石宇雄，郭智維，繆莉，譚志琴

(中國人民解放軍第169醫(yī)院，湖南衡陽 421002)

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轉(zhuǎn)染miR-185類似物的人胃腺癌MGC-803細胞增殖能力及M2型丙酮酸激酶表達變化

石宇雄，郭智維，繆莉，譚志琴

(中國人民解放軍第169醫(yī)院，湖南衡陽 421002)

目的 觀察轉(zhuǎn)染miR-185類似物的人胃腺癌MGC-803細胞增殖能力及M2型丙酮酸激酶(PKM2)表達變化。方法 培養(yǎng)人胃腺癌MGC-803細胞，將其分為觀察組1、對照組1、觀察組2、對照組2，觀察組1轉(zhuǎn)染miR-185類似物，對照組1轉(zhuǎn)染無關(guān)序列，觀察組2轉(zhuǎn)染PKM2小RNA干擾，對照組2轉(zhuǎn)染RNA干擾無關(guān)序列，48 h后收集觀察組1和對照組1細胞，用Western blotting法檢測PKM2蛋白，用實時熒光定量PCR法檢測PKM2 mRNA;將四組細胞繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72、96 h，采用MTT法測量各組在570 nm波長處的OD值。結(jié)果 細胞培養(yǎng)48、72、96 h時，OD值觀察組1較對照組1低(P均<0.05)，觀察組2較對照組2低(P均<0.05)。觀察組1、對照組1人胃腺癌MGC-803細胞PKM2蛋白相對表達量分別為0.522±0.065、0.937±0.111，PKM2 mRNA相對表達量分別為0.584±0.037、1.046±0.058，兩組比較，P<0.05或<0.01。結(jié)論 轉(zhuǎn)染miR-185類似物的人胃腺癌MGC-803細胞增殖能力下降、PKM2表達降低，miR-185的這一作用是通過下調(diào)PKM2實現(xiàn)的。

微小RNA-185類似物；基因轉(zhuǎn)染；胃癌；人胃腺癌MGC-803細胞；M2型丙酮酸激酶；細胞增殖

miRNA是一類在真核生物中廣泛表達且具有調(diào)控功能的非編碼RNA，由18～25個核苷酸組成。miRNA通過促進其靶mRNA降解或抑制其翻譯，在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因的表達，從而參與調(diào)控生物體的一系列生理病理過程[1]。miRNA參與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展過程，這可能與其參與調(diào)控細胞線粒體功能(如能量代謝、細胞凋亡、分裂/融合等)有關(guān)。研究[2～5]顯示，miR-185在膠質(zhì)瘤、卵巢癌、肺癌、肝細胞癌、結(jié)腸癌以及橫紋肌肉瘤等腫瘤組織或細胞中表達下調(diào)，且能抑制多種腫瘤細胞的生長與侵襲。miR-185在胃癌組織和細胞中表達下調(diào)，且miR-185在胃癌組織中表達與患者臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及預(yù)后相關(guān)，體外實驗證實外源高表達miR-185可抑制胃癌細胞的增殖、侵襲并誘導(dǎo)胃癌細胞凋亡，體內(nèi)實驗亦證實miR-185能抑制癌細胞肺轉(zhuǎn)移[6]。然而miR-185在胃癌中的具體抑癌機制尚未闡明。M2型丙酮酸激酶(PKM2)在多種腫瘤(肺癌、前列腺癌、膠質(zhì)瘤)中能促進有氧糖酵解與腫瘤的發(fā)生[7～9]。前期研究顯示miR-185的非編碼區(qū)有與PKM2結(jié)合的共同位點。轉(zhuǎn)染miR-185類似物可以使胃癌細胞出現(xiàn)外源性miR-185高表達。本研究觀察了轉(zhuǎn)染miR-185類似物的人胃腺癌MGC-803細胞增殖能力、PKM2表達變化，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 人胃腺癌MGC-803細胞購自上海細胞生物研究所，細胞均用含10%胎牛血清、1%青霉素鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)，置于37 ℃、5% CO2的恒溫箱中培養(yǎng)。Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司，miR-185類似物、無關(guān)序列、RNA干擾無關(guān)序列購自美國Ambion公司，PKM2小RNA干擾(PKM2-siRNA)質(zhì)粒購自GeneCopoeia公司，PKM2抗體和β-actin抗體購自美國Santa Cruz公司，PRIM1640培養(yǎng)基和小牛血清購自Gibco公司，MTT粉購自美國Sigma公司。

