李 歡，羅向霞，馮玉沛，王 晗

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·實驗論著·

右歸丸對糖尿病視網膜病變大鼠PI3K/Akt信號通路的影響

李 歡1，羅向霞2，馮玉沛3，王 晗3

Foundation item:National Nature Science Foundation Project (No.81460685)

1Children’s eye health Department, Xiangtan City of Hunan Province Maternal and Child Health Hospital, Xiangtan 411100, Hunan Province, China;2Department of Ophthalmology, Gansu Provincial Hospital of Chinese Medicine, Lanzhou 730050, Gansu Province, China;3Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou 730050, Gansu Province, China

?METHODS: A total of 80 SPF SD rats were selected, 10 rats were selected to set up normal group. The remaining 70 rats were given streptozotocin (60mg/kg) peritoneal injection combined with intravitreal injection of VEGF (0.05μg) to establish proliferative diabetic retinopathy rat model. After the model successful, the rats were divided into four groups: YouguiWan high dose group, YouguiWan middle dose group, YouguiWan low dose group and model group. The treatment groups were fed daily YouguiWan concentrate, model group and the normal group received daily doses of distilled water. After intragastric administration for 3mo, the PI3K, Akt expression of retinal tissue were observed by SP-immunohistochemistry and Western-blot method respectively.

?RESULTS: Immunohistochemical observation showed PI3K, Akt expression immunohistochemical staining, were brown particles on the retina. Normal PI3K, Akt expression weakly positive immunological reaction unit located in the ganglion cell layer. The kernel was also a small amount of expression. Model group, each YouguiWan treatment group rat retinal ganglion cell layer, inner plexiform layer and the inner and outer layer of the particles had a positive expression. Compared with the model group, YouguiWan high dose group PI3K, Akt expression were decreased. YouguiWan low dose group decreased expression was not obvious. Compared with the low dose group, YouguiWan high dose group PI3K, Akt expression was decreased. The expression of the strength of the YouguiWan, high dose group showed no significant difference. Western-blot test results showed that compared with the normal group, model group, treatment group, the expression difference was statistically significant (P<0.01). Model group, treatment group, PI3K, Akt protein levels were significantly increased. Compared with the model group, the YouguiWan high-dose group was statistically significant (P<0.05). YouguiWan high dose group PI3K, Akt protein expression were decreased, YouguiWan low dose group was no significant difference (P>0.05). Compared with the low dose group, YouguiWan high-dose group was statistically significant (P<0.05). YouguiWan high dose group PI3K, Akt expression levels were decreased. YouguiWan high dose group was not statistically significant difference (P>0.05).

?CONCLUSION:Reinforcingyangfromyinof YouguiWan can affect PI3K, Akt protein expression and inhibit PI3K/Akt signaling pathway, delay the disease process of diabetic retinopathy, propose new ideas and scientific basis for the treatment of diabetic retinopathy and blindness prevention treatment.

目的：探討“陰中求陽”立法之右歸丸對糖尿病視網膜病變大鼠PI3K/Akt信號通路的影響。

方法：SD大鼠80只，隨機分組，10只為正常組，余大鼠通過一次性腹腔注射鏈脲佐菌素溶液(60mg/kg)聯(lián)合大鼠玻璃體腔注射VEGF(0.05μg)的方式建立糖尿病視網膜病變增殖期大鼠模型。模型建立成功后，將最終成模大鼠隨機分為4組：右歸丸高中低劑量組、模型組，右歸丸高中低劑量組每天給予相應右歸丸濃縮液濃度進行灌胃，模型組、正常組每天給予等劑量蒸餾水灌胃。連續(xù)灌胃3mo后，采取SP免疫組織化學、Western-blot法分別觀察檢測大鼠視網膜組織PI3K和Akt的表達情況。

