衛(wèi)艷萍，史四季，張如幸，劉秀琴，趙林棟

槲皮素對人黑素瘤A375細(xì)胞增生和凋亡的影響

衛(wèi)艷萍，史四季，張如幸，劉秀琴，趙林棟

目的 探討槲皮素對體外培養(yǎng)人黑素瘤A375細(xì)胞增生和凋亡的影響。方法 CCK8法檢測0、20、40、80、160 μmol/L濃度槲皮素作用于A375細(xì)胞24、48 和72 h后細(xì)胞增生水平。用0、20、40、80、160 μmol/L濃度槲皮素作用24 h后，以Annexin-V/PI法觀察A375細(xì)胞凋亡，分別測定Caspase 3、Caspase 8和Caspase 9的活性，并以蛋白印跡法（Western blot）檢測p53，Bax及Bcl-2的基因蛋白水平。結(jié)果 與空白對照組比較，20、40、80、160 μmol/L槲皮素作用24、48和72 h后均對A375細(xì)胞的增生有抑制作用，且有時間、濃度依賴性。0、20、40、80、160 μmol/L槲皮素在作用24 h時，A375細(xì)胞早期凋亡率由（3.02±0.49）%分別上升至（11.20±1.68）%、（12.44±1.68）%、（24.55±0.58）%和（47.68±0.79）%，各組與對照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或＜0.01），80、160 μmol/L作用組的Caspase 3，Caspase 8，Caspase 9活性升高，且與對照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或＜0.01）。p53及Bax的蛋白水平隨藥物濃度的增加而升高，Bcl-2的蛋白水平隨藥物濃度增加而降低。結(jié)論 槲皮素對黑素瘤A375細(xì)胞具有抑制增生和誘導(dǎo)凋亡的作用，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)p53及Bcl-2/ Bax基因有關(guān)。

黑素瘤；槲皮素；凋亡；增生

衛(wèi)艷萍

槲皮素（quercetin）是從槲皮中提取的一種5-羥基黃酮類化合物，廣泛存在于蔬菜、水果及多種中草藥中，具有多種生物學(xué)活性[1-3]。槲皮素作用廣泛，不僅能夠抑制多種腫瘤細(xì)胞的增生及促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，而且與其他抗腫瘤藥物聯(lián)用后可增強(qiáng)藥物對腫瘤細(xì)胞的敏感性，可作為一種潛在的抗癌藥物，臨床應(yīng)用廣泛[4]。槲皮素可以干擾細(xì)胞酶、受體、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和信號系統(tǒng)[5]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素對多種惡性腫瘤細(xì)胞有生長抑制作用，如乳腺癌、肝癌、宮頸癌、腦膠質(zhì)瘤、黑素瘤[6]等。但對于黑素瘤細(xì)胞的促凋亡及其分子機(jī)制及其信號傳導(dǎo)途徑少見報道。本研究即以體外培養(yǎng)的人黑素瘤A375細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對象，通過測定半胱氨酸天冬氨酸酶（Caspase）活性和p53、Bax及Bcl-2基因蛋白表達(dá)水平的變化，初步探討槲皮素誘導(dǎo)黑素瘤細(xì)胞凋亡的途徑和調(diào)節(jié)機(jī)制。

1　材料與方法

1.1材料

人皮膚黑素瘤A375購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院上海細(xì)胞庫。槲皮素（購自美國Sigma公司）用前溶于二甲基亞砜 （DMSO），配制成1 mol/L溶液，加藥前用含10%DMSO的滅菌雙蒸水配制成所需的實(shí)驗(yàn)濃度。DMSO、Hoechst33258（美國Sigma公司），RPMI1640培養(yǎng)液、胰蛋白酶（Gibco公司），新生牛血清（四季青生物公司），CCK8試劑盒（日本同仁化學(xué)公司），Annexin-V/PI凋亡檢測試劑盒（美國BD Pharmingen公司），Caspase-Glo@3/7，8，9檢測試劑盒（美國Promega公司），Bcl-2抗體，Bax抗體（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司），p53抗體（美國Santa Cruz公司）。

