郭紅祥,李富欣,劉巧真,李素敏,郭愛芳,李 斐,丁 超

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,河南 鄭州 450002;2.河南省煙草公司 濟(jì)源市公司,河南 濟(jì)源 454650;3.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 煙草研究中心,河南 許昌 461000;4.河南省獲嘉縣種子公司,河南 獲嘉 453822)

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NtMYC1a轉(zhuǎn)錄因子的克隆與功能初步分析

郭紅祥1,李富欣2*,劉巧真3**,李素敏1,郭愛芳4,李 斐1,丁 超1

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,河南 鄭州 450002;2.河南省煙草公司 濟(jì)源市公司,河南 濟(jì)源 454650;3.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 煙草研究中心,河南 許昌 461000;4.河南省獲嘉縣種子公司,河南 獲嘉 453822)

從煙草根系中克隆NtMYC1a基因,構(gòu)建表達(dá)載體并在煙草中瞬時(shí)表達(dá),探討了NtMYC1a轉(zhuǎn)錄因子在煙堿生物合成中的作用。轉(zhuǎn)基因煙草中的NtMYC1a表達(dá)顯著升高,表明成功構(gòu)建了NtMYC1a表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化了煙草;轉(zhuǎn)基因煙草中的PMT表達(dá)量顯著升高,表明NtMYC1a能夠正調(diào)控?zé)焿A的合成;茉莉酸與干旱處理煙草后,檢測(cè)到NtMYC1a和PMT的表達(dá)量顯著升高,表明在茉莉酸、干旱促進(jìn)煙堿合成的生物學(xué)過程中,NtMYC1a具有正調(diào)控的功能。

轉(zhuǎn)錄因子；NtMYC1a;煙堿;茉莉酸;干旱

MYC類轉(zhuǎn)錄因子是bHLH轉(zhuǎn)錄因子超家族中的一員[1],編碼植物中髓細(xì)胞組織增生蛋白(Myelocytomatosis proteins, MYCs)。MYC的識(shí)別序列多為G-box CACGTG[2]。MYC轉(zhuǎn)錄因子具有多種調(diào)節(jié)功能,參與許多生理與發(fā)育過程,如光信號(hào)、開花結(jié)實(shí)、根的發(fā)育,以及蟲咬、干旱、低溫等各種脅迫應(yīng)答。茉莉酸(jasmonic acid,簡(jiǎn)稱JA；茉莉酸甲酯,簡(jiǎn)稱MeJA_)在植物體內(nèi)調(diào)控眾多的基因,其中調(diào)控?zé)焿A合成的路徑已基本被研究清楚,MYC是茉莉酸類激素響應(yīng)途徑中的核心轉(zhuǎn)錄因子,已有文獻(xiàn)報(bào)道MYC2參與JA調(diào)控活化的煙草生物堿合成[3-4]。

MYC家族與煙堿的合成密切相關(guān)。2004年Bingfang X等已證實(shí)煙堿合成關(guān)鍵酶PMT啟動(dòng)子的G-box元件對(duì)其表達(dá)極其重要[5]。2010年Andrea T等報(bào)道bHLH家族轉(zhuǎn)錄因子NbbHLH1 和NbbHLH2能與PMT的啟動(dòng)子元件G-box相結(jié)合激活啟動(dòng)子,正向調(diào)控?zé)焿A的合成。敲除基因后,N.benthamiana的煙堿合成基因下調(diào),葉片煙堿含量降低[6]。另外,Shoji T等2011年的EMSA實(shí)驗(yàn)顯示NtMYC2b能與PMT的G-box互作。實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明NtMYC2基因參與了打頂、傷害誘導(dǎo)、茉莉酸對(duì)煙堿合成的調(diào)控過程[7]。MYC1a和MYC2a/2b同屬M(fèi)YC轉(zhuǎn)錄因子家族,那么MYC1a是否參與對(duì)煙堿合成的調(diào)控呢？因此,本文從煙草中克隆MYC1a基因,構(gòu)建過表達(dá)載體,探討了NtMYC1a轉(zhuǎn)錄因子在煙堿生物合成中的作用,旨在為闡明煙草中煙堿生物合成的調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

從大田取栽培煙草品種K326的根系,經(jīng)液氮冷凍處理后,在-80 ℃下保存。取3月齡、長(zhǎng)勢(shì)一致的煙苗，用100 μmol/L MeJA進(jìn)行處理,在處理24 h后取樣,用液氮冷凍,-80 ℃保存。取3月齡、長(zhǎng)勢(shì)一致的煙苗，經(jīng)干旱處理20 d后取樣,用液氮冷凍,-80 ℃保存。

