劉　蓮，張　斌，何　威，王儒鵬，周春麗，王　為，王玉娟，黃　珂

? 論著 ?

鹵米松對角質(zhì)形成細胞維生素D受體表達的影響

劉蓮，張斌，何威，王儒鵬，周春麗，王為，王玉娟，黃珂

劉　蓮

目的觀察鹵米松對角質(zhì)形成細胞維生素D受體（vitamin D receptor，VDR）表達的影響，以探討糖皮質(zhì)激素對維生素D3衍生物治療銀屑病效應的潛在影響。方法采用CCK8法觀察不同濃度鹵米松、卡泊三醇在不同時相點下對HaCaT角質(zhì)形成細胞增殖的影響；采用反轉(zhuǎn)錄-實時熒光定量聚合酶鏈反應（PCR）、蛋白印跡法，觀察不同濃度鹵米松在不同時相點作用下HaCaT細胞VDR的表達情況。結(jié)果鹵米松可增強卡泊三醇對HaCaT細胞增殖的抑制作用；鹵米松作用24 h、48 h后，HaCaT細胞中VDR mRNA及蛋白水平均明顯升高，并呈劑量依賴性效應。結(jié)論鹵米松上調(diào)VDR的表達可能有助于提高角質(zhì)形成細胞對維生素D3衍生物作用的反應性，從而有可能提高維生素D3衍生物對角質(zhì)形成細胞的治療效應。

鹵米松；卡泊三醇；維生素D受體；增殖；角質(zhì)形成細胞

尋常性銀屑病是一種以紅斑、鱗屑為主要臨床表現(xiàn)的慢性復發(fā)性炎癥性皮膚疾病，以表皮細胞過度增殖、異常分化為其組織病理特征[1]。外用療法為治療銀屑病的主要手段之一，糖皮質(zhì)激素（glucocorticoid，GC）和維生素D3衍生物（vitamin D3 analog）是治療銀屑病的一線外用藥物之一。GC與維生素D3衍生物主要分別通過與細胞中對應的受體GRα、VDR相結(jié)合而發(fā)揮效應。大量臨床觀察表明，GC聯(lián)合維生素D3衍生物外用治療銀屑病的療效明顯優(yōu)于兩藥單用[2]。曾有研究發(fā)現(xiàn)地塞米松可上調(diào)小鼠鱗狀細胞癌癌細胞中VDR的表達[3]，這提示了GC對VDR表達的潛在調(diào)節(jié)效應。鑒于GRα和VDR均屬于核受體超家族成員并可能存在著一定程度的相互影響，那么當外用GC與維生素D3衍生物聯(lián)合治療銀屑病時，GC是否對維生素D3衍生物的治療效應產(chǎn)生影響呢？為此，本實驗以HaCaT角質(zhì)形成細胞為研究對象，觀察不同濃度鹵米松、卡泊三醇在不同時間點對人永生化角質(zhì)形成細胞（HaCaT細胞）增殖的影響及鹵米松作用后VDR的表達情況，以探討鹵米松對維生素D3衍生物治療效應的潛在影響。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1細胞來源HaCaT細胞購于中國醫(yī)學科學院上海細胞所。

1.1.2主要試劑卡泊三醇、鹵米松（澳美藥業(yè)惠贈），二甲基亞砜（美國Sigma公司），胎牛血清（杭州四季青公司），1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶（Hyclone公司），兔抗人VDR多克隆抗體（美國Abcam公司），兔抗小鼠GAPDH單克隆抗體（碧云天生物工程有限公司），辣根過氧化酶標記的山羊抗兔、辣根過氧化酶標記的山羊抗小鼠（北京中杉金橋公司），聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜，Millipore公司），BeyoECL Plus顯色試劑（碧云天生物工程有限公司），RNAiso Plus、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒、SYBR?Premix Ex TaqTM II試劑盒（日本TaKaRa Bio株式會社），CCK-8試劑盒（日本同仁生化研究所）。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)及處理用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d傳代1次。根據(jù)國外相關研究[4,5]和本課題組預實驗結(jié)果，將鹵米松和卡泊三醇溶解于二甲基亞砜中配置成10-1mol/L的原液，使用時再用完全培養(yǎng)基稀釋，設定鹵米松和卡泊三醇的作用濃度和時間，以含不同濃度的鹵米松（10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/ L、10-4mol/L）、 卡 泊 三 醇（10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L）及未加藥的培養(yǎng)液作用于HaCaT細胞24 h、48 h，分別收集細胞中的蛋白質(zhì)和RNA。