1.2方法

1.2.1藥物配制 藥物溶解于DMSO，槲皮素終濃度分別為0、20、40、80、160 μmol/L；DMSO在培養(yǎng)基中的最大終濃度＜0.2%，經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)對細(xì)胞增生無影響。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng) 使用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2的孵箱中培養(yǎng)A375細(xì)胞，取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3CCK8檢測細(xì)胞增生抑制率 將對數(shù)生長期的A375細(xì)胞按每孔1 × 104個細(xì)胞分別接種于96孔板，在37℃、5% CO2下孵育24 h，去上清液，每孔加入一定濃度槲皮素（0、20、40、80、160 μmol/L）的1640培養(yǎng)基100 μl，每一濃度設(shè)3個復(fù)孔?？瞻讓φ战M直接加1640培養(yǎng)基100 μl，分別培養(yǎng)24 、48 、72 h后，以1640培養(yǎng)基小心洗滌細(xì)胞2次，每孔加人100 μl 1640培養(yǎng)基，再加入10 μl的CCK8溶液，在37 ℃、5% CO2下孵育2 h，在酶標(biāo)儀450 nm波長下測量各孔吸光度值， 細(xì)胞增殖抑制率=（空白對照組平均吸光度值-給藥組平均吸光度值）/空白對照組平均吸光度值×100%。

1.2.4槲皮素對細(xì)胞凋亡率的影響 收集經(jīng)0、20、40、80、160 μmol/L槲皮素作用24 h后的A375細(xì)胞，預(yù)冷的PBS洗滌2遍，以1×連接緩沖液將細(xì)胞密度調(diào)整為1 × 106個/ml，采用乙硫氰酸熒光素(Annexin V)-FITC/碘化丙錠(PI)雙染法，每管加Annexin V-FITC 5 μl、PI 5 μl，輕輕振蕩混勻，室溫避光染色15 min，每管加400 μl 1×連接緩沖液，采用流式細(xì)胞儀測定槲皮素作用下細(xì)胞的凋亡率。

1.2.5Caspase活性的測定 選擇對數(shù)生長期的A375細(xì)胞，1640培養(yǎng)基調(diào)制成細(xì)胞懸液，以每孔100 μl、1 × l05個/ml的細(xì)胞密度接種在不透光的白底96孔培養(yǎng)板，在37℃、5%CO2下孵育24 h，去上清液，每孔加入一定濃度槲皮素（0、20、40、80、160 μmol/L）的培養(yǎng)基100 μl，每個濃度設(shè)3個復(fù)孔，對照組直接加培養(yǎng)基，空白組不加細(xì)胞只加培養(yǎng)基，作用24 h后，將10 μl GF-AFC與2 ml細(xì)胞活力測定緩沖液混合，每孔中加入20 μl混合液，充分搖勻后37℃避光孵育30 min，測定細(xì)胞活力。接著每孔加入120 μl Caspase-Glo@3/7，Caspase-Glo@8或 Caspase -Glo@9試劑繼續(xù)避光孵育30 min，以熒光檢測儀讀數(shù)除以細(xì)胞活力讀數(shù)即為平均每個細(xì)胞的Caspase活性值。

1.2.6p53，Bcl-2，Bax基因蛋白水平檢測 采用Western blot法，將A375細(xì)胞分別與0、40、80、160 μmol/L槲皮素的培養(yǎng)基2 ml作用24 h，提出相同質(zhì)量的蛋白，進(jìn)行凝膠電泳后將蛋白電轉(zhuǎn)印到硝酸纖維膜上，以含5%的脫脂奶粉的TBST緩沖液室溫封閉1 h，p53抗體，Bcl-2抗體，Bax抗體4℃孵育過夜，繼以二抗室溫孵育l h，化學(xué)發(fā)光法檢測反應(yīng)條帶。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，每組數(shù)據(jù)取平均值，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1細(xì)胞增生抑制率

與空白對照組比較，20、40、80、160 μmol/L槲皮素作用24、48、72 h，均對A375細(xì)胞有抑制作用，且與時間、濃度呈依賴關(guān)系。槲皮素能抑制皮膚黑素瘤A375細(xì)胞的增生活性，隨著藥物濃度的增加和作用時間的延長，槲皮素對A375細(xì)胞的生長抑制率逐漸增加，如圖1所示，各組與對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.01）。

圖1　不同濃度槲皮素對A375細(xì)胞增殖抑制的影響

2.2細(xì)胞凋亡率

0、20、40、80、160 μmol/L槲皮素在作用24 h時，A375細(xì)胞早期凋亡率由0 μmol/L組的（3.02 ±0.49）%分別上升至（11.20± 1.68）%、（12.44±1.68）%、（24.55 ±0.58）%、（47.68±0.79）%，除0 μmol/L外的各組與空白對照組間相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。槲皮素能促進(jìn)A375細(xì)胞的凋亡，隨著藥物濃度的增加，A375細(xì)胞的凋亡率逐漸升高。流式細(xì)胞檢測儀檢測A375細(xì)胞凋亡率結(jié)果見圖2。