1.2 MGC-803細胞分組及miR-185類似物轉(zhuǎn)染 培養(yǎng)人胃腺癌MGC-803細胞，消化細胞并接種于6孔板中，按2 mL/孔鋪好，培養(yǎng)至細胞匯合度達30%～50%用于轉(zhuǎn)染。用滅菌的無酶水稀釋各種轉(zhuǎn)染質(zhì)粒干粉，按說明配制成20 μmol/L的溶液備用。用不含血清的Opti-MEM培養(yǎng)液分別稀釋100 pmol轉(zhuǎn)染質(zhì)粒與Lipofectamin2000(5 μL)，混勻，室溫孵育5 min。將MGC-803細胞分為觀察組1、對照組1、觀察組2、對照組2，觀察組1轉(zhuǎn)染miR-185類似物，對照組1轉(zhuǎn)染無關(guān)序列，觀察組2轉(zhuǎn)染PKM2-siRNA，對照組2轉(zhuǎn)染RNA干擾無關(guān)序列，培養(yǎng)48 h，收獲細胞。

1.3 各組MGC-803細胞增殖能力觀察 采用MTT法。使用胰酶消化上述四組細胞，每組分別取1 000個MGC-803細胞接種于96孔板中，每組設(shè)5個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72、96 h后，每孔加滅菌MTT液(5 mg/mL)20 μL，孵育4 h后取出，每孔中加入DMSO 150 μL，低速振蕩10 min，選擇波長為570 nm，在酶標(biāo)儀上測定各孔OD值。實驗重復(fù)3次。OD值代表細胞增殖能力。

1.4 觀察組1、對照組1 MGC-803細胞PKM2檢測 ①PKM2蛋白：采用Western blotting法。提取觀察組1、對照組1細胞總蛋白。BCA蛋白定量試劑盒測定細胞蛋白濃度，100 ℃水浴10 min，取等量的總蛋白行SDS-PAGE凝膠電泳，并轉(zhuǎn)至PVDF膜上。TBST洗膜，用含有5%脫脂奶粉的TBST封閉2 h后分別加入鼠抗人PKM2單克隆一抗4 ℃封閉過夜。去除一抗，TBST洗膜3次，加入二抗，37 ℃孵育45 min，TBST洗膜3次，暗室中用蛋白熒光檢測試劑盒顯示結(jié)果于X線片。以β-actin為對照。以目的蛋白條帶灰度值與β-actin條帶灰度值的比值作為PKM2蛋白的相對表達量。②PKM2 mRNA：采用實時熒光定量PCR法。用RNA抽提試劑盒抽提觀察組1、對照組1細胞中總RNA。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA于-80 ℃冰箱保存。PCR擴增反應(yīng)體系為20 μL，其中包括PCR 引物(5 mmol/L)0.4 μL、逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 2.0 μL、Taq DNA聚合酶(5 U/μL)0.2 μL、2×SYBR Mix 10 μL、滅菌蒸餾水7.4 μL，混勻。反應(yīng)條件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min后95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，40個循環(huán)。溶解曲線條件：95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。以U6為內(nèi)參，以2-ΔΔCt表示PKM2的相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 各組細胞OD值比較 結(jié)果見表1。

表1 培養(yǎng)不同時間點各組細胞OD值比較±s)

注：觀察組1與對照組1相比，觀察組2與對照組2相比，*P<0.05，#P<0.01。

2.2 觀察組1、對照組1細胞PKM2蛋白、mRNA相對表達量比較 觀察組1、對照組1人胃腺癌MGC-803細胞PKM2蛋白相對表達量分別為0.522±0.065、0.937±0.111，PKM2 mRNA相對表達量分別為0.584±0.037、1.046±0.058，兩組比較，P<0.05或<0.01。

3 討論

胃癌的發(fā)生發(fā)展涉及多因素的參與，包括相關(guān)癌基因的激活與抑癌基因的失活。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA異常表達在多種腫瘤細胞的增殖、侵襲、凋亡、周期阻滯中起著至關(guān)重要的作用。miRNA不僅可以參與正常的生命進程，其表達失調(diào)與多種疾病病理過程相關(guān)。miRNA幾乎參與了所有惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展，主導(dǎo)或是協(xié)同參與調(diào)控腫瘤細胞異常增殖、細胞凋亡、血管生成、局部侵襲和遠處轉(zhuǎn)移等一系列重要的生物學(xué)過程。細胞異常增殖和侵襲轉(zhuǎn)移對于原發(fā)腫瘤的形成、維持和進展尤為重要。目前，已經(jīng)有大量的研究揭示了參與調(diào)控腫瘤細胞增殖和轉(zhuǎn)移的重要miRNA。例如miR-21通過靶向下調(diào)PTEN、RECK或TIMP3等腫瘤抑制蛋白，促進乳腺癌、肺癌和食管癌等多種腫瘤細胞在體內(nèi)體外的增殖、侵襲遷移、腫瘤生長和遠處轉(zhuǎn)移，被認(rèn)為是重要的癌性miRNA[10]。Let-7則靶向多個促癌基因，如Ras、HMGA2，抑制多種腫瘤的細胞增殖、侵襲、遷移[11]。