結果：免疫組織化學觀察顯示PI3K和Akt免疫組化染色的陽性表達，在視網膜上均為棕黃色顆粒；正常組PI3K和Akt表達部分分布于神經節(jié)細胞層，內核也有少量表達，呈弱陽性免疫反應；模型組、右歸丸各治療組大鼠視網膜神經節(jié)細胞層、內叢狀層及內外顆粒層都有陽性表達；與模型組比較，右歸丸中、高劑量組PI3K和Akt表達均減弱，右歸丸低劑量組表達減弱不明顯；與右歸丸低劑量組比較，右歸丸中、高劑量組PI3K和Akt表達減弱；右歸丸中、高劑量組表達強弱比較無差異。Western-blot檢測結果顯示與正常組比較，模型組、治療組表達差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)，模型組、治療組PI3K和Akt蛋白表達水平顯著升高；與模型組比較，右歸丸中、高劑量組表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，右歸丸中、高劑量組PI3K和Akt蛋白表達水平均降低，右歸丸低劑量組表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與右歸丸低劑量組比較，右歸丸中、高劑量組表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，右歸丸中、高劑量組PI3K和Akt表達水平下降；右歸丸中、高劑量組表達比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

結論：基于“陰中求陽”立法之右歸丸可以通過影響PI3K和Akt蛋白表達水平，抑制PI3K/Akt 信號通路活化，延緩糖尿病視網膜病變的病變進程，為糖尿病視網膜病變防盲治療提出新的治療思路與科學依據。

右歸丸；陰中求陽法；糖尿病視網膜病變；PI3K/Akt

引用：李歡，羅向霞，馮玉沛，等.右歸丸對糖尿病視網膜病變大鼠PI3K/Akt信號通路的影響.國際眼科雜志2016;16(12):2195-2199

0引言

糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)作為糖尿病最常見、嚴重影響視功能且治療最為棘手的眼部并發(fā)癥，同時也已成為當前世界致盲率最高的疾病之一。隨著我國糖尿病發(fā)病率的激增，DR患病率已達44%～51.3%，視功能損害、致盲率日益見長[1]。國際糖尿病研究所的一份報道顯示：幾乎所有的1型DM以及超過60%的2型DM患者在20a后均發(fā)生不同程度的DR，其中發(fā)生增殖期改變者約18%，致盲者占20%[2]。中國北方邯鄲DR流行病學調査顯示：30歲以上DM患者的DR發(fā)病率為43.1%，糖尿病患者失明率是非糖尿病患者的25倍，如果不及時治療，50%的DR患者在進入增殖期之后的5a若不積極采取治療將完全失明[3]。PI3k/Akt信號通路作為參與內皮細胞遷移、增殖和血管發(fā)生功能紊亂的重要途徑之一，在DR的新生血管形成過程中同樣發(fā)揮著重要作用。近年來隨著DR中醫(yī)病機研究的深入，越來越多證據表明DR在進入增殖期后主要以陽虛病機為關鍵?！瓣幹星箨枴狈ㄗ鳛闇仃栴惙絼┑慕浀渑湮榉椒?，其治療陽虛功效已被基礎研究或臨床研究所證實，但有關對PI3K/Akt表達的影響少有文獻報道。基于此背景，本實驗旨在探討“陰中求陽”法是否可以通過影響PI3K和Akt蛋白的表達，抑制PI3K/Akt通路激活，進而探討基于“陰中求陽”立法之右歸丸延緩糖尿病視網膜病變進程的作用機制。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 SPF級SD大鼠80只，8周齡，雌雄各半(分籠喂養(yǎng))，體質量200～220g，由甘肅中醫(yī)藥大學科研實驗動物中心提供[許可證號：SCXK(甘)2011-0001]。