1.2 煙草根系RNA提取及cDNA合成

用TRIzol法從煙草根中獲得總RNA,用One Step PrimeScript RT-PCR Kit (TaKaRa公司) 反轉(zhuǎn)錄生成cDNA。

1.3 克隆煙草的NtMYC1a基因

根據(jù)MYC1a(GenBank登錄號(hào)GQ859158)設(shè)計(jì)引物,從煙草K326的cDNA中克隆到完整的CDS序列。F:TCTAGAAAGCTTCTGCAGGGGCCCGGGATGACTGATTACAGCTTACCCAC;R:TCGCCCTTGCTCACCATGGTACCTTAGCGTGTTTCAGCAACTCT(下劃線處分別為SmaⅠ和KpnⅠ酶切位點(diǎn))。

1.4 構(gòu)建表達(dá)載體pS1300-NtMYC1a

將NtMYC1a PCR產(chǎn)物切膠回收。利用SmaⅠ、KpnⅠ內(nèi)切酶對(duì)PS1300載體進(jìn)行雙酶切,之后切膠回收線性載體。利用無縫克隆試劑盒進(jìn)行連接。

1.5 煙草過表達(dá)載體的瞬時(shí)表達(dá)及檢測(cè)

選取8～10葉期、生長(zhǎng)良好的煙株,將農(nóng)桿菌GV3101菌株(pS1300- NtMYC1a)注射入煙草；3～4 d后取樣,取樣時(shí)剪取注射部位,用液氮速凍后置于-80 ℃冰箱保存。煙草總RNA的提取采用TRIzon法。以總RNA的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板,利用煙草的Actin(GenBank: AF126810)作為內(nèi)參基因,進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)，所用各引物序列見表1。

表1 RT-PCR檢測(cè)所用引物名稱及其序列

qPCR檢測(cè)分析使用SYBR_Premix Ex TaqTMII (TaKaRa)試劑盒進(jìn)行。反應(yīng)體系如下:2 μL cDNA,0.5 μL正、反引物,12.5 μL 2×SYBR_Premix Ex TaqTMII和9.5 μL水。按照以下程序進(jìn)行:95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s,57 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。

2 結(jié)果與分析

2.1NtMYC1a基因的克隆與過表達(dá)載體的構(gòu)建

以煙草的cDNA為模板克隆NtMYC1a基因,得到2046 bp的條帶(圖1),測(cè)序分析表明與NtMYC1a基因序列一致?；厥誔CR產(chǎn)物連接ps1300載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,篩選陽性克隆。圖2為雙酶切分析結(jié)果,目的條帶分別與ps1300載體的大小和NtMYC1a的大小一致。

圖1 PCR擴(kuò)增NtMYC1a結(jié)果

圖2 ps300-NtMYC1a雙酶切鑒定結(jié)果

2.2NtMYC1a的瞬時(shí)表達(dá)分析

從圖3可以看出：與對(duì)照葉片相比,轉(zhuǎn)化過表達(dá)載體ps300-NtMYC1a葉片中的NtMYC1a表達(dá)量上升顯著,增加了2.9倍,表明轉(zhuǎn)基因能夠增加NtMYC1a的表達(dá)；過表達(dá)載體ps300-NtMYC1a與對(duì)照ps300ck瞬時(shí)表達(dá)葉片相比,PMT表達(dá)量上升顯著,增加了4.6倍,表明NtMYC1a對(duì)煙堿合成有正調(diào)控作用。

2.3 茉莉酸對(duì)煙堿合成相關(guān)基因表達(dá)的影響

茉莉酸是調(diào)控?zé)焿A合成的一種重要植物激素。PMT是煙堿合成過程中的重要限速酶。從圖4中可以看出,茉莉酸處理煙草后,PMT的表達(dá)量升高近5倍,表明煙堿合成能力顯著增加。同時(shí)也檢測(cè)到NtMYC1a、NtMYC1b、NtMYC2a、NtMYC2b基因的表達(dá)量有不同幅度的升高,其中以NtMYC1a基因的表達(dá)量升高幅度最小,說明NtMYC1a在茉莉酸調(diào)控?zé)焿A合成中的作用相對(duì)較小。

