宋曉婕，陳峪，曾友玲，周燕，向赟，張妍

(武漢市婦女兒童醫(yī)療保健中心，武漢 430000)

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E6/E7 HPV mRNA檢測(cè)在Ⅱ級(jí)及以上宮頸上皮內(nèi)瘤變?cè)\斷中的應(yīng)用

宋曉婕，陳峪，曾友玲，周燕，向赟，張妍

(武漢市婦女兒童醫(yī)療保健中心，武漢 430000)

目的 觀察E6/E7 HPV mRNA檢測(cè)在Ⅱ級(jí)及以上宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)診斷中的應(yīng)用效果。方法 因慢性宮頸炎、不明原因陰道出血、宮頸贅生物、長(zhǎng)期分泌物異常等可疑宮頸病變就診的865例患者,行宮頸脫落細(xì)胞HPV DNA、E6/E7 HPV mRNA檢測(cè),以陰道鏡下宮頸活檢作為金標(biāo)準(zhǔn)，比較兩種檢測(cè)方法診斷Ⅱ級(jí)及以上CIN的敏感度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值。結(jié)果 E6/E7 HPV mRNA檢測(cè)診斷Ⅱ級(jí)及以上CIN的敏感度為87.79%，特異度為59.11%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為58.64%，陰性預(yù)測(cè)值為88.00%；HPV DNA檢測(cè)診斷Ⅱ級(jí)及以上CIN的敏感度為92.17%，特異度為22.01%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為44.04%，陰性預(yù)測(cè)值為81.43%；兩者特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值比較，P均<0.05。結(jié)論 E6/E7 HPV mRNA檢測(cè)診斷Ⅱ級(jí)及以上CIN特異度高。

人乳頭瘤病毒;人乳頭瘤病毒DNA;E6/E7人乳頭瘤病毒mRNA；宮頸上皮內(nèi)瘤變

人乳頭瘤病毒(HPV)是女性生殖系統(tǒng)比較常見的性傳播病毒[1]。已經(jīng)證實(shí)，高危HPV的感染和宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)、宮頸癌的進(jìn)展密切相關(guān)[2]。HPV感染雖常見，但大部分為一過性，約90%的幾率會(huì)在2年之內(nèi)清除[3，4]，并且僅長(zhǎng)時(shí)間的持續(xù)感染才與CIN的形成和進(jìn)展相關(guān)[4]。HPV感染在女性一生中的風(fēng)險(xiǎn)約為80%，僅3%～5%的人存在長(zhǎng)期持續(xù)感染，并進(jìn)展成宮頸癌[3,5]。篩查人群數(shù)據(jù)顯示，HPV DNA感染率在年輕女性中較高，為25%～65%，35歲以上穩(wěn)步下降為10%～30%[5～7]。歐洲生殖道感染和腫瘤研究組織(EUROGIN)自2007年開始推薦30歲以上女性將HPV DNA作為宮頸癌篩查首選手段[8]，我國(guó)的“兩癌篩查”項(xiàng)目自2015年也逐漸開始進(jìn)行HPV DNA試點(diǎn)篩查工作。盡管HPV感染大部分為一過性，但目前無法判斷感染是否致癌，因此給患者帶來了心理負(fù)擔(dān)；此外，現(xiàn)有指南基于衛(wèi)生經(jīng)濟(jì)學(xué)、HPV DNA特異性等原因，僅推薦30歲以上人群進(jìn)行篩查，但有報(bào)道[9]顯示，小于30歲的女性仍存在35%的Ⅱ級(jí)及以上CIN漏診情況，因此尋找HPV更加特異性的致癌指標(biāo)一直是近年來的研究熱點(diǎn)。HPV E6/E7病毒基因的過量表達(dá)被認(rèn)為與細(xì)胞轉(zhuǎn)化有關(guān)，E6、E7可與宿主基因整合，影響細(xì)胞調(diào)控因子如p53和prb的功能,導(dǎo)致細(xì)胞分化異常，細(xì)胞形態(tài)產(chǎn)生持續(xù)改變最終進(jìn)展成CIN[10～12]。因此，檢測(cè)HPV致癌基因可能有助于更準(zhǔn)確地篩查宮頸高度病變和宮頸癌高風(fēng)險(xiǎn)人群[13，14]。本研究以宮頸病理檢查結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，觀察了E6/E7 HPV mRNA檢測(cè)在Ⅱ級(jí)及以上CIN診斷中的應(yīng)用效果，并與HPV DNA檢測(cè)進(jìn)行比較。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2014年6月～2015年6月在武漢市婦女兒童醫(yī)療保健中心婦科門診因慢性宮頸炎、不明原因陰道出血、宮頸贅生物、長(zhǎng)期分泌物異常等可疑宮頸病變就診的865例女性患者,受試者年齡20～65歲、平均42.5歲，≥30歲420例、<30歲445例，近5年未行宮頸治療(物理或手術(shù)治療)、宮頸活檢、放化療。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本的采集和處理 以擴(kuò)陰器暴露宮頸口，用棉拭子將宮頸過多的分泌物擦去，將宮頸刷伸入宮頸口處，在宮頸鱗柱交界處順時(shí)針旋轉(zhuǎn)3～5圈,刷取宮頸脫落細(xì)胞后，將其放入裝有細(xì)胞保存液的樣本管中，避光放置，待用于E6/E7 HPV mRNA和HPV DNA檢測(cè)。