1.1.2實驗試劑與設備 鏈脲佐菌素(北京博愛科貿生物有限公司)；VEGF(上海派普泰克生物制劑有限公司)；10%熒光素鈉注射液(Alcon Laboratories，Inc)；Rabbit Anti-AKT antibody、Rabbit Anti-PI3K/P85 alpha antibody(北京博奧森生物技術公司)；HRP標記兔抗鼠一抗、濃縮型DAB溶液及底物、SP檢測試劑盒(Solarbio生物公司)；血糖儀、血糖試紙(羅氏上海公司)；微量加樣器、微量加樣吸頭(上海飛鴿生物有限公司)；Topcon眼底血管造影設備(HRA-II型，日本Topcon公司)；光學顯微鏡(日本Nikon公司)；解剖顯微鏡(德國OPMJ-CS公司)；-80℃冰箱(青島海爾)；電泳儀、電泳槽、轉移槽(北京六一儀器廠)；凝膠玻璃板、固定夾(上海漢諾儀器有限公司)。

1.1.3實驗藥物 按照《中華人民共和國藥典2010版》中所規(guī)定的右歸丸方藥組成劑量如下：熟地黃240g，山茱萸、當歸各90g，山藥、枸杞、杜仲、菟絲子、鹿角膠各120g，制附子、肉桂各60g，以上藥材均購自蘭州安泰堂藥店。右歸丸由甘肅省中醫(yī)院中藥研究院提取濃縮至2.3g/mL，4℃冷藏。

1.2方法

1.2.1造模方法 80只SD大鼠適應性喂養(yǎng)1wk后，隨機分組，10只設為正常組，其余大鼠采用鏈脲佐菌素液60mg/kg行腹腔注射(注射前禁食不禁水16h)，注射后分別于72h，1、2、3、4wk測定大鼠空腹血糖，以血糖值≥16.7mmol/L者確定為糖尿病大鼠；繼而微量進樣器抽取0.05μgVEGF，于顳側角膜緣后2mm水平經過睫狀體平坦部進入玻璃體腔，緩慢推動進樣器留針10s，4wk后對玻璃體腔注藥的大鼠分批行眼底熒光造影檢查，造影出現(xiàn)背景熒光增強、血管迂曲擴張、新生血管熒光滲漏等表現(xiàn)者為糖尿病視網膜病變增殖期大鼠模型建立成功。

1.2.2分組與給藥 將最終成模的大鼠篩選40只隨機分為右歸丸低劑量組、右歸丸中劑量組、右歸丸高劑量組、模型組4組，以及模型建立前所設立正常組，共5組，每組10只。依照賀石林《中醫(yī)科研設計與統(tǒng)計方法》進行的給藥劑量換算如下：(1)右歸丸高劑量組：每天灌胃中藥右歸丸濃縮液2.32g/100g體質量，相當于12倍成人劑量；右歸丸中劑量組：每天灌胃中藥右歸丸濃縮液1.16g/100g體質量，相當于6倍成人劑量；右歸丸低劑量組：每天灌胃中藥右歸丸濃縮液0.58g/100g體質量，相當于3倍成人劑量；模型組、正常組每天給予等劑量蒸餾水灌胃，連續(xù)灌胃給藥3mo。

圖1 各組大鼠視網膜PI3k的陽性表達情況(×400) A：正常組；B模型組；C：高劑量組；D：中劑量組；E：低劑量組。

圖2 各組大鼠視網膜Akt的陽性表達情況。PI3k和Akt免疫組化染色的陽性表達，在視網膜上均表現(xiàn)為棕黃色顆粒。正常組PI3k和Akt表達部分分布于神經節(jié)細胞層，內核也有少量表達，呈弱陽性免疫反應。模型組、右歸丸各治療組大鼠視網膜神經節(jié)細胞層、內叢狀層及內外顆粒層都有陽性表達(×400) A：正常組；B：模型組； C：高劑量組；D：中劑量組：E：低劑量組。

1.2.3實驗動物取材 給藥3mo后，處死大鼠，迅速摘除眼球，部分眼球浸泡于4%多聚甲醛溶液內；部分眼球于解剖顯微鏡下迅速剝取視網膜組織，置于一次性無菌EP管后，放入-80℃冰箱保存，備用。

