傅 強(qiáng)，付 冰，葉 霞，譚 彬，鄭先波，李繼東，馮建燦

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，河南 鄭州 450002)

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差速離心結(jié)合脈沖電泳分離棗瘋病植原體DNA

傅 強(qiáng)，付 冰，葉 霞，譚 彬，鄭先波，李繼東，馮建燦*

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，河南 鄭州 450002)

為了解棗瘋病植原體的分子特征，明確植原體的致病機(jī)理及其與寄主的互作關(guān)系，以棗瘋病組培苗為材料，利用差速離心結(jié)合脈沖電泳分離棗瘋病植原體DNA。結(jié)果表明：感病組培苗在1600～2200 kb之間出現(xiàn)一條明亮的條帶，而健康組培苗沒(méi)有，回收后經(jīng)PCR檢測(cè)，證明該目的條帶是植原體DNA，實(shí)時(shí)定量PCR的分離結(jié)果表明：該實(shí)驗(yàn)方法能有效地將植原體基因組和植物基因組分離。

棗瘋病；植原體；脈沖電泳；PCR；RT-PCR

植原體(phytoplasma)是一類(lèi)沒(méi)有細(xì)胞壁，不能離體培養(yǎng)的植物病原原核生物。植原體病害遍布全球，給許多重要糧食作物、蔬菜、果樹(shù)、觀賞植物、林木樹(shù)和林蔭樹(shù)造成了巨大損失[1]。棗瘋病是一種由植原體引起的病害，在田間由昆蟲(chóng)介體傳播，一旦發(fā)病，通常小樹(shù)1～2年，大樹(shù)3～6年即逐漸枯死，給棗樹(shù)生產(chǎn)帶來(lái)了巨大損失[2]。植原體的代謝途徑、與寄主的互作關(guān)系一直受到廣大農(nóng)業(yè)和基礎(chǔ)科學(xué)研究者的關(guān)注。但由于植原體不能離體培養(yǎng)的特性，限制了對(duì)其分子特征、致病因子和控制及治愈其病害的研究[3]。因此，分離得到植原體基因組對(duì)植原體的研究非常重要。目前，已經(jīng)有4種植原體完成了分離測(cè)序、基因組信息分析，分別是洋蔥黃化植原體M株系[3]、翠菊黃化植原體[4]、澳大利亞金黃化葡萄植原體[5]、蘋(píng)果簇生植原體AT株系[6]。近幾年來(lái)，我國(guó)也開(kāi)展了對(duì)植原體基因組的分離，如西北農(nóng)林科技大學(xué)的陳旺等[7]分離得到650 kb大小的小麥藍(lán)矮植原體染色體DNA；中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)楊毅等[8]分離得到1100 kb的泡桐叢枝植原體染色體全長(zhǎng)；北京農(nóng)學(xué)院陳昱圻等[9]采用氯化銫雙苯酰亞胺密度梯度超速離心法從感病棗樹(shù)中提取富集植原體DNA，此方法未能確定棗瘋病植原體基因組大小。本實(shí)驗(yàn)以棗瘋病組培苗為材料，利用差速離心和脈沖電泳相結(jié)合，分離植原體染色體DNA，建立了一套完整的棗瘋病植原體染色體DNA的分離、純化及檢測(cè)體系。

1 材料與方法

1.1 材料

棗瘋病植原體保存于攜帶棗瘋病植原體的灰棗組培苗上，實(shí)驗(yàn)的陰性對(duì)照為健康的灰棗組培苗。組培苗均在MS培養(yǎng)基上繼代保存。取整株組培苗作為提取材料。