1.2.2 E6/E7 HPV mRNA檢測(cè) 取1 mL細(xì)胞保存液，3 000 r/min離心，去上清液，用2 mL蒸餾水清洗后再次離心去上清，加入裂解劑(Diacarta公司提供，由lysis mixture和proteinase K按1∶800混合)，65 ℃溫浴30 min，裂解過程中可震蕩2、3次，取上清，加入終止液終止反應(yīng)。將標(biāo)本溶液加入孔板，經(jīng)過雜交捕獲mRNA、信號(hào)放大、底物發(fā)光法反應(yīng)后，用QuantiVirusTM冷光儀進(jìn)行檢測(cè)，數(shù)據(jù)經(jīng)配套軟件分析后直接讀取結(jié)果(試劑盒和檢測(cè)儀器均由河南中美合資科蒂亞生物技術(shù)有限公司提供)。

1.2.3 HPV DNA檢測(cè) 取剩余的細(xì)胞保存液，加入離心管，14 000 r/min離心，去上清，裂解標(biāo)本(裂解液由廣東凱普提供)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增(ABI VeritiPCR擴(kuò)增儀)后，使用HybriMax快速核酸分子雜交儀(廣東凱普)雜交顯色和信息讀取，可區(qū)分35種不同型別HPV(包括20種高危HPV及15種低危HPV)。將不同型別高危HPV統(tǒng)一做為陽(yáng)性結(jié)果。

1.2.4 宮頸組織病理檢查 所有受試者均行陰道鏡下宮頸活檢。取宮頸可疑病變組織或常規(guī)3、6、9、12點(diǎn)組織于甲醛液中固定，專業(yè)病理醫(yī)師進(jìn)行病檢結(jié)果分析，對(duì)于宮頸活檢結(jié)果高度病變(Ⅱ級(jí)及以上CIN)者行宮頸錐切以確定最終病理診斷結(jié)果。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。以陰道鏡下宮頸活檢作為金標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算并比較兩種檢測(cè)方法診斷Ⅱ級(jí)及以上CIN的敏感度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值，比較方法采用χ2檢驗(yàn)和確切概率法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

865例女性病理診斷陰性390例、CIN Ⅰ級(jí)131例、CIN Ⅱ級(jí)157例、CIN Ⅲ級(jí)119例、宮頸浸潤(rùn)癌(ICC)68例。隨著宮頸病變級(jí)別的增加，HPV DNA、E6/E7 HPV mRNA檢測(cè)陽(yáng)性率隨之上升(P均<0.05，表1)。HPV DNA檢測(cè)143例陰性中E6/E7 HPV mRNA檢測(cè)陰性121例、陽(yáng)性22例，HPV DNA檢測(cè)722例陽(yáng)性中E6/E7 HPV mRNA檢測(cè)陰性229例、陽(yáng)性493例，兩種檢測(cè)方法的一致性為70.98%(614/865)。E6/E7 HPV mRNA檢測(cè)診斷Ⅱ級(jí)及以上CIN的敏感度為87.79%，特異度為59.11%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為58.64%，陰性預(yù)測(cè)值為88.00%；HPV DNA檢測(cè)診斷Ⅱ級(jí)及以上CIN的敏感度為92.17%，特異度為22.01%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為44.04%，陰性預(yù)測(cè)值為81.43%；兩者特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值比較，P均<0.05。在<30歲患者中，E6/E7 HPV mRNA檢測(cè)診斷Ⅱ級(jí)及以上CIN的敏感度為94.10%，特異度為62.80%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為57.20%，陰性預(yù)測(cè)值為95.30%，漏診率為5.90%；HPV DNA檢測(cè)診斷Ⅱ級(jí)及以上CIN的敏感度為91.50%，特異度為20.20%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為35.00%，陰性預(yù)測(cè)值為81.90%，漏診率為8.50%；兩者敏感度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值比較，P均<0.05。在≥30歲患者中，E6/E7 HPV mRNA檢測(cè)診斷Ⅱ級(jí)及以上CIN的敏感度為82.60%，特異度為54.30%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為59.90%，陰性預(yù)測(cè)值為79.10%，漏診率為17.40%；HPV DNA檢測(cè)診斷Ⅱ級(jí)及以上CIN的敏感度為93.20%，特異度為25.20%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為50.70%，陰性預(yù)測(cè)值為81.70%，漏診率為6.80%；兩者敏感度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值比較，P均<0.05。

