寧 濤，胡 勇

(1. 安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科，安徽合肥 230032；2. 阜陽(yáng)市人民醫(yī)院骨科，安徽阜陽(yáng) 236000)

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◇中醫(yī)藥研究◇

復(fù)方續(xù)斷三七提取物對(duì)家兔骨折愈合的促進(jìn)作用及其機(jī)制

寧 濤1,2，胡 勇1

(1. 安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科，安徽合肥 230032；2. 阜陽(yáng)市人民醫(yī)院骨科，安徽阜陽(yáng) 236000)

目的 觀察復(fù)方續(xù)斷三七提取物(compound of radix dipsaci and pseudo-ginseng extract, CRPE)對(duì)家兔骨折愈合的促進(jìn)作用，并探討其機(jī)制。方法 采用家兔脛骨骨折模型，分成假手術(shù)組、模型組及CRPE 0.6 g/kg、CRPE 1.2 g/kg和CRPE 2.4 g/kg組。觀察CRPE對(duì)家兔骨骼愈合過(guò)程中骨痂形成時(shí)間、骨折愈合時(shí)間、血清中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子1(TGF-β1)、Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原、堿性磷酸酶、鈣、磷、鋅、銅含量的影響。采用Western blot和RT-PCR觀察CRPE對(duì)家兔脛骨骨折組織中P-Smad2、P-Smad3、Smad7、PAI-1蛋白及mRNA的表達(dá)影響。結(jié)果 CRPE(1.2 g/kg)組和CRPE(2.4 g/kg)組能縮短骨痂形成時(shí)間和骨折愈合時(shí)間，顯著升高骨折愈合過(guò)程中所需的TGF-β1、Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原、堿性磷酸酶、鈣、鋅、銅的含量；升高P-Smad2、P-Smad3和PAI-1的蛋白及mRNA的表達(dá)，降低Smad7蛋白及mRNA的表達(dá)(P<0.05)。結(jié)論 CRPE對(duì)家兔骨折預(yù)后有顯著的促進(jìn)作用，其機(jī)制可能與TGF-β1/Smad信號(hào)通路有關(guān)。

復(fù)方續(xù)斷三七提取物；骨折；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子1(TGF-β1)；Smad；PAI-1

Fuyang City People’s Hospital, Fuyang 236000, China)

隨著交通工具的日益增多，骨折已成為臨床最多見的外傷性疾患?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，骨折的愈合過(guò)程實(shí)質(zhì)是許多生物活性因子(biological activity factor, BAF)與成骨細(xì)胞(osteoblast)及細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)共同參與骨和周圍組織損傷修復(fù)的過(guò)程[1]。然而，由于開放性骨折、骨缺損、骨壞死等患者的大量增多，如何避免骨折愈合過(guò)程中出現(xiàn)的骨折不愈合及骨質(zhì)缺損仍然是臨床上治療的難點(diǎn)[2]。祖國(guó)醫(yī)學(xué)治療骨折已有數(shù)千年歷史，積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)，中藥因其天然藥源和療效肯定，具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。本課題組根據(jù)當(dāng)?shù)刂委煿钦邸捌健苯Y(jié)合傳統(tǒng)中醫(yī)理論，使用現(xiàn)代水提法制備出復(fù)方續(xù)斷三七提取物(compound of radix dipsaci and pseudo-ginseng extract, CRPE)，并觀察其在控制骨質(zhì)缺損，促進(jìn)骨折愈合等方面的療效。

