范曉玲,王蕾,張亞鳳，胡蓉

(1彩虹醫(yī)院，陜西咸陽(yáng) 712000;2咸陽(yáng)市第一人民醫(yī)院；3寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心;4省部共建教育部生育力保持重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)

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用自然周期方案、激素替代周期方案準(zhǔn)備內(nèi)膜的助孕治療者短時(shí)和過夜培養(yǎng)凍胚的移植結(jié)局觀察

范曉玲1,王蕾2,張亞鳳1，胡蓉3,4

(1彩虹醫(yī)院，陜西咸陽(yáng) 712000;2咸陽(yáng)市第一人民醫(yī)院；3寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心;4省部共建教育部生育力保持重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)

目的 觀察用自然周期方案、激素替代周期方案準(zhǔn)備內(nèi)膜的助孕治療者短時(shí)和過夜培養(yǎng)凍融胚胎的移植結(jié)局。方法 293對(duì)夫婦采用冷凍-復(fù)蘇胚胎移植(FET)助孕治療，共337個(gè)移植周期，根據(jù)移植前內(nèi)膜準(zhǔn)備方法分為自然周期組(NC組，采用自然周期準(zhǔn)備方案)和激素替代周期組(HRT組，采用激素替代周期準(zhǔn)備方案)，每組再根據(jù)胚胎解凍后體外培養(yǎng)時(shí)間(短時(shí)培養(yǎng)和過夜培養(yǎng))分層，觀察FET結(jié)局(種植率、臨床妊娠率、流產(chǎn)率、多胎率)。結(jié)果 NC組、HRT組種植率分別為32.69%、21.83%，臨床妊娠率分別為59.15%、41.73%，流產(chǎn)率分別為7.14%、16.22%，多胎率分別為21.43%、13.51%，NC組種植率和臨床妊娠率高于HRT組(P均<0.05)。NC組短時(shí)培養(yǎng)、過夜培養(yǎng)種植率分別為28.13%、35.87%，臨床妊娠率分別為53.57%、62.79%，流產(chǎn)率分別為6.67%、7.41%，多胎率分別為20.00%、22.22%，兩者比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。HRT組短時(shí)培養(yǎng)、過夜培養(yǎng)種植率分別為21.92%、21.74%，臨床妊娠率分別為44.19%、39.42%，流產(chǎn)率分別為21.05%、11.11%，多胎率分別為12.28%、14.81%，兩者比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。NC組、HRT組短時(shí)培養(yǎng)FET結(jié)局比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與HRT組過夜培養(yǎng)者相比，NC組過夜培養(yǎng)者種植率和臨床妊娠率高(P均<0.05)。結(jié)論 自然周期較激素替代周期內(nèi)膜準(zhǔn)備方法可獲較好FET結(jié)局,主要體現(xiàn)在胚胎解凍后體外培養(yǎng)時(shí)間選擇為過夜培養(yǎng)時(shí)。