1.2.4指標檢測

1.2.4.1 SP-免疫組織化學檢測大鼠視網膜組織PI3K/p85和Akt陽性表達 (1)石蠟切片常規(guī)烤片，二甲苯脫蠟和梯度酒精水化；(2)將切片置于檸檬酸鹽緩沖液中行防脫處理；(3)每張切片滴加過辣根氧化酶阻斷溶液50μL，以阻斷內源性過氧化物酶；(4)滴加5%正常山羊血清50μL，室溫下孵育15min；(5)滴加一抗PI3k/p85(工作液濃度1∶100)50μL，4℃孵育24h，其中Akt(工作液濃度 1∶150)，操作流程同PI3k/p85的操作流程。(6)滴加生物素標記兔抗鼠多抗50μL，37℃孵育10min；(7)滴加50μL鏈霉菌抗生素蛋白-過氧化物酶溶液，37℃孵育60min；(8)滴加DAB溶液100μL，顯微鏡下控制顯色時間；(9)蘇木素復染；(10)二甲苯透明，樹膠封片。

1.2.4.2 Western-blot法檢測大鼠視網膜組織PI3K/p85和Akt活性蛋白表達 以每20mg組織加200～400μL裂解液的比例進行裂解，運用電動組織細胞勻漿器進行1min勻漿后，離心取各組上清測濃度；取80μg蛋白與加樣緩沖液混勻變性；電泳、轉膜、封閉；PI3k/p85和Akt一抗(抗體稀釋度均為1∶300，內參抗體稀釋度為1∶1000)4℃孵育過夜，二抗孵育1h，進行后續(xù)發(fā)光、壓片、顯影、定影等，β-actin為內參；Image J軟件分析其灰度值。

2結果

2.1一般狀態(tài)觀察 造模期間，鏈脲佐菌素注射后大鼠死亡5只，7只由于血糖持續(xù)低于16.7mmo/L予以剔除；玻璃體腔注射后出現(xiàn)玻璃體積血4只，并發(fā)眼內炎2只，最終成模62只。給藥期間，右歸丸高劑量組死亡1只大鼠，模型組、右歸丸中劑量組及右歸丸低劑量組各死亡2只。分析死亡原因可能為血糖水平過高以及個別大鼠鏈脲佐菌素注射后所引起的腸脹氣。

2.2 SP-免疫組織化學法觀察各組大鼠視網膜組織PI3k和Akt的陽性表達情況 與模型組比較，右歸丸中、高劑量組PI3k和Akt表達均減弱，右歸丸低劑量組表達減弱不明顯；與右歸丸低劑量組比較，右歸丸中、高劑量組PI3k和Akt表達減弱；右歸丸中、高劑量組表達強弱比較無差異(圖1、2)。

2.3 Western-blot法檢測各組大鼠視網膜組織PI3k和Akt活性蛋白的表達 Western-blot法檢測大鼠視網膜PI3k和Akt蛋白表達水平，結果顯示：與正常組比較，模型組、治療組表達差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)，模型組、治療組PI3k和Akt蛋白表達水平顯著升高；與模型組比較，右歸丸中、高劑量組表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，右歸丸中、高劑量組PI3k和Akt蛋白表達水平均降低；與右歸丸低劑量組比較，右歸丸中、高劑量組表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，右歸丸中、高劑量組PI3k和Akt表達水平下降；右歸丸中、高劑量組表達比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，表1，圖3、4)。