圖3 MYC1a和PMT在轉(zhuǎn)基因煙草中的表達(dá)分析

圖4 茉莉酸對(duì)煙堿合成相關(guān)基因表達(dá)的影響

2.4 干旱對(duì)煙堿合成相關(guān)基因表達(dá)的影響

干旱是調(diào)控?zé)焿A合成的一種非生物脅迫因素。從圖5中可以看出,干旱脅迫能使PMT的表達(dá)量升高2.3倍,同時(shí)NtMYC1a、NtMYC1b、NtMYC2a、NtMYC2b基因的表達(dá)量分別升高4.9、3.1、1.2、1.3倍,表明NtMYC1a在干旱調(diào)控?zé)焿A合成中起重要作用。

圖5 干旱對(duì)煙堿合成相關(guān)基因表達(dá)的影響

3 討論

煙堿的合成受到眾多因素的影響且調(diào)控機(jī)制極其復(fù)雜,生物脅迫與非生物脅迫都影響煙堿的合成。如打頂、抹杈、蟲咬會(huì)導(dǎo)致煙堿含量增加[6-8],干旱、低溫等不利環(huán)境因素也會(huì)影響到煙堿的合成。另外,植物激素也是煙堿合成的重要調(diào)控因素,如茉莉酸、脫落酸、生長(zhǎng)素等。在煙草的栽培中,為了提高煙葉質(zhì)量,往往對(duì)煙株進(jìn)行打頂,去除煙草的頂端生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。打頂會(huì)引起煙株發(fā)生一系列的生理變化,例如根系的二次生長(zhǎng)、植物激素源改變、煙堿含量迅速增加等[9-11]。煙株打頂是一種傷害誘導(dǎo)，能引起JA含量的升高,JA能促進(jìn)根系合成煙堿,MYC2轉(zhuǎn)錄因子家族參與這一煙堿合成的調(diào)控過程[12-14]。本文結(jié)果顯示茉莉酸能夠大幅度促進(jìn)MYC2a/2b轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá),而MYC1a的表達(dá)量變化較小,說明打頂主要通過MYC2a/2b轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控?zé)焿A的合成。

干旱也是影響煙堿合成的一個(gè)非生物脅迫因素。本文結(jié)果顯示干旱能夠提高M(jìn)YC1a/1b和MYC2a/2b轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá),但MYC1a/1b的表達(dá)增加幅度明顯大于MYC2a/2b的,說明干旱主要通過MYC1a/1b轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控?zé)焿A的合成。

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(責(zé)任編輯:黃榮華)

Cloning and Function Analysis of Transcription Factor NtMYC1a from Tobacco

GUO Hong-xiang1, LI Fu-xin2*, LIU Qiao-zhen3**, LI Su-min1, GUO Ai-fang4, LI Fei1, DING Chao1

(1. College of Life Science, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China; 2. Jiyuan Tobacco Company of Henan Province, Jiyuan 454650, China; 3. Tobacco Research Center, Henan Academy of Agricultural Sciences, Xuchang 461000, China; 4. Seed Company of Huojia County in Henan Province, Huojia 453822, China)

The geneNtMYC1ain the roots of tobacco was cloned, its expression vector was constructed and transiently expressed in tobacco, and the role of transcription factor NtMYC1a in the biosynthesis of nicotine was investigated. The expression level ofNtMYC1ain transgenic tobacco plants was notably increased, suggesting that the constructed expression vector with NtMYC1a had been successfully transformed into tobacco plants. The expression level ofPMTin transgenic tobacco plants was remarkably enhanced, indicating that NtMYC1a could positively regulate the biosynthesis of nicotine. After tobacco plants were treated with jasmonic acid or drought, the expression levels of bothNtMYC1aandPMTin them were significantly increased, showing that NtMYC1a played a positive regulatory role in nicotine biosynthesis promoted by jasmonic acid or drought.

Transcription factor; NtMYC1a; Nicotine; Jasmonic acid; Drought

2016-01-30

河南省煙草公司科技重點(diǎn)項(xiàng)目(HYKJ201308)。

郭紅祥(1974─),男,河南獲嘉人,教授,博士,主要從事煙草生理生化研究工作。*并列第一作者:李富欣(1970─),男,河南宜陽人,高級(jí)農(nóng)藝師,博士,主要從事煙葉生產(chǎn)工作。**通訊作者:劉巧真。

Q785

A

1001-8581(2016)12-0080-03