胚胎移植；內(nèi)膜準(zhǔn)備方法；自然周期；激素替代周期

冷凍-復(fù)蘇胚胎移植(FET)作為輔助生育技術(shù)(ART)的重要組成部分，可以有效預(yù)防卵巢過度刺激綜合征、多胎妊娠等體外受精-胚胎移植技術(shù)(IVF-ET)相關(guān)的并發(fā)癥，增加單次促排卵的累積妊娠率及胚胎的利用率[1]。然而，與新鮮胚胎移植周期相比結(jié)局仍不理想[2]。影響凍融胚胎移植結(jié)局的因素很多，人為可控的因素主要為內(nèi)膜準(zhǔn)備方法和解凍后移植時(shí)機(jī)。本研究觀察了用自然周期方案和激素替代周期方案準(zhǔn)備內(nèi)膜的助孕治療者短時(shí)和過夜培養(yǎng)凍胚的移植結(jié)局，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2009年1月～2011年12月在寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心行FET助孕治療的293對(duì)夫婦、337個(gè)移植周期資料。其中女方年齡19～35歲，不孕年限1～19年，BMI 18～25 kg/m2，子宮內(nèi)膜厚度7～15 mm，每周期移植胚胎數(shù)1～3枚，原發(fā)不孕213周期，體外受精(IVF)方式受精183周期，自然周期內(nèi)膜準(zhǔn)備方案71周期。納入標(biāo)準(zhǔn)：女方年齡≤35歲、18 kg/m2≤BMI≤25 kg/m2、采用長(zhǎng)方案促排卵、IVF/卵胞質(zhì)內(nèi)單精子顯微注射術(shù)(ICSI)周期數(shù)≤2、程序化慢速冷凍方法、胚胎均為受精后第3天冷凍、內(nèi)膜準(zhǔn)備方案為自然周期或激素替代。排除標(biāo)準(zhǔn)：女方年齡>35歲、BMI≥25 kg/m2或≤18 kg/m2、短方案或其他方式促排卵、IVF/ICSI周期數(shù)≥3、子宮內(nèi)膜異位癥或子宮畸形、促排卵方式準(zhǔn)備內(nèi)膜。將337個(gè)周期按移植前內(nèi)膜準(zhǔn)備方法的不同分為自然周期組(NC組)和激素替代周期組(HRT組)；再根據(jù)胚胎解凍后體外培養(yǎng)時(shí)間的不同分層(短時(shí)培養(yǎng)和過夜培養(yǎng)，短時(shí)培養(yǎng)指解凍后培養(yǎng)1～5 h移植;過夜培養(yǎng)指移植前1 d解凍后過夜培養(yǎng)，一般解凍距移植時(shí)間16～20 h)。本研究所用胚胎均為優(yōu)質(zhì)可移植胚胎。NC組、HRT組女方年齡分別為(29.4±3.3)、(29.2±3.7)歲，不孕年限分別為(4.24±3.01)、(4.38±3.13)年，內(nèi)膜厚度分別為(10.28±1.20)、(10.05±1.44)mm，BMI分別為(21.18±2.00)、(21.65±2.16)kg/m2，IVF方式受精分別占49.30%、55.64%，原發(fā)不孕分別占61.97%、63.54%，輸卵管因素導(dǎo)致不孕分別占77.46%、62.30%，男方因素導(dǎo)致不孕分別占18.31%、24.06%，排卵障礙導(dǎo)致不孕分別占4.23%、13.91%，內(nèi)膜形態(tài)A型分別占2.82%、2.26%，內(nèi)膜形態(tài)B型分別占76.06%、82.71%，內(nèi)膜形態(tài)C型分別占21.13%、15.04%，兩組輸卵管因素導(dǎo)致不孕所占比例、排卵障礙導(dǎo)致不孕所占比例比較，P<0.05。

1.2 內(nèi)膜準(zhǔn)備及凍胚解凍、培養(yǎng)、移植方法 NC組采用自然周期準(zhǔn)備方案。對(duì)月經(jīng)規(guī)律、有排卵的患者，從月經(jīng)周期第2、3天開始采用經(jīng)引道B超監(jiān)測(cè)卵泡，同時(shí)采集清晨空腹肘靜脈血，監(jiān)測(cè)血清基礎(chǔ)促黃體生成素(LH)、卵泡刺激素(FSH)及雌二醇(E2)水平；1周后監(jiān)測(cè)優(yōu)勢(shì)卵泡及血清LH、FSH和E2值，其后每日監(jiān)測(cè)B超，待優(yōu)勢(shì)卵泡發(fā)育至16 mm時(shí)檢測(cè)血LH、E2，排卵后3 d或LH峰后4 d且內(nèi)膜≥8 mm時(shí)開始肌注黃體酮60～80 mg行黃體支持。3 d后解凍胚胎，短時(shí)培養(yǎng)或過夜培養(yǎng)后移植。

HRT組采用激素替代周期準(zhǔn)備方案。對(duì)排卵障礙或周期不規(guī)律及既往自然周期內(nèi)膜<7 mm的患者，于月經(jīng)周期或撤退性出血的第2、3天起開始口服戊酸雌二醇，采用遞增方案，劑量在月經(jīng)第2～5天為4 mg/d,第6～9天為6 mg/d。B超監(jiān)測(cè)子宮內(nèi)膜厚度，<8 mm時(shí)戊酸雌二醇加至8 mg/d口服維持，≥8 mm、E2>200 pg/mL時(shí)，開始肌注黃體酮60～80 mg/d行黃體支持。4 d后解凍胚胎，短時(shí)培養(yǎng)或過夜培養(yǎng)后移植，移植日開始肌注黃體酮60～80 mg/d支持。