1.2 棗瘋病染色體DNA的提取

參考Neimark等[10]的方法，棗瘋病植原體DNA提取方法如下：取約2～3 g組培苗，加冷凍研磨液(0.125 mol/L K2HPO4,10%W/V蔗糖,50 mmol/L抗壞血酸，2% PVP-10，0.15% BSA,pH 7.6)研磨成勻漿。4 ℃，1500 r/min下離心5 min。取上清液，在4 ℃，18000 r/min下離心25 min。倒掉上清液，加10 mL重懸液(20 mmol/L Tris-HCl,10% sucrose，50 mmol/L EDTA，pH 8.0)重懸沉淀。將重懸液重復(fù)上述2次離心，沉淀在100～200 μL重懸液中重懸。將重懸液在37 ℃下溫育5～10 min，然后加入等體積1%的低熔點(diǎn)瓊脂糖混勻，并迅速將混合液倒入遇冷的模具中，室溫放置使膠塊完全凝固，凝固后的膠塊在裂解緩沖液(0.5 mol/L EDTA、1% SDS、1.0 mg/mL蛋白酶K，pH 8.0)中，52 ℃水浴4 d，凝膠塊完全消化至透明狀后取出膠塊，用TE buffer(10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA)沖洗3次，然后，加入10倍體積的TE于4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 脈沖場(chǎng)電泳

凝膠塊在TE中平衡過(guò)夜后，不經(jīng)過(guò)酶切或物理打斷，直接用于脈沖電泳，實(shí)驗(yàn)對(duì)電泳過(guò)程中的電壓、脈沖轉(zhuǎn)換時(shí)間及電泳時(shí)間進(jìn)行了調(diào)整，找到了最佳電泳條件。電泳結(jié)束，將凝膠放入加有綠如藍(lán)的TBE溶液中染色30 min，蒸餾水脫色10 min，紫外燈下成像保存。

1.4 植原體DNA的回收

用GELase和透析膜回收DNA，切下含DNA樣品的膠條，溶膠后加入2 μL GELase消化，43 ℃下溫浴45 min，5000 r/min離心1min收集DNA，將收集到的DNA轉(zhuǎn)移到透析膜上，靜置2.5 h，轉(zhuǎn)移DNA到離心管中，室溫下平衡過(guò)夜。

1.5 植原體DNA的PCR檢測(cè)

用植原體通用引物[11]R16F2n(5’-GAAACGACTGCTAAGACTGG-3’)和R16F2(5’-TGACGGGCGGTGTGTACAAACCCCG-3’)及根據(jù)棗瘋病植原體16SrDNA序列設(shè)計(jì)的特異引物JWB-F(5’-CGCTAAAGTCCCCACCATTA-3’)和JWB-R(5’-CACATTGGGACTGAGACACG-3’)，檢測(cè)回收植原體DNA。PCR條件：94 ℃，4 min；94 ℃，45 s，60 ℃/56 ℃,45 s，72 ℃，1 min；72 ℃，10 min，35個(gè)循環(huán)。

1.6 熒光定量PCR分析

用美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司7300/7500實(shí)時(shí)定量PCR儀，分別以感病棗總DNA、回收純化DNA為模板，根據(jù)瘋病植原體16SrDNA序列和棗樹(shù)26SrDNA序列，設(shè)計(jì)用于定量PCR的引物F1:5’-CGGCTTGCTGGGTCTTTACTG-3’、R1:5’-CATGATCCACCGCTTGTGC-3’和F2:5’-GAACAGCCCAGGTTGAGAATC-3’、R2:5’-TCCCAAACAACCCGACT-3’，采用2-ΔΔCt對(duì)植原體的16SrDNA基因和棗樹(shù)26SrDNA基因進(jìn)行相對(duì)定量分析，確定植原體純化效果。實(shí)時(shí)定量PCR的條件：50 ℃，2 min；95 ℃，10 min；95 ℃,15 s；60 ℃，1 min，共35個(gè)循環(huán)。