1.2.2CCK-8增殖試驗選用3～5代HaCaT細胞為研究對象，將HaCaT細胞配制成細胞懸液，96孔板中每孔加入3×103個細胞，設置5個復孔，培養(yǎng)12 h后棄培養(yǎng)基，加入100 μl不同濃度卡泊三醇溶液（10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L）。參照文獻[6]，選用10-5mol/L鹵米松與不同濃度卡泊三醇（10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L）混合后作用于HaCaT細胞，加藥24 h、48 h后，棄培養(yǎng)基，PBS洗2遍，每孔中加入含10% CCK-8的無血清培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)箱中孵育30 min，用酶標儀于450 nm處測各孔A值，重復實驗3次。

1.2.3qRT-PCR

1.2.3.1引物設計按照實時熒光定量PCR原則設計引物，檢索NCBI數(shù)據(jù)庫、Nucleotide數(shù)據(jù)庫設計內(nèi)參引物三磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH），GAPDH引物：上游CATCAAGAAGGTGGTGAAGCAG，下游CGTCAAAGGTGGAGGAGTGG，擴增片段119 bp，VDR引物：上游CAGAGTGTGGGAAGGGAGAG，下游TTGGGTGGTGGAGTGAGAAT，擴增片段111 bp，均已行BLAST特異性驗證，引物由上海英濰捷基生物公司合成。

1.2.3.2RNA提取參照RNAiso Plus說明書進行RNA提取，采用雙光束微量核酸蛋白測定儀于A260/ A280比值判定RNA純度，并取4 μl RNA進行瓊脂糖凝膠電泳，驗證RNA的完整性。

1.2.3.3cDNA合成參照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser說明書配制相關試劑，42℃2 min去除基因組DNA，37℃ 15 min、85℃ 5 s反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，向體系中加入180 μl無菌水稀釋10倍，-20℃保存。

1.2.3.4qRT-PCR反應和結(jié)果分析參照SYBR?Premix Ex TaqTMII說明書，選擇20 μl反應體系，設置5個復孔，重復實驗3次，兩步法擴增，預變性1個循環(huán)95℃ 30 s，PCR反應40個循環(huán)95℃ 15 s、60℃ 34 s，融解曲線1個循環(huán)95℃ 15 s、60℃ 1 min、95℃ 15 s。采用2-△△CT法對qRT-PCR結(jié)果進行數(shù)據(jù)分析。

1.2.4Western blot檢測冰PBS洗不同組別的HaCaT細胞1次，加入預冷的含PMSF的全細胞裂解液于冰上裂解20 min，4℃離心（12 000 r/ min）5 min后保留上清，BCA法測定蛋白濃度后加入上清1/4量的蛋白上樣緩沖液，沸水煮8 min，以5%上層膠、10%下層膠的SDS-聚丙烯胺凝膠電泳（恒壓100 V，70 min），電泳結(jié)束后將蛋白印跡到PVDF膜上（100 mA，60 min），6%的脫脂牛奶封閉2 h，TBST洗膜4次×5 min，將PVDF膜和一抗（VDR和GAPDH一抗工作濃度1∶1000）加入抗體孵育盒中4℃孵育過夜，TBST洗膜4次×5 min，二抗（辣根過氧化酶標記的山羊抗兔、辣根過氧化酶標記的山羊抗小鼠二抗工作濃度1∶1000）37℃孵育1 h，TBST洗膜4次×5 min，ECL化學發(fā)光法顯色，重復實驗3次。

1.2.5統(tǒng)計學方法采用統(tǒng)計軟件SPSS17進行分析,單組采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較用LSD法，兩組效應采用析因設計方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1鹵米松對卡泊三醇抑制HaCaT角質(zhì)形成細胞增殖的影響