3討論

DR的發(fā)生發(fā)展是一個復雜的病理過程，引起DR發(fā)生一系列病理改變的原因涉及細胞因子、信號轉導代謝酶、炎癥及離子通道等相關基因的異常變化[4]。新生血管形成是DR進入增殖期的特征性病理標志，防止并抑制DR新生血管形成是延緩其病變進程的關鍵靶點。PI3K-AKT通路廣泛存在細胞中，是參與作為細胞中廣泛存在的信號通路之一，PI3K/Akt通路的主要作用是通過參與細胞生長、增殖、分化的調節(jié)來實現(xiàn)的[5]。當該信號通路處于激活狀態(tài)時不僅能加速內皮細胞的存活周期，與血管內皮生長因子協(xié)同作用于細胞的存活、遷移，最終誘導新生血管形成，從而形成一條完整的促存活信號通路[6]。Akt作為調節(jié)絲氨酸激酶的抗凋亡信號之一，主要是通過調節(jié)作為內皮細胞從細胞周期G1期到S期重要中介的細胞周期蛋白D1的水解以及其在細胞內的定位，以達到干擾G1過度S期的目的，從而發(fā)揮其調節(jié)內皮細胞增殖、遷移以及誘導血管新生的關鍵作用[7]。同時，PI3k被激活后，其第二信使PIP3可刺激下游更多的信號分子，致使信號傳導增強，進一步使PI3k信號通路在內皮細胞遷移、增殖以及血管形成方面等病理改變方面的作用增強[8]。周賽君等在進行高糖體外實驗室時發(fā)現(xiàn)，由于高糖所引起的缺血缺氧環(huán)境可激活加速內皮細胞內信號通路PI3k/Akt中Akt的表達，并使其磷酸化增加，繼而加速新生血管形成[9]。

基于DR源于中醫(yī)“消渴”，故其屬于中醫(yī)“消渴目病”范疇。李志英等在對糖尿病中醫(yī)證型與DR分期關系進行探討時發(fā)現(xiàn)，DR在進入PDR后其癥候以血瘀氣滯證和陰陽兩虛證居多，病程超過10a者均以陽虛證為主[10]。為進一步研究并證實陽虛與DR病情進展的關系，明確陽虛在DR進入PDR病變過程中所起到的關鍵作用。段俊國等在對DR病情進展與陽虛病機關系進行研究時也證實陽虛可能影響機體能量代謝，致使機體內環(huán)境發(fā)生重大變化，促使那些能刺激DR發(fā)生增殖性改變的新生血管因子的相關基因異常表達，使DR從非增殖期進入增殖期，繼而推動DR的病變進程[11]。同期，羅向霞等在對DR陽虛病機的代謝組學物質基礎進行實驗研究時結果也表明，DR患者中無陽虛證與陽虛證在代謝組指紋圖譜上存在一定的差異性，陽虛可能影響整個機體的能量代謝，從而引起機體的內環(huán)境發(fā)生一系列重大變化，最終加速DR的病變進展[12]。

“陰中求陽”作為中醫(yī)方劑配伍的經典形式之一，更是溫陽類方劑最主要的配伍形式，明代張介賓《景岳全書》的右歸丸是其進一步發(fā)展，故有張介賓“善補陽者，必于陰中求陽，則陽得陰助而生化無窮”這一配伍意義精辟而深刻的概括[13]。仲景在《金匱要略》中云“男子消渴，小便反多，以飲一斗，小便一斗，腎氣丸主之”首開溫陽治療消渴的先河[14]。近代，諸多醫(yī)家也皆延用溫陽法治療本病，也取得了一定療效。如桑景武在治療久施養(yǎng)陰潤燥之品無效的糖尿病患者時，認為多因腎陽虛所致，因而在遣方用藥過程中喜加用附子以達到溫陽之效[15]。然而，各醫(yī)家在單純使用溫陽法治療消渴的同時，也都一致主張須兼顧氣血，以免溫補太過，應在眾多補陽之品中，適當?shù)靥砑右恍┳剃幥鍧欀罚赃_ “陰中求陽”之效[16]。如劉文華[17]觀察中醫(yī)對DR治療療效時也發(fā)現(xiàn)，單純運用溫陽法治療，多數(shù)DR患者眼底病理性改變仍在繼續(xù)惡化，從而得出臨床上一味地采用辛、甘、溫熱的溫陽之品，使整個機體處于溫燥的狀態(tài)中，能一定程度上加速DR眼底改變的結論；因此對陰陽兩虛者，他用右歸丸作為基礎方，另配伍茯苓、太子參、益母草等養(yǎng)陰滋陰之品后療效確切。同時，現(xiàn)代諸多醫(yī)家臨癥治療糖尿病以及其并發(fā)癥DR時，皆認為一味地執(zhí)養(yǎng)陰清熱的治法有失偏頗，皆喜在采用溫陽法時，適當佐以養(yǎng)陰之法，以達到扶正固本，標本兼治之效，且臨證每獲佳效[18]。