1 材料與方法

1.1 藥物制備 復(fù)方續(xù)斷三七提取物是根據(jù)當(dāng)?shù)刂委煿钦鄣摹捌健焙椭嗅t(yī)理論修正，以續(xù)斷、三七、黃芪以及其他輔料按照(4∶3∶2∶1)配伍，使用現(xiàn)代水提法工藝制備而成[3]。其主要成分為環(huán)烯醚萜糖甙、黃芪多糖、人參皂苷等。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子1(transforming growth factor-β, TGF-β1)ELISA試劑盒、Ⅰ型膠原(collagen type Ⅰ)ELISA試劑盒、Ⅱ型膠原(collagen type Ⅱ)ELISA試劑盒、BCA法蛋白測(cè)定試劑盒，均購(gòu)自南京建成生物工程；Trizol購(gòu)自Invitrogen公司；RT-PCR試劑盒購(gòu)自Promega公司；TGF-β1、P-Smad2、Smad2、P-Smad3、Smad3、Smad7、GAPDH一抗及相關(guān)二抗購(gòu)自Sigma公司；TGF-β1、P-Smad2、P-Smad3、Smad7、GAPDH引物由上海生工生物工程公司合成。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 選用健康成年雄性新西蘭家兔50只，體質(zhì)量(2.2±0.2)kg，由安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號(hào)2008003。將動(dòng)物隨機(jī)分成5組，每組10只，分別為假手術(shù)組、模型組及CRPE 0.6 g/kg、CRPE 1.2 g/kg、CRPE 2.4 g/kg組。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模 用30 g/L戊巴比妥鈉(30 mg/kg)耳緣靜脈麻醉家兔，于脛腓骨前外側(cè)逐層切開皮膚、皮下組織及關(guān)節(jié)囊，暴露出家兔脛骨，使用線鋸將脛骨截?cái)?，并形成約0.3 cm大小的骨缺損區(qū)，滴入100 g/L復(fù)合抗生素(青霉素：慶大霉素=2∶1)后縫合包扎，無(wú)外固定。術(shù)后模型組肌注青霉素鈉行抗感染治療3 d，每天1次，每次50萬(wàn)IU。CRPE組予以相應(yīng)劑量(0.6 g/kg、1.2 g/kg、2.4 g/kg)灌胃處理，每天1次。假手術(shù)組只切開不截?cái)嗝劰恰＜彝迷谠炷：蟮?、14、21、28、35天行X線(CR)攝片檢查骨折，并觀察骨折和骨痂的形成及骨折愈合情況。于造模前及造模后第7、14、21、28、35天抽取各組家兔血5 mL，以1 000 r/min離心10 min分離血清后置于-20 ℃冷凍備用。按照相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)處死家兔，切去并清理骨折的脛骨后-80 ℃冷凍備用。

1.5 家兔血清TGF-β1、Ⅰ、Ⅱ型膠原及堿性磷酸酶、鈣、磷、鋅、銅含量的測(cè)定 取出凍存的家兔血清，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書步驟檢測(cè)家兔血清中TGF-β1，Ⅰ、Ⅱ型膠原的含量；使用堿性磷酸酶試劑盒(AKP/ALP)檢測(cè)家兔血清中堿性磷酸酶的含量；使用IRIS/AP法直接檢測(cè)血清中鈣、磷、鋅、銅的含量。

1.6 RT-PCR方法檢測(cè)TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7、PAI-1、GAPDH的mRNA含量 使用Trizol試劑盒提取家兔脛骨骨折處組織中的總RNA。用Image Plus軟件測(cè)量RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物吸光度值,以GAPDH作標(biāo)準(zhǔn)校正各產(chǎn)物的相對(duì)水平。使用的PCR引物見表1。

表1 PCR所用引物及其序列Tab.1 The primers and sequence of RT-PCR

1.7 免疫印跡分析法檢測(cè)TGF-β1、P-Smad2、Smad2、P-Smad3、Smad3、Smad7、PAI-1、GAPDH的蛋白含量 使用TLB(包含20 mmol/LTris，pH 7.4, 137 mmol/L 氯化鈉，25 mmol/L β-甘油磷酸，25 mmol/L鈉-焦磷酸鹽，2 mmol/L乙二胺四乙酸，1 mmol/L正鋇酸鈉，10 mL/L TritonX-100，100 mL/L甘油，1 mmol/L苯甲基磺酰氟，7 g/L蛋白酶抑制劑)緩沖液與家兔脛骨骨組織勻漿。使用BCA法測(cè)定各個(gè)樣本蛋白質(zhì)水平。按照Westen blot法將蛋白分離、電泳、轉(zhuǎn)膜后置于4 ℃一抗雜交袋過(guò)夜，后加入二抗孵育。使用ECL發(fā)光法進(jìn)行曝光并分析統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié) 果

2.1 CRPE對(duì)家兔骨痂形成時(shí)間和骨折愈合時(shí)間的影響 假手術(shù)組未觀察到骨痂形成；與模型組相比，CRPE(1.2 g/kg)和CRPE(2.4 g/kg)組能明顯降低骨痂形成時(shí)間，縮小骨折愈合時(shí)間，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表2)。

表2 CRPE對(duì)家兔骨痂形成時(shí)間和骨折愈合時(shí)間的影響Tab.2 The effects of CRPE on callus formation time and healing time in rabbits

2.2 CRPE在術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)家兔血清中TGF-β1含量的影響 與假手術(shù)組相比，模型組血清中TGF-β1含量均明顯增高(P<0.05)；與模型組相比，CRPE(1.2 g/kg)組在造模后14 d和21 d能增高家兔血清中TGF-β1的含量，而CRPE(2.4 g/kg)組則能在造模后7、14、21、28 d提高家兔血清中TGF-β1的含量，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表3)。