2 結(jié)果與分析

2.1 棗瘋病植原體的提取及脈沖電泳純化

用2～3 g感病組培苗，經(jīng)差速離心得到200 μL重懸液，包埋于等體積的1%低熔點(diǎn)瓊脂糖中，52 ℃水浴鍋中裂解4 d后，呈透明狀，在TE中平衡過(guò)夜后直接用于脈沖電泳。實(shí)驗(yàn)電泳條件為：14 ℃，電壓6 V/cm，脈沖轉(zhuǎn)換時(shí)間60～120 s，電泳夾角120°，電泳時(shí)間為21 h或24 h時(shí)樣品均在最下方出現(xiàn)一條明亮的條帶，同時(shí)酵母染色體PFGmarker條帶模糊且不完整(圖1-a)。經(jīng)調(diào)整發(fā)現(xiàn)當(dāng)電泳條件為：14 ℃，電壓6 V/cm，脈沖轉(zhuǎn)換時(shí)間40～90 s，電泳夾角120 ℃，電泳時(shí)間為21 h時(shí)，酵母染色體PFGmarker條帶清晰完整，感病棗組培苗泳道中出現(xiàn)一條明亮的條帶，而健康對(duì)照無(wú)此條帶，通過(guò)與酵母染色體PFGmarker進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)此條帶在1600～2200 kb之間(圖1-b)。

1.健康灰棗組培苗；2.感病灰棗組培苗圖1 脈沖電泳

2.2 PCR檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)回收到25 μL濃度為1208.5 ng/μL的DNA,分別以感病棗總DNA和回收純化DNA為模板，用植原體通用引物(1200 bp)和棗瘋病特異引物(800 bp)均檢測(cè)到明亮的目的條帶，而健康對(duì)照沒(méi)有(圖2)，說(shuō)明純化的目的條帶是棗瘋病植原體DNA。

2.3 植原體DNA純化效果檢測(cè)

熒光定量PCR通過(guò)熒光燃料對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記，結(jié)合相應(yīng)軟件對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析，計(jì)算樣品中目標(biāo)DNA的濃度。實(shí)驗(yàn)用棗瘋病植原體定量引物和植物基因組定量引物，對(duì)植原體和棗基因組進(jìn)行定量分析，結(jié)果表明：回收純化DNA中幾乎沒(méi)有植物基因組，分析植原體基因組和棗基因組相對(duì)量的變化，結(jié)果見(jiàn)圖3，由此表明經(jīng)差速離心及脈沖電泳可以將棗瘋病植原體基因組和植物基因組分開(kāi)，且分離得到的DNA中植原體濃度高于感病棗總DNA。

A.16SrDNA基因;B.JWB特異引物;1～3.健康棗DNA;4～6.感病棗總DNA;7～9.回收純化DNA圖2 棗瘋病植原體PCR檢測(cè)

1.回收純化DNA;2.感病棗總DNA圖3 熒光定量PCR分析

3 結(jié)論與討論

目前，分離植原體基因組DNA有2種方法：一種是氯化銫梯度離心法，此方法操作復(fù)雜，獲得的植原體染色體DNA不完整，但是效率較高[12-14]。1990年Kollar等[15]采用氯化銫濃度梯度離心法，從感染蘋(píng)果簇生植原體的長(zhǎng)春花中分離到含有0.1%～3.0%植物總DNA的蘋(píng)果簇生植原體；2007年Tran-Nguyen等[16]采用氯化銫濃度梯度離心法分離到90%澳大利亞暫定屬植原體染色體DNA。另一種方法是差速離心結(jié)合脈沖電泳分離，脈沖電泳(PFGE)是一種分離大分子DNA的方法，可以分離大小從10 kb到10 Mb的DNA分子[11]。此方法中采用低熔點(diǎn)瓊脂糖包埋樣品，再進(jìn)行原位裂解和去蛋白處理從而釋放DNA，細(xì)胞裂解所釋放的DNA大片段包埋在膠栓中，這個(gè)過(guò)程中阻止了機(jī)械力對(duì)DNA大片段的剪切作用，能夠獲得完整的植原體DNA，操作簡(jiǎn)單，但是效率較低。