表1 E6/E7 HPV mRNA、HPV DNA、病理診斷檢查結(jié)果(例)

3 討論

目前，宮頸癌作為女性生殖器官的惡性腫瘤已嚴(yán)重威脅全球女性的生殖健康，在我國(guó)其發(fā)病率僅次于乳腺癌。在全球范圍內(nèi)，宮頸癌治療已取得了很好的效果，但仍缺少能早期發(fā)現(xiàn)宮頸癌的檢測(cè)指標(biāo)。在我國(guó)大部分地區(qū)，宮頸癌篩查的第一步主要是宮頸刷片細(xì)胞學(xué)檢查或HPV DNA檢測(cè)，異常時(shí)通常根據(jù)指南進(jìn)行重復(fù)細(xì)胞學(xué)檢查(HPV DNA檢測(cè)或陰道鏡活檢等)，但細(xì)胞學(xué)敏感度較低，HPV DNA特異度較低。HPV感染人群的比例在不同地區(qū)和人群中各不相同,大多認(rèn)為在有性生活的女性中感染率在30%左右[15],在小于30歲的性活躍期女性中的比例更高。盡管大部分HPV感染在2年內(nèi)會(huì)自行清除，但DNA檢測(cè)無法預(yù)測(cè)短暫的一過性感染，隨后的分流處理如進(jìn)行陰道鏡和侵入式活檢等，會(huì)帶來過度診斷和過度醫(yī)療的風(fēng)險(xiǎn)，也增加了患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和心理負(fù)擔(dān)。有研究[16]表明，RNA的陽(yáng)性率在所有級(jí)別宮頸病變中較DNA低，尤其是在活檢陰性的女性，HPV DNA陽(yáng)性的患者mRNA陰性，反映并不是所有HPV感染都會(huì)表達(dá)E6和E7，而這些感染預(yù)計(jì)是一過性感染。

本研究的865例女性在就診時(shí)均伴有不同程度的臨床表現(xiàn)，這并不是一個(gè)常規(guī)篩查人群。檢測(cè)的病檢結(jié)果中，有許多陽(yáng)性案例，包括宮頸低級(jí)別病變、高級(jí)別病變甚至浸潤(rùn)癌，HPV DNA和mRNA兩種分子學(xué)檢測(cè)被用來評(píng)估其在Ⅱ級(jí)及以上CIN的臨床價(jià)值。兩種檢測(cè)手段結(jié)果陽(yáng)性率均隨著宮頸病變程度增高而升高，但HPV mRNA檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性率更低，特別在陰性人群和CIN Ⅰ級(jí)的樣本中，這與之前的研究[13]結(jié)論是一致的。這也是由分子學(xué)的特性決定的，HPV DNA檢測(cè)能辨別是否存在感染，這種感染可能是一過性或沒有臨床意義的，但E6/E7 HPV mRNA檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性反映患者可能存在HPV持續(xù)感染并導(dǎo)致病變進(jìn)展[17]。已有研究[18]顯示，與HPV DNA相比，mRNA有更顯著的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和特異度。另外，一項(xiàng)隨訪研究也顯示，HPV E6/E7 mRNA較HPV DNA在細(xì)胞學(xué)不能明確意義的非典型鱗狀上皮細(xì)胞和低度鱗狀上皮內(nèi)病變結(jié)果的女性特異度高[19]。同時(shí)，在一項(xiàng)愛爾蘭的研究[20]中證實(shí)，mRNA的敏感度好。盡管HPV感染在30歲以前是高峰，并隨后穩(wěn)步下降，甚至小于25歲的女性1年之內(nèi)可能會(huì)清除病毒[3,21],HPV DNA目前也僅做為30歲以上女性的推薦,但小于30歲的女性，仍存在35%的Ⅱ級(jí)及以上CIN漏診情況[9]。本研究結(jié)果從總體人群來看，E6/E7 HPV mRNA與HPV DNA有相似的敏感度，但特異度顯著高于HPV DNA，這與之前的結(jié)論類似，但既往研究較少將年齡作為一個(gè)因素進(jìn)行分析。本研究結(jié)果顯示,在小于30歲人群中,HPV mRNA檢測(cè)的特異度更為顯著，高于DNA 2.5倍之多，Ⅱ級(jí)及以上CIN漏診率也小于HPV DNA檢測(cè)。

可見，E6/E7 HPV mRNA檢測(cè)診斷Ⅱ級(jí)及以上CIN的特異度高。

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