2.3 CRPE在術(shù)后3周時(shí)對(duì)家兔血清中Ⅰ、Ⅱ型膠原含量的影響 與假手術(shù)相比，模型組血清中Ⅰ、Ⅱ型膠原含量顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，CRPE(1.2 g/kg)和CRPE(2.4 g/kg)組能明顯升高家兔血清中Ⅰ、Ⅱ型膠原含量，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表4)。

2.4 CRPE在術(shù)后3周時(shí)對(duì)家兔血清中堿性磷酸酶、鈣、磷水平的影響 與假手術(shù)組相比，模型組家兔血清中堿性磷酸酶、血鈣含量明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，血磷含量無(wú)明顯變化；與模型組相比，CRPE(1.2 g/kg)和CRPE(2.4 g/kg)均能升高家兔血清中堿性磷酸酶及血鈣的含量，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，血磷含量無(wú)明顯變化(表5)。

表3 CRPE在術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)家兔血清中TGF-β1含量的影響Tab.3 The effects of CRPE on TGF-β1 level at different time points after operation in rabbit serum

表4 CRPE在術(shù)后3周時(shí)對(duì)家兔血清中Ⅰ、Ⅱ型膠原含量的影響Tab.4 The effects of CRPE on collagen type Ⅰ and collagen type Ⅱ levels 3 weeks after operation in rabbit serum

2.5 CRPE在術(shù)后3周時(shí)對(duì)家兔血清中鋅、銅含量的影響 與假手術(shù)組相比，模型組血清中鋅、銅的含量顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，CRPE(1.2 g/kg)和CRPE(2.4 g/kg)組均能升高血清中鋅的含量，CRPE(2.4 g/kg)組還能升高血清中銅的含量，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表6)。

表5 CRPE在術(shù)后3周時(shí)對(duì)家兔血清中堿性磷酸酶、鈣、磷的影響Tab.5 The effects of CRPE on alkaline phosphatase, Ca and P levels 3 weeks after operation in rabbit serum

2.6 CRPE對(duì)家兔骨折模型中骨組織P-Smad2和P-Smad3蛋白及mRNA的影響 與假手術(shù)組相比，模型組可以顯著升高家兔骨組織中P-Smad2和P-Smad3蛋白及mRNA的水平；與模型組相比CRPE(1.2 g/kg)和CRPE(2.4 g/kg)組能更顯著升高家兔骨組織中P-Smad2和P-Smad3蛋白及mRNA的水平，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖1)。

表6 CRPE在術(shù)后3周時(shí)對(duì)家兔血清中鋅、銅含量的影響Tab.6 The effects of CRPE on Zn and Cu levels 3 weeks after operation in rabbit serum

圖1 CRPE對(duì)家兔骨折模型中骨膜組織P-Smad2和P-Smad3蛋白及mRNA的影響Fig.1 The effects of CRPE on P-Smad2 and P-Smad3 protein and mRNA levels in rabbit mucoperiosteal tissue

2.7 CRPE對(duì)家兔骨折模型中骨膜組織Smad7蛋白及mRNA的影響 與假手術(shù)組相比，模型組可以顯著降低家兔骨組織中Smad7蛋白及mRNA的水平；與模型組相比，CRPE(1.2 g/kg)和CRPE(2.4 g/kg)組能顯著升高家兔骨組織中Smad7蛋白及mRNA的水平，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2)。

圖2 CRPE對(duì)家兔骨折模型中骨膜組織Smad7蛋白及mRNA的影響Fig.2 The effects of CRPE on Smad7 protein and mRNA levels in rabbit mucoperiosteal tissue

2.8 CRPE對(duì)家兔骨折模型中骨膜組織PAI-1蛋白及mRNA的影響 與假手術(shù)組相比，模型組可以顯著升高家兔骨組織中PAI-1蛋白及mRNA的水平；與模型組相比CRPE(1.2 g/kg)和CRPE(2.4 g/kg)組能更顯著升高家兔骨組織中Smad7蛋白水平，CRPE(2.4 g/kg)組能顯著升高PAI-1 mRNA的水平，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖3)。

圖3 CRPE對(duì)家兔骨折模型中骨膜組織PAI-1蛋白及mRNA的影響Fig.3 The effects of CRPE on PAI-1 protein and mRNA levels in rabbit mucoperiosteal tissue