1.3 FET結(jié)局觀察方法 妊娠判斷：胚胎移植后14 d測(cè)晨尿HCG陽(yáng)性，血HCG>25 mIU/mL為生化妊娠，繼續(xù)行黃體支持；移植后4周行B超檢查，有孕囊及原始心管搏動(dòng)為臨床妊娠，繼續(xù)黃體支持至孕12周。種植率(著床率)=孕囊數(shù)/移植胚胎數(shù)×100%；臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%；多胎率=多胎妊娠周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%；流產(chǎn)率=流產(chǎn)周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%。

2 結(jié)果

2.1 NC組、HRT組FET結(jié)局比較 NC組、HRT組移植周期數(shù)分別為71、266，移植胚胎數(shù)分別為156、591，種植率分別為32.69%(51/156)、21.83%(129/591)，臨床妊娠率分別為59.15%(42/71)、41.73%(111/266)，流產(chǎn)率分別為7.14%(3/42)、16.22%(18/111)，多胎率分別為21.43%(9/42)、13.51%(15/111)，NC組種植率和臨床妊娠率高于HRT組(P均<0.05)。

2.2 NC組短時(shí)培養(yǎng)、過夜培養(yǎng)者FET結(jié)局比較 NC組短時(shí)培養(yǎng)、過夜培養(yǎng)女方年齡分別為(29.3±3.6)、(29.5±3.1)歲，不孕年限分別為(3.11±2.94)、(4.30±2.38)年，內(nèi)膜厚度分別為(10.36±1.83)、(10.95±1.83)mm，BMI分別為(20.98±2.11)、(21.31±1.95)kg/m2，IVF方式受精分別占50.00%、47.73%，原發(fā)不孕分別占67.86%、58.14%，輸卵管因素導(dǎo)致不孕分別占75.00%、79.07%，男方因素導(dǎo)致不孕分別占21.43%、16.28%，排卵障礙導(dǎo)致不孕分別占3.57%、4.65%，內(nèi)膜形態(tài)A型分別占3.57%、6.98%，內(nèi)膜形態(tài)B型分別占71.43%、74.42%，內(nèi)膜形態(tài)C型分別占25.00%、18.60%，兩者比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。NC組短時(shí)培養(yǎng)、過夜培養(yǎng)者移植周期數(shù)分別為28、43，移植胚胎數(shù)分別為64、92，種植率分別為28.13%(18/64)、35.87%(33/92)，臨床妊娠率分別為53.57%(15/28)、62.79%(27/43)，流產(chǎn)率分別為6.67%(1/15)、7.41%(2/27)，多胎率分別為20.00%(3/15)、22.22%(6/27)，上述指標(biāo)兩者比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 HRT組短時(shí)培養(yǎng)、過夜培養(yǎng)者FET結(jié)局比較 HRT組短時(shí)培養(yǎng)、過夜培養(yǎng)女方年齡分別為(29.5±3.6)、(28.9±3.7)歲，不孕年限分別為(4.62±3.32)、(4.15±2.94)年，內(nèi)膜厚度分別為(10.11±1.01)、(10.10±1.21)mm，BMI分別為(21.11±1.55)、(21.02±1.75)kg/m2，IVF方式受精分別占58.14%、53.28%，原發(fā)不孕分別占65.89%、61.31%，輸卵管因素導(dǎo)致不孕分別占61.24%、62.77%，男方因素導(dǎo)致不孕分別占24.81%、23.36%，排卵障礙導(dǎo)致不孕分別占13.95%、13.87%，內(nèi)膜形態(tài)A型分別占1.56%、1.46%，內(nèi)膜形態(tài)B型分別占83.72%、83.21%，內(nèi)膜形態(tài)C型分別占14.73%、15.33%，兩者比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。HRT組短時(shí)培養(yǎng)、過夜培養(yǎng)者移植周期數(shù)分別為129、137，移植胚胎數(shù)分別為292、299，種植率分別為21.92%(64/292)、21.74%(65/299)，臨床妊娠率分別為44.19%(57/129)、39.42%(54/137)，流產(chǎn)率分別為21.05%(12/57)、11.11%(6/54)，多胎率分別為12.28%(7/57)、14.81%(8/54)，上述指標(biāo)兩者比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 NC組、HRT組短時(shí)培養(yǎng)者FET結(jié)局比較 NC組、HRT組短時(shí)培養(yǎng)者一般情況、FET結(jié)局比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.5 NC組、HRT組過夜培養(yǎng)者FET結(jié)局比較 NC組過夜培養(yǎng)者子宮內(nèi)膜厚度大于HRT組(P=0.001)。NC組過夜培養(yǎng)者種植率和臨床妊娠率高于HRT組(P均<0.05)。其余指標(biāo)NC組、HRT組過夜培養(yǎng)者相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