研究顯示，miR-185在包括胃癌等多種癌組織或細胞中表達下調(diào)，其通過靶向相關(guān)基因發(fā)揮癌基因或抑癌基因樣作用。各種研究顯示，DNMT1、CDC42、RhoA、SIX1、CDK6、雄激素受體、c-Met等均是miR-185下游調(diào)控的靶基因。研究[3]表明，miR-185在膠質(zhì)瘤中表達下調(diào)，通過直接靶向DNMT1、RhoA、CDC42抑制膠質(zhì)瘤細胞的增殖與侵襲。Ximena等[12]研究顯示，miR-185在肝癌中表達下調(diào)，通過靶向DNMT1/PTEN/Akt通路抑制肝癌細胞的生長。miR-185在結(jié)腸癌中通過靶向抑制RhoA與CDC42表達抑制結(jié)腸癌細胞的增殖[13]。miR-185在前列腺癌通過靶向雄激素受體抑制腫瘤細胞的增殖、遷移與侵襲[14]。miR-185在乳腺癌細胞中表達下調(diào)，通過靶向抑制c-Met表達，抑制乳腺癌細胞的增殖[15]。上述研究表明，miR-185在不同類型腫瘤中的功能差異可能與其不同的功能靶基因有關(guān)。

丙酮酸激酶(PK)是糖酵解過程中的關(guān)鍵限速酶，其功能是催化其底物磷酸烯醇式丙酮酸產(chǎn)生丙酮酸。在人體主要存在四種PK，即PKL、PKR、PKM1和PKM2。PKM2首先在胚胎組織中被發(fā)現(xiàn)，而近年的研究發(fā)現(xiàn)PKM2在快速增殖的細胞(特別是腫瘤組織)中高表達，對Warburg效應(yīng)及腫瘤發(fā)生發(fā)展發(fā)揮重要的調(diào)控作用[16,17]。PKM2可進入細胞核，協(xié)同HIF-1α反式激活下游基因的表達，上調(diào)LDH、GLUT-1、HK1、PDK1、VEGFA等，對腫瘤能量代謝起重要的調(diào)控作用[18]。同時PKM2入核后還可協(xié)同激活β-Catenin、STAT3、Oct-4下游基因的表達，促進腫瘤細胞的生長增殖[19,20]。用siRNA特異性敲除PKM2，可顯著抑制腫瘤能量代謝，并抑制腫瘤的生長、增殖及遷移[21]。在肺腺癌A549細胞中敲除PKM2能誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡與自噬[22]。本研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染PKM2-siRNA的胃癌MGC-803細胞增殖能力低于轉(zhuǎn)染RNA干擾無關(guān)序列者，進一步說明PKM2可以調(diào)控胃癌細胞的增殖。

前期研究[6]發(fā)現(xiàn)，miR-185在胃癌組織中表達下調(diào)；轉(zhuǎn)染miR-185類似物可以使胃癌組織miR-185表達升高，即外源性miR-185高表達能抑制胃癌細胞的生長與侵襲并誘導(dǎo)細胞凋亡。前期通過在線預(yù)測軟件發(fā)現(xiàn)miR-185的3′-UTR與PKM2存在共同結(jié)合位點。外源高表達miR-185能抑制PKM2的蛋白與mRNA表達，提示PKM2是miR-185調(diào)控的靶基因。本研究結(jié)果顯示，通過轉(zhuǎn)染miR-185類似物使胃癌MGC-803細胞過表達miR-185后，胃癌MGC-803細胞增殖被抑制。結(jié)合在線預(yù)測軟件發(fā)現(xiàn)，筆者推測miR-185的這一作用是通過下調(diào)PKM2實現(xiàn)的。。

[1] Tang H, Kong Y, Guo J, et al. Diallyl disulfide suppresses proliferation and induces apoptosis in human gastric cancer through Wnt-1 signaling pathway by up-regulation of miR-200b and miR-22[J]. Cancer Lett, 2013,340(1):72-81.