3 討 論

對(duì)于骨折愈合的進(jìn)程，在臨床上將骨折愈合分為四期：血腫機(jī)化期、骨痂形成期、骨性愈合期及骨痂塑性期。在整個(gè)骨折愈合的過(guò)程中，血腫機(jī)化期和骨痂形成期尤為重要[4]。在此期許多內(nèi)源性生長(zhǎng)因子，如胰島素樣生長(zhǎng)因子(insulin-like growth factor, IGF)、血小板衍生生長(zhǎng)因子(platelet-derived growth factor, PDGF)、內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factor β, TGF-β)等，間充質(zhì)細(xì)胞在炎癥刺激下聚集、增殖、繼而引起血管增生，并且向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化；隨后機(jī)化組織中成纖維細(xì)胞合成和分泌大量膠原纖維，轉(zhuǎn)化為纖維結(jié)締組織，使骨骼連接。其中，TGF-β1在骨折愈合過(guò)程中的作用最突出。有研究表明，TGF-β1基因表達(dá)廣泛存在于骨折愈合過(guò)程中，在調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞的分化、參與血管形成、加快間充質(zhì)細(xì)胞和成骨細(xì)胞的增殖速度、產(chǎn)生新骨基質(zhì)方面均具有重要的作用[5]。 在本實(shí)驗(yàn)中，CRPE(1.2 g/kg)組和CRPE(2.4 g/kg)組可降低骨痂形成時(shí)間，縮小骨折愈合時(shí)間，在血腫機(jī)化期和骨痂形成期，相比模型組能更顯著升高TGF-β1的含量，提示CRPE(1.2 g/kg)和CRPE(2.4 g/kg)對(duì)骨折愈合有促進(jìn)作用。

在骨折愈合過(guò)程中，血清鈣、磷及微量元素也發(fā)揮著不可或缺的作用。眾多實(shí)驗(yàn)證明，血清鈣磷含量可直接影響骨的鈣化與溶解，其水平的升高在骨折愈合過(guò)程中有助于骨鹽的沉積。不僅如此，在愈合過(guò)程中形成的骨痂鈣磷含量與骨痂灰度以及骨的生物力學(xué)參數(shù)之間也有明顯相關(guān)性。然而，骨痂中鈣、磷和其他離子礦化速度主要是由成骨細(xì)胞調(diào)節(jié)，其分泌的基質(zhì)能夠促進(jìn)這些離子的晶核形成，有利于骨鹽礦化進(jìn)行[6]。堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, AKP/ALP)富含于成骨細(xì)胞胞質(zhì)中，它作為成骨細(xì)胞功能標(biāo)記物及分化程度指標(biāo)。血清中AKP的濃度可以作為代表成骨細(xì)胞活動(dòng)性增加或骨重建活躍性的指證[7]。在本實(shí)驗(yàn)中，骨痂形成期的血鈣濃度及血清堿性磷酸酶的含量在CRPE(1.2 g/kg)組和CRPE(2.4 g/kg)組明顯升高，提示CRPE可以通過(guò)增強(qiáng)骨鹽的礦化和鈣鹽沉積促進(jìn)骨折的愈合。

微量元素廣泛參與體內(nèi)的物質(zhì)代謝，在骨折愈合過(guò)程中同樣發(fā)揮了重要的作用。銅是賴氨酰氧化酶活性的必備條件，與其活性密切相關(guān)。鋅則能增強(qiáng)堿性磷酸酶活性，使核酸和蛋白質(zhì)合成增加。鋅、銅含量的升高可以促進(jìn)成骨細(xì)胞活性，有助于基質(zhì)的形成和鈣磷的沉積，促進(jìn)骨折愈合；也促進(jìn)彈性蛋白與膠原纖維的共價(jià)交聯(lián)，使膠原蛋白纖維韌性增強(qiáng)[8]。在骨骼愈合過(guò)程中提高微量元素在血清中的濃度，能夠補(bǔ)充酶系統(tǒng)缺少的輔酶從而有助于成骨細(xì)胞的功能，促進(jìn)骨鹽沉積；同時(shí)可以加強(qiáng)骨折端膠原纖維的交聯(lián)，促進(jìn)骨痂組織生長(zhǎng)，促進(jìn)骨折愈合。在本實(shí)驗(yàn)中，骨痂形成期的血清中鋅、銅的濃度在CRPE(2.4 g/kg)組明顯增加，提示CRPE可以通過(guò)提高血清中微量元素從而促進(jìn)骨折的愈合。