2.3Caspase活性

如 表 l所 示， 20、40、80、160 μmol/L槲皮素在作用24 h槲，A375細(xì)胞的Caspase 3活性升高最為明顯，分別為對照組的112.23%，129.33%，186.75% 和449.65%。80、160 μmol/L作用組的Caspase 8，Caspase 9活性也明顯升高，與對照組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。結(jié)果顯示，槲皮素作用A375細(xì)胞24 h后，Caspase 3，Caspase 8和Caspase 9的活性均呈濃度依賴性增加。

2.4Bcl-2、p53及 Bax蛋白水平

圖2　槲皮素對A375細(xì)胞凋亡率的影響

表1　槲皮素對A375細(xì)胞Caspase活性的影響（　±s，分）

表1　槲皮素對A375細(xì)胞Caspase活性的影響（　±s，分）

注：與對照組相比，aP＜0.05，bP＜0.0l

組 別 n Caspase 3 Caspase 8 Caspase 9空白對照組 5 100.00±3.20 100.00±3.26 100.00±3.26槲皮素0 μmol/L 5 101.27±2.45 99.74±4.18 102.39±3.75槲皮素20 μmol/L 5 112.23±1.44a90.27±1.28a92.46±1.80a槲皮素40 μmol/L 5 129.33±0.97b112.73±1.00 102.66±3.60a槲皮素80 μmol/L 5 186.75±3.24a126.29±0.98b130.77±0.55b槲皮素160 μmol/L 5 449.65±0.55b186.43±4.27a192.25±6.21

使用Western blot法對空白對照組、40、80、160 μmol/L槲皮素作用24 h后，對A375細(xì)胞中的Bcl-2、p53和Bax進(jìn)行檢測。應(yīng)用BandScan4.5圖像分析軟件，以β-肌動蛋白的表達(dá)灰度值為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算Bcl-2、p53及Bax蛋白的相對量。對照組、40、80、160 μmol/L組的Bcl-2表達(dá)與β-肌動蛋白的灰度比值分別為0.98、1.08、0.80、0.20；p53表達(dá)與β-肌動蛋白的灰度比值分別為0.28、0.48、0.89、0.96；Bax表達(dá)與β-肌動蛋白的灰度比值分別為0.24、0.49、0.80、0.94?？梢?，以未處理A375細(xì)胞為對照，p53、Bax在槲皮素作用的A375細(xì)胞中的表達(dá)隨藥物濃度的增加而升高，Bcl-2在槲皮素作用的A375細(xì)胞中的表達(dá)隨藥物濃度的增加而降低（圖3）。

3　討論

自1971年美國的一項(xiàng)研究首次發(fā)現(xiàn)槲皮素在臨床上治療白血病有效后，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素可抑制多種癌細(xì)胞的增生，其作用機(jī)制可能是通過抑制腫瘤細(xì)胞的信號傳導(dǎo)、抑制細(xì)胞周期[7]、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡及分化[8]等。此外，槲皮素尚可抑制腫瘤血管生成和轉(zhuǎn)移等多種途徑來發(fā)揮其抗腫瘤作用[9]，因而推測其將是很有應(yīng)用前景的治療癌癥的天然藥物，特別對生長較快的惡性腫瘤可能具有明顯的抑制作用。目前對于槲皮素作用于人黑素瘤A375細(xì)胞的研究報道較少。

圖3　槲皮素對A375細(xì)胞Bcl-2、p53和Bax蛋白表達(dá)的影響

本研究結(jié)果表明，槲皮素能抑制皮膚黑素瘤A375細(xì)胞的增生活性，且這種作用隨著藥物濃度的升高和作用時間的增加而逐漸增強(qiáng)，具有濃度和時間的依賴性。槲皮素可抑制黑素瘤細(xì)胞的增生，且隨藥物濃度增加，凋亡率也隨之增加。誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡主要有Caspase依賴途徑和非Caspase依賴途徑，而以前者為主[10]。Caspase家族被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的中心環(huán)節(jié)。目前認(rèn)為至少有3條通路參與凋亡的發(fā)生，包括經(jīng)典的兩條細(xì)胞凋亡途徑，即細(xì)胞外途徑（細(xì)胞表面死亡受體途徑）和細(xì)胞內(nèi)途徑（線粒體引發(fā)途徑），以及新近引起關(guān)注的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路[11]。筆者通過Caspase活性測定，檢測3種重要的凋亡相關(guān)蛋白激酶Caspase3，Caspase 8和Caspase 9在槲皮素作用于A375細(xì)胞時的活性變化。結(jié)果顯示，以20、40、80、160 μmol/L的槲皮素作用A375細(xì)胞24 h后，3種蛋白酶的活性均呈濃度依賴性增加，提示槲皮素可通過細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外兩種途徑誘導(dǎo)A375細(xì)胞凋亡。