表1 各組大鼠Akt和PI3k蛋白表達量比較

(±s，n=8)

注：aP<0.05vs模型組；dP<0.01vs正常組；eP<0.05vs右歸丸低劑量組。

圖3 各組大鼠視網膜組織中Akt和PI3k蛋白的相對表達 A：Akt；B：PI3k。aP<0.05vs模型組；dP<0.01vs正常組；eP<0.05vs右歸丸低劑量組。

圖4 Akt和PI3k蛋白在視網膜組織中的表達水平 1：右歸丸低劑量組；2：右歸丸中劑量組；3：右歸丸高劑量組；4：正常組；5：模型組。

本實驗研究結果顯示與正常組比較，模型組、治療組PI3k和Akt表達顯著，提示在DR病變進程中，PI3k和Akt的表達增強，PI3k/Akt信號通路處于激活狀態(tài)。國內外也有類似文獻證實在DR的發(fā)生發(fā)展的過程中，居高不下血糖環(huán)境可激活PI3k/Akt這一信號通路，促使各類細胞因子合成與釋放增多，進而加速DR病變進程。給予“陰中求陽”立法之右歸丸灌胃治療后，右歸丸中、高劑量組PI3k和Akt表達降低，PI3k/Akt信號通路一定程度上被抑制，表明“陰中求陽”法可能通過調控PI3k/Akt信號通路，一定程度上抑制視網膜新生血管的形成，延緩DR病變進程，對其增殖期起到一定的治療作用。

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Effects of a traditional Chinese patent medicine for PI3K/Akt pro-survival signal channel in diabetic retinopathy rat

Huan Li1, Xiang-Xia Luo2, Yu-Pei Feng3, Han Wang3

Xiang-Xia Luo. Department of Ophthalmology, Gansu Provincial Hospital of Chinese Medicine, Lanzhou 730050, Gansu Province, China. jessica_lxx@163.com

?AIM: To investigate the effects ofreinforcingyangfromyinof a traditional Chinese patent medicine called YouguiWan for PI3K/Akt pro-survival signal channel in diabetic retinopathy rat.

YouguiWan;reinforcingyangfromyin; diabetic retinopathy; PI3K/Akt

國家自然科學基金項目(No.81460685)

1(411100)中國湖南省湘潭市婦幼保健院兒童眼保健科；2(730050)中國甘肅省蘭州市，甘肅省中醫(yī)院眼科；3(730050)中國甘肅省蘭州市，甘肅中醫(yī)藥大學

李歡，2013級甘肅中醫(yī)藥大學中醫(yī)五官科學碩士研究生，研究方向：中醫(yī)中藥治療眼底病。

羅向霞，2005級成都中醫(yī)藥大學中醫(yī)五官科學博士研究生，主任醫(yī)師，研究方向：中醫(yī)中藥治療眼底病.jessica_lxx@163.com

2016-07-13

2016-11-16

:Li H, Luo XX, Feng YP,etal. Effects of a traditional Chinese patent medicine for PI3K/Akt pro-survival signal channel in diabetic retinopathy rat.GuojiYankeZazhi(IntEyeSci) 2016;16(12):2195-2199

10.3980/j.issn.1672-5123.2016.12.06

Received：2016-07-13 Accepted：2016-11-16