本實(shí)驗(yàn)采用差速離心提取植原體DNA，結(jié)合脈沖電泳分離純化，與Neimark[10,13]、楊毅[8]等的實(shí)驗(yàn)相比，未經(jīng)酶切和微輻射過(guò)程，希望獲得完整的環(huán)狀植原體DNA。脈沖電泳中的轉(zhuǎn)換時(shí)間可以改變DNA分子的電場(chǎng)，每次電場(chǎng)轉(zhuǎn)變，DNA分子就會(huì)改變移動(dòng)方向，大分子DNA轉(zhuǎn)變的慢，所以移動(dòng)速率慢，因此通過(guò)調(diào)整脈沖轉(zhuǎn)換時(shí)間找到目的DNA分子的最適轉(zhuǎn)換時(shí)間是脈沖電泳關(guān)鍵的一步[19]，實(shí)驗(yàn)參考脈沖電泳使用和應(yīng)用指南[17]，對(duì)脈沖電泳條件進(jìn)行了探索，最終感病樣品在1600～2200 kb之間出現(xiàn)了一條明亮條帶，而健康對(duì)照沒(méi)有，經(jīng)回收檢測(cè)此條帶是棗瘋病植原體DNA。但是目前已報(bào)道測(cè)序完成的植原體基因組大小都在530～1350 kb之間[14]，而本實(shí)驗(yàn)中，獲得的棗瘋病植原體DNA遠(yuǎn)大于已知植原體基因組大小，可能原因還有待進(jìn)一步測(cè)序驗(yàn)證。

對(duì)感病棗總DNA和回收純化DNA中植原體基因組和棗基因組的相對(duì)定量分析表明：本實(shí)驗(yàn)分離的棗瘋病植原體基因組DNA中有極少量棗基因組污染，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)的方法可以將植原體基因組和棗基因組有效的分離，但是由于大片段DNA回收過(guò)程困難，導(dǎo)致DNA的降解，損失嚴(yán)重，使得回收純化DNA和感病棗總DNA中植原體濃度相差不大。

根據(jù)植原體16SrRNA基因序列分類(lèi)，植原體可以分為三大支，包括16SrⅠ、16SrⅫ、16SrⅩ、16SrⅤ等分組及其亞組[18]。棗瘋病植原體屬于16SrⅤ-B亞組，棗瘋病植原體所在的分支中包含最多的植原體分組，但是目前該分支中的植原體沒(méi)有完成基因組分離測(cè)序的，本實(shí)驗(yàn)首次用脈沖電泳分離了棗瘋病植原體，經(jīng)回收檢測(cè)可以用于測(cè)序。進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，獲得棗瘋病植原體完整的基因組DNA序列，將為進(jìn)一步研究植原體的致病機(jī)理，與寄主的互作關(guān)系等提供科學(xué)依據(jù)。

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(責(zé)任編輯：曾小軍)

Isolation of Phytoplasma Genomic DNA from Jujube Witches Broom by Differential Centrifugation Combined with PFGE

FU Qiang, FU Bing, YE Xia, TAN Bin, ZHENG Xian-bo, LI Ji-dong, FENG Jian-can*

(College of Horticulture, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China)

In order to know the molecular characteristics and pathogenic mechanism of jujube witches broom (JWB) phytoplasma, as well as its interaction with the host, the author isolated the phytoplasma genomic DNA from JWB in tissue-culture jujube seedlings by using differential centrifugation combined with pulsed field gel electrophoresis (PFGE). The results indicated that the infected tissue-culture seedlings had a bright stripe in 1600～2200 kb, but the healthy tissue-culture seedlings had not. After recycling, PCR detection proved that this target stripe was the phytoplasma genomic DNA of JWB. The separation results of real-time quantitative PCR showed that this experimental method could effectively separate the phytoplasma genome and plant genome.

JWB; Phytoplasma; PFGE; PCR; RT-PCR

2016-06-16

河南省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系大宗水果產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(S2014-11-G02)；河南省高?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊(duì)支持計(jì)劃項(xiàng)目(14IRTSTHN011)。

傅強(qiáng)(1991─)，女，河南南陽(yáng)人，碩士研究生，研究方向：果樹(shù)分子育種。*通訊作者：馮建燦。

S665.1

A

1001-8581(2016)12-0066-04