p53蛋白是第一個被確認(rèn)與DNA損傷引起的凋亡有關(guān)的蛋白，它在調(diào)控細(xì)胞凋亡過程中起重要作用。活化的p53可以轉(zhuǎn)錄激活一系列凋亡效應(yīng)分子，通過細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外途徑誘導(dǎo)凋亡。Bcl-2基因家族是細(xì)胞凋亡的重要調(diào)節(jié)者。根據(jù)其對細(xì)胞凋亡作用的功能特點(diǎn)，可將Bcl-2蛋白家族分為兩類：促凋亡蛋白家族如Bax、Bak、Bad、Bid、Bim，抗凋亡蛋白家族如Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-W、Mcl-1[12]。用Western blot測定槲皮素作用的A375細(xì)胞中Bcl-2及Bax、p53蛋白水平變化，p53蛋白及其下游基因Bax蛋白的表達(dá)水平隨槲皮素濃度的增加而增強(qiáng)，而其下游基因Bcl-2蛋白水平則因槲皮素的作用逐漸降低?？梢姡纹に乜赏ㄟ^激活p53蛋白誘導(dǎo)黑素瘤A375細(xì)胞的凋亡。同時，槲皮素也通過調(diào)節(jié)Bcl-2家族，尤其是降低Bcl-2與Bax的比值誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，槲皮素對黑素瘤A375細(xì)胞具有抑制增生和誘導(dǎo)凋亡的作用，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)p53及Bcl-2/Bax基因有關(guān)，對其更加深入的機(jī)制研究，有待進(jìn)一步探討。

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（本文編輯耿建麗）

Effects of quercetin on the proliferation and apoptosis of A375 human melanoma cells

WEIYan-ping，SHISi-ji，ZHANGRu-xing，etal
DepartmentofDermatology,Jiaozuopeople′sHospital,Jiaozuo454002,China

Objective To study the effect of quercetin on the proliferation and apoptosis of A375 human melanoma cells. Methods Cell counting kit-8 (CCK8) was used to evaluate the proliferative activity of A375 cells which treated with quercetin of 0, 20, 40, 80, 160μmol/L for 24 h, 48 h and 72 h respectively. Subsequently, A375 cells that treated with the same method underwent double staining with annexin V and propidium iodide for the detection of cell apoptosis, and fl uorometric assay for the estimation of Caspase 3, Caspase 8 and Caspase 9 activity, and Western blot for the determination of the levels of p53, Bax and Bcl-2 proteins. Results Within the investigated concentration and time ranges, quercetin signifi cantly inhibited the proliferative activity of A375 cells in a concentrationdependent and time-dependent manner. Compared with blank groups, a signifi cant increase was observed in the early apoptosis rate in A375 cells treated with quercetin of 0, 20, 40, 80, 160 μmol/L for 24 h (11.20±1.68)%, (12.44±1.68)%, (24.55±0.58)% and (47.68±0.79)% vs (3.02±0.49)%, (P＜0.05 or 0.01), as well as in the activity of Caspase 3, 8 and 9 in A375 cells treated with quercetin of 80, 160μmol/L for 24 h (P＜0.05 or 0.01). After 24 h treatment, the protein levels of p53 and Bax were elevated, but Bcl-2 was decreased in A375 cells with the increase of quercetin concentration. Conclusion Quercetin can inhibit the proliferation and induce the apoptosis of A375 cells, and the apoptosis-inducing effect may occur through modulating the express of p53 and Bcl-2/Bax genes.

Melanoma；Quercetin；Apoptosis；Proliferation [JPractDermatol, 2016, 9(3):171-174]

R739.5

A

1674-1293(2016)03-0171-04

10.11786/sypfbxzz.1674-1293.20160304

454002焦作，焦作市人民醫(yī)院皮膚性病科（衛(wèi)艷萍，史四季，張如幸，劉秀琴，趙林棟）

衛(wèi)艷萍，碩士研究生，研究方向：皮膚外科E-mail:weiyanping1977716@126.com

趙林棟，E-mail:jz_zld@163.com

（2016-02-16

2016-05-11）