CCK8法檢測HaCaT角質(zhì)形成細胞的增殖，增殖率=實驗組A值/對照組A值×100%。與對照組比較，不同濃度卡泊三醇作用于HaCaT細胞24 h、48 h后，顯著抑制角質(zhì)形成細胞的增殖（P＜0.05），呈濃度依賴性趨勢（圖1a）。在10-5mol/L鹵米松作用下，不同濃度卡泊三醇作用于HaCaT細胞24 h、48 h后，卡泊三醇對角質(zhì)形成細胞增殖的濃度依賴性抑制效應仍有增強（圖1b）。統(tǒng)計學分析后發(fā)現(xiàn)鹵米松與卡泊三醇兩藥聯(lián)用對角質(zhì)形成細胞的抗增殖作用較單用卡泊三醇的抗增殖作用更強（P＜0.05），說明兩藥之間有交互效應。

圖1　CCK8法檢測各組角質(zhì)形成細胞的增殖情況

2.2鹵米松對HaCaT角質(zhì)形成細胞VDR mRNA表達的影響

不同濃度鹵米松作用于HaCaT細胞24 h、48 h后，經(jīng)qRT-PCR檢測VDR的表達，采用2-△△CT法計算各組表達量，結(jié)果表明：①與對照組比較，不同濃度鹵米松作用HaCaT細胞24 h后，VDR mRNA表達上調(diào)（P＜0.05），并呈劑量依賴性；②與對照組比較，鹵米松作用HaCaT細胞48 h后，VDR mRNA仍上調(diào)（P＜0.05），無明顯劑量依賴性（圖2）。

圖2　qRT-PCR檢測各組VDR mRNA表達情況

2.3鹵米松對HaCaT細胞中VDR蛋白表達的影響

不同濃度鹵米松作用于HaCaT細胞24 h、48 h后，經(jīng)Western blot檢測，VDR蛋白的相對量結(jié)果表明：與對照組比較，不同濃度鹵米松作用于HaCaT細胞24 h、48 h后，VDR蛋白表達均上調(diào)（P＜0.05），并呈劑量依賴性（圖3）。

圖3　Western blot檢測各組VDR蛋白表達情況

3　討論

尋常性銀屑病是皮膚科臨床常見的慢性復發(fā)性炎癥性疾病。糖皮質(zhì)激素和維生素D3衍生物是銀屑病外用治療中的一線藥物。鹵米松是一種強效的外用糖皮質(zhì)激素，具有抗炎、免疫抑制、抗細胞增殖等作用。GC主要是通過與細胞質(zhì)中GRα結(jié)合而發(fā)揮生物學作用，GC與GRα的復合體移位至細胞核內(nèi)與糖皮質(zhì)激素受體操縱元件(GRE)結(jié)合后，進而調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄和表達[7]。維生素D3衍生物主要與細胞核內(nèi)的VDR結(jié)合后，與類視黃醇x受體（RXR）形成異二聚體VDR-RXR，再與靶基因上的維生素D受體操縱元件（VDRE）結(jié)合，從而調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄和表達，發(fā)揮抗細胞增殖、誘導細胞分化、免疫調(diào)節(jié)等功能，此外還可與細胞膜上的VDR結(jié)合而發(fā)揮調(diào)節(jié)鈣、磷代謝的作用[8]。

鹵米松與維生素D3衍生物分別通過與核激素受體GRα、VDR結(jié)合而發(fā)揮效應。Yu等[9]研究發(fā)現(xiàn)，采用地塞米松作用于小鼠鱗狀細胞癌細胞（SCCVII/ SF）后，可上調(diào)小鼠癌細胞中VDR的表達，提示地塞米松可通過上調(diào)細胞中VDR的表達來增強1,25-二羥維生素D3的抗腫瘤細胞效應。Hidalgo等[3]發(fā)現(xiàn)，地塞米松可在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)SCCVII/SF細胞中VDR的表達，呈時間及劑量依賴性，且該作用與GR的表達密切相關，因此認為GR、VDR可能存在交叉對話情況，且推測GC能增強維生素D3衍生物的抗腫瘤效應。此外，Swami等[10]發(fā)現(xiàn)，維生素D3可下調(diào)人乳腺癌細胞（MCF-7）中的雌激素受體的表達。上述研究結(jié)果提示了不同核激素受體之間的相互影響，也對本課題組觀察鹵米松對角質(zhì)形成細胞VDR表達的影響的相關研究的展開具有啟示作用。