雖然在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的5種不同結(jié)構(gòu)的TGF-β中，有64%～82%的氨基酸序列相同，但是在骨折愈合過(guò)程中TGF-β不同的結(jié)構(gòu)作用各不相同，其中TGF-β1表達(dá)時(shí)間最久，作用最重要，它表達(dá)的高低影響骨折愈合的快慢[9]。其信號(hào)主要是通過(guò)TGF-β跨膜受體受體(TGF-β receptor R, TGF-βR，主要為TGF-β receptor Ⅰ, TGF-βRⅠ；TGF-β receptor Ⅱ, TGF-βRⅡ)以及胞內(nèi)Smad信號(hào)通路介導(dǎo)。當(dāng)外界有TGF-β1作用時(shí)，TGF-β1先與胞膜上TGF-βRⅡ結(jié)合，繼而磷酸化TGF-βRⅠ并使其激活。激活的TGF-βRⅠ可磷酸化胞內(nèi)的Smad2和Smad3蛋白，磷酸化的Smad2和Smad3蛋白與Co-Smad(Smad4)結(jié)合形成復(fù)合物(P-Smad2/3/4)，繼而轉(zhuǎn)位入核與特定DNA序列結(jié)合，調(diào)節(jié)相應(yīng)靶基因的表達(dá)[10]。Smad7可與TGF-βRⅡ胞內(nèi)端磷酸區(qū)結(jié)合，抑制TGF-βRⅠ激活，從而起到對(duì)TGF-β/Smad通路負(fù)反饋調(diào)節(jié)的作用[11]。此外，TGF-β1也可以在不同細(xì)胞中激活非Smad通路，這些通路包括絲裂原活化蛋白酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)通路、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)通路等[12]。PAI-1是TGF-β1重要的靶基因，作為纖溶酶原激活物的抑制劑，能通過(guò)抑制纖溶酶的生成，增加細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，在創(chuàng)傷修復(fù)、凝血、腫瘤轉(zhuǎn)移和炎癥中都有非常重要的作用[13]。在本實(shí)驗(yàn)中，CRPE(1.2 g/kg)和CRPE(2.4 g/kg)組能更顯著升高家兔骨組織中P-Smad2和P-Smad3蛋白及mRNA的水平，降低Smad7蛋白及mRNA的水平；而且CRPE(2.4 g/kg)組可以降低PAI-1蛋白及mRNA的水平。以上結(jié)果提示，CRPE可以通過(guò)激活TGF-β1/Smad信號(hào)通路中P-Smad2、P-Smad3和PAI-1，抑制Smad7來(lái)促進(jìn)骨折愈合。

綜上所述，CRPE可以促進(jìn)實(shí)驗(yàn)家兔骨折愈合，其機(jī)制可能與刺激TGF-β1分泌，促進(jìn)血鈣釋放，調(diào)節(jié)微量元素，增加Smad磷酸化，上調(diào)PAI-1的表達(dá)，抑制Smad7表達(dá)等有關(guān)。

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(編輯 卓選鵬)

Effect and mechanism of the compound of radix dipsaci and pseudo-ginseng extract on bone fracture in rabbits

NING Tao1,2, HU Yong1

(1. Department of Orthopedics, the First Affiliated Hospital of Anhui Medical University, Hefei 230032; 2. Department of Orthopedics,

Objective To evaluate the effect and mechanism of the compound of radix dipsaci and pseudo-ginseng extract (CRPE) on bone fracture in rabbits. Methods The model of rabbit tibia fracture was used to detect the effects of CRPE on callus formation time and healing time. TGF-β1, collagen type Ⅰ, collagen type Ⅱ, alkaline phosphatase, Ca, P, Zn, Cu in rabbit serum were also measured. The protein and mRNA of P-Smad2, P-Smad3, Smad7 and PAI-1 were detected by RT-PCR and Western blot to evaluate the protective effect of CRPE. Results CRPE (1.2 g/kg and 2.4 g/kg) could significantly shorten callus formation time and healing time; and increase TGF-β1, collagen type Ⅰ, collagen type Ⅱ, alkaline phosphatase, Ca, P, Zn, Cu levels in rabbit serum. In addition, CRPE(1.2 g/kg and 2.4 g/kg) could increase P-Smad2, P-Smad3 and PAI-1 expressions and reduce the expression of Smad7 (P<0.05). Conclusion CRPE can improve the prognosis of bone fracture in rabbits and its mechanism might be related to TGF-β/Smad pathway.

compound of radix dipsaci and pseudo-ginseng extract; bone fracture; TGF-β1; Smad; PAI-1

2016-01-23

2016-04-26

校科研基金資助項(xiàng)目(No.2015xkj088)

Supported by the Research Foundation of Anhui Medical University (No.2015xkj088)

胡勇. E-mail: hyong8277@163.com

R966

A

10.7652/jdyxb201606023

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20161013.1039.014.html(2016-10-13)