感音神經(jīng)性聾有重要作用。

哇巴因(ouabain)可以選擇性抑制耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)、螺旋緣、毛細胞和血管紋的Na+-K+-ATP酶，已被用于感音神經(jīng)性聾的動物造模[2～5]。Schmedit等[4]研究發(fā)現(xiàn)ouabain經(jīng)圓窗用藥可導致沙鼠出現(xiàn)類似聽神經(jīng)病的聽力學改變;Lang[9]采用1 mM ouabain經(jīng)沙鼠圓窗滲透給藥，發(fā)現(xiàn)給藥后24 h時可以觀察到大部分SGNs細胞出現(xiàn)凋亡改變，認為ouabain可特異性導致沙鼠Ⅰ型SGNs損傷，而不損傷毛細胞；Lang等[5]在小鼠內(nèi)耳用1 mM ouabain經(jīng)圓窗給藥也得出類似結論。有研究表明0.01、0.02及0.05 mM ouabain 經(jīng)圓窗給藥可損傷大鼠耳蝸螺旋神經(jīng)元[10]，10 mM 高濃度ouabain不僅損傷大鼠螺旋神經(jīng)元而且損傷毛細胞[11]；張雪茹等[12]選擇了與人類更加類似的貴州小型豬作為實驗對象，比較0.1 mM和1 mM兩個濃度ouabain對貴州豬內(nèi)耳的影響，發(fā)現(xiàn)隨著ouabain濃度的升高，貴州小型豬SGNs的損傷加重。上述研究結果顯示ouabain對內(nèi)耳組織的損傷程度及部位與動物種屬、藥物濃度等密切相關。由于小鼠是目前耳聾研究中最常用的哺乳動物，故本研究選用小鼠作為研究對象；既往研究用于小鼠的ouabain濃度為1 mM，為減少ouabain對小鼠螺旋神經(jīng)元以外內(nèi)耳組織的可能影響，本研究使用0.5 mM ouabain經(jīng)圓窗給藥方式，結果表明0.5 mM ouabain同樣可特異性損傷小鼠耳蝸各回螺旋神經(jīng)元細胞，而不損傷內(nèi)外毛細胞，表現(xiàn)為給藥后實驗組小鼠ABR波Ⅰ潛伏期均明顯延長、閾值明顯升高、振幅明顯減低，而DPOAE幅值無改變，且實驗組在給藥后7天耳蝸各回螺旋神經(jīng)元即大量缺失，顯著被損傷，而基底膜鋪片顯示內(nèi)外毛細胞結構完整。另外，本研究中，在給藥14、30天后除實驗組底回仍有少數(shù)螺旋神經(jīng)元死亡發(fā)生，給藥后30天底回SGNs數(shù)降至最低，表明0.5 mM ouabain對螺旋神經(jīng)元的損傷是急性重度并不可逆的。

本研究成功建立了特異性損傷內(nèi)耳螺旋神經(jīng)元的小鼠動物模型，是一種理想的研究干細胞移植治療感音神經(jīng)性聾的動物模型。

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(2016-08-30收稿)

(本文編輯 雷培香)

An Animal Model of Specific Damage to Spiral Ganglion Neurons in the Inner Ear

Zhang Zhijian, Guan Hongxia, Yang Kun, Xiao Bokui, Liao Hua, Jiang Yang, Zhou Tao, Hua Qingquan

(Department of Otolaryngology & Head and Neck Srugery, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan, 430060, China)

Objective To establish an animal model of specific loss of spiral ganglion neurons in the mouse inner ear, and to lay the foundation for the study of stem cell transplantation in the treatment of sensorineural hearing loss.Methods Sixty adult female SPF grade CBA / J mice were randomly divided into experimental group and normal saline group, with 30 mice in each. The animals in the experimental group received 0.5 mM ouabain via the round window membrane, while the normal saline group used normal saline. Auditory brainstem responses (ABR) and distortion product otoacoustic emissions (DPOAE) were recorded before the administration, 7 days, 14 days and 30 days after the administration respectively. Meanwhile, immunofluorescence histochemical staining was used to detect spiral ganglion neurons(SGNs)damages, and basilar membrane preparation was used to observe the changes of hair cells.Results ABR: compared with those of in the normal saline group, in the experimental group , the thresholds were elevated , the Wave I latency was prolonged, and the amplitude reduced. The differences were statistically significant (P<0.05). DPOAE: DPOAE was normally recorded in the experimental group and the control group，without significant differences between the 2 groups. The immunofluorescence results show that compared with the normal saline group, the number and density of SGNs in the cochlea of the experimental group were significantly decreased, and the differences between the 2 groups were statistically significant (P<0.05). The basilar membrane preparation showed that at different time points after the administration of ouabain , the inner and outer hair cells in the experiment group cochlear were intact , no damage or loss were observed.Conclusion The application of ouabain to the mouse inner ear via the round window membrane can specifically induce the damages of SGNs, but spare the inner and outer hair cells, thus, it is an ideal animal model for the research of stem cell transplantation treatment of sensorineural hearing loss.

Ouabain; Spiral ganglion neurons; Sensorineural hearing loss; Animal model; Stem cell therapy; Mouse

* 國家自然科學基金面上項目(81271073)、教育部留學回國基金(302-153775)資助

張志堅，女，湖北人，醫(yī)學博士，副主任醫(yī)師，主要研究方向為耳科學、聽力學、干細胞定向分化。

華清泉(Email: hqqrm@sina.com)

10.3969/j.issn.1006-7299.2016.06.013

時間：2016-11-2 16:18

R764.3

A

1006-7299(2016)06-0583-05

1 武漢大學人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科 (武漢 430060)

# 共同第一作者

網(wǎng)絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/42.1391.R.20161102.1618.008.html