筆者的研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)10-5mol/L鹵米松作用后，卡泊三醇對HaCaT角質(zhì)形成細胞的抗增殖作用明顯增強。經(jīng)統(tǒng)計學分析后發(fā)現(xiàn)，鹵米松與卡泊三醇具有交互效應。由此引發(fā)我們對這一現(xiàn)象發(fā)生的內(nèi)在原因的興趣，促使我們進一步探討鹵米松對角質(zhì)形成細胞VDR表達的影響。本研究發(fā)現(xiàn)鹵米松在不同時相點作用后，HaCaT細胞VDR無論是在mRNA或者是蛋白水平均有上調(diào)的現(xiàn)象，并呈濃度依賴性效應。這提示GRα、VDR兩類核激素受體之間可能存在交叉對話途徑，這與Hidalgo等、Yu等的發(fā)現(xiàn)具有相似性。鹵米松對角質(zhì)形成細胞VDR表達的上調(diào)效應，不但可部分解釋鹵米松增強卡泊三醇抑制HaCaT細胞增殖效應的現(xiàn)象，還可能部分解釋臨床實踐中所觀察到的糖皮質(zhì)激素與維生素D3衍生物外用治療銀屑病的療效優(yōu)于藥物單用的現(xiàn)象，這為臨床上外用鹵米松與維生素D3衍生物聯(lián)合治療銀屑病提供了一定的實驗研究依據(jù)。目前就GRα、VDR核激素受體之間如何進行交叉對話的確切機制尚不清楚，仍有待進一步研究。

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（本文編輯敖俊紅）

Effects of halometasone on expression of vitamin D receptor in human HaCaT keratinocytes

LIU Lian，ZHANG Bin，HE Wei，et al
Department of Dermatology, Xinqiao Hospital, the Third Military Medical University, Chongqing 400037, China

ObjectiveTo investigate the effects of halometasone on the expression of vitamin D receptor(VDR) in human keratinocytes so as to evaluate the potential effects of halometasone on the therapeutic efficacy of topical vitamin D3 analog in psoriasis. Methods HaCaT cells were treated by halometasone and calcipotriol with different concentrations for various durations. The cell proliferation was observed by CCK8 assay. Quantitative real-time PCR and Western blotting were used to detect the expression level of VDR mRNA and protein. Results Halometasone significantly enhanced the inhibitory effects of calcipotriol on keratinocyte proliferation. Halometasone upregulated the expression of VDR at the level of mRNA and protein in a concentration-dependent manner. ConclusionThe upregulation of VDR expression by halometasone in keratinocytes may partly explain the phenomenon that halometasone could enhance the therapeutic efficacy of topical vitamin D3 analog in the treatment of psoriasis.

Halometasone；Calcipotriol；Vitamin D receptor；Proliferation；Keratinocyte [JPractDermatol, 2016, 9(2):81-83]

R986；R758.63

A

1674-1293(2016)02-0081-03

10.11786/sypfbxzz.1674-1293.20160201

中華醫(yī)學會皮膚性病學分會澳美制藥銀屑病研究基金

重慶400037，第三軍醫(yī)大學第二附屬醫(yī)院皮膚科及風濕免疫科（劉蓮，張斌，何威，王儒鵬，周春麗，王為，王玉娟，黃珂）

劉蓮，在讀碩士研究生，住院醫(yī)師，研究方向：鹵米松與卡泊三醇對角質(zhì)形成細胞作用的影響及機制研究，E-mail: liulian422@163.com

何威，E-mail: weiheskin@163.com

（2016-01-20

2016-03-03）