[2] Tang H, Wang Z, Liu X, et al. LRRC4 inhibits glioma cells growth and invasion by miR-185 mediating pathway[J]. Current Cancer Drug Targets, 2012,12(8):1032-1042.

[3] Zhang Z, Tang H, Wang Z, et al. miR-185 targets the DNA methyltransferases 1 and regulates global DNA methylation in human glioma[J]. Mol Cancer, 2011,10:124.

[4] 唐海林,鄧敏,廖前進,等.結(jié)腸癌組織中miR-185的表達及其臨床意義[J].中南醫(yī)學(xué)科學(xué)雜志,2011,39(5):17-18.

[5] Imam JS, Buddavarapu K, Lee-Chang JS, et al. MicroRNA-185 suppresses tumor growth and progression by targeting the Six1 oncogene in human cancers[J]. Oncogene, 2010,29(35):4971-4979.

[6] Tan Z, Jiang H, Wu Y, et al. miR-185 is an independent prognosis factor and suppresses tumor metastasis in gastric cancer[J]. Mol Cell Biochem, 2014,386(1-2):223-231.

[7] Christofk HR, Vander Heiden MG, Harris MH, et al. The M2 splice isoform of pyruvate kinase is important for cancer metabolism and tumour growth[J]. Nature, 2008,452(7184):230-233.

[8] Sun Q, Chen X, Ma J, et al. Mammalian target of rapamycin up-regulation of pyruvate kinase isoenzyme type M2 is critical for aerobic glycolysis and tumor growth[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2011,108(10):4129-4134.

[9] Yang W, Xia Y, Hawke D, et al. PKM2 phosphorylates histone H3 and promotes gene transcription and tumorigenesis[J]. Cell, 2012,150(4):685-696.

[10] Pfeffer SR, Yang CH, Pfeffer LM. The Role of miR-21 in Cancer[J]. Drug Dev Res, 2015,76(6):270-277.

[11] Lee YS, Dutta A. The tumor suppressor microRNA let-7 represses the HMGA2 oncogene[J]. Genes Dev, 2007,21(9):1025-1030.

[12] Qadir XV, Han C, Lu D, et al. miR-185 inhibits hepatocellular carcinoma growth by targeting the DNMT1/PTEN/Aktpathway[J]. Am J Pathol, 2014,184(8):2355-2364.

[13] Liu M, Lang N, Chen X, et al. miR-185 targets RhoA and Cdc42 expression and inhibits the proliferation potential of human colorectal cells[J]. Cancer Lett, 2011,301(2):151-160.

[14] Qu F, Cui X, Hong Y, et al. MicroRNA-185 suppresses proliferation, invasion, migration, and tumorigenicity of human prostate cancer cellsthrough targeting androgen receptor[J]. Mol Cell Biochem, 2013,377(1-2):121-130.

[15] Fu P, Du F, Yao M, et al. MicroRNA-185 inhibits proliferation by targeting c-Met in human breast cancer cells[J]. Exp Ther Med, 2014,8(6):1879-1883.

[16] Chaneton B, Gottlieb E. Rocking cell metabolism: revised functions of the key glycolytic regulator PKM2 in cancer[J]. Trends Biochem Sci, 2012,37(8):309-316.

[17] Lluo W, Semenza GL. Emerging roles of PKM2 in cell metabolism and cancer progression[J]. Trends Endocrinol Metab, 2012,23(11):560-566.

[18] Luo W, Hu H, Chang R, et al. Pyruvate kinase M2 is a PHD3-stimulated coactivator for hypoxia-inducible factor 1[J]. Cell, 2011,145(5):732-744.

[19] Gao X, Wang H, Yang JJ, et al. Pyruvate kinase M2 regulates gene transcription by acting as a protein kinase[J]. Molecular Cell, 2012,45(5):598-609.

[20] Lee J, Kim HK, Han YM, et al. Pyruvate kinase isozyme type M2 (PKM2) interacts and cooperates with Oct-4 in regulating transcription[J]. Int J Biochem Cell Bio, 2008,40(5):1043-1054.

[21] Goldberg MS, Sharp PA. Pyruvate kinase M2-specific siRNA induces apoptosis and tumor regression[J]. J Exp Med, 2012,209(2):217-224.

[22] Chu B, Wang J, Wang Y, et al. Knockdown of PKM2 induces apoptosis and autophagy in human A549 alveolar adenocarcinoma cells[J]. Mol Med Rep, 2015,12(3):4358-4363.

湖南省醫(yī)藥衛(wèi)生科研計劃課題(B2014-067)。

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.35.012

R735.2

A

1002-266X(2016)35-0039-03

2016-02-09)