胚胎著床是人類生殖的關(guān)鍵步驟，良好的子宮內(nèi)膜容受性是FET能否成功的關(guān)鍵因素[3]。多年來，為了提高FET成功率，臨床醫(yī)生摸索出了多種內(nèi)膜準(zhǔn)備方案，其中，自然周期和激素替代周期是最常用的兩種方法。自然周期適用于平素月經(jīng)規(guī)律、有自然排卵的患者，胚胎移植時(shí)機(jī)取決于監(jiān)測(cè)到的LH峰(自發(fā)或HCG誘發(fā))。激素替代周期用于既往月經(jīng)不規(guī)律、無排卵且對(duì)促排卵無反應(yīng)者，在該方案中，給患者應(yīng)用外源性雌激素以模擬內(nèi)源性雌激素促進(jìn)子宮內(nèi)膜增生的作用，抑制優(yōu)勢(shì)卵泡的發(fā)育，適時(shí)添加孕激素實(shí)現(xiàn)子宮內(nèi)膜向分泌期的轉(zhuǎn)化，綜合判斷移植時(shí)機(jī)。本研究結(jié)果顯示：NC組輸卵管因素導(dǎo)致不孕所占比例高于HRT組，而排卵障礙導(dǎo)致不孕所占比例低于HRT組，這符合兩種內(nèi)膜準(zhǔn)備方法的適應(yīng)證。目前，究竟哪種內(nèi)膜準(zhǔn)備方法能獲得更好FET結(jié)局，仍存爭(zhēng)議。

我們的研究發(fā)現(xiàn)自然周期方案的著床率及臨床妊娠率均高于激素替代周期方案，這與Xiao等[4]、Levron等[5]的大樣本回顧性臨床研究結(jié)果相同。然而，Zheng等[6]則發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于自然周期及半激素替代周期，激素替代方案可顯著提高著床率及臨床妊娠率，即使對(duì)于內(nèi)膜≤8 mm者，激素替代周期仍能獲得較好FET結(jié)局。魏思達(dá)等[7]也認(rèn)為激素替代周期能獲得滿意種植率，影響FET臨床妊娠率的因素包括女方年齡、FET日E2水平、移植胚胎的質(zhì)量、移植胚胎的數(shù)目、移植胚胎的發(fā)育階段(細(xì)胞期或囊胚期)。另有學(xué)者認(rèn)為各種內(nèi)膜準(zhǔn)備方法對(duì)FET結(jié)局的影響無差異：Groenewoud等[8]的一項(xiàng)Meta分析指出，在凍融胚胎移植中，各種內(nèi)膜準(zhǔn)備方案對(duì)于臨床妊娠率、繼續(xù)妊娠率及活產(chǎn)率沒有影響，對(duì)周期取消率的影響尚無定論。田莉等[9]也認(rèn)為年齡是影響FET結(jié)局的關(guān)鍵因素，她們的研究結(jié)果顯示：對(duì)于年齡≤35歲者可根據(jù)是否有排卵而采用自然周期或激素替代周期，對(duì)移植及妊娠結(jié)局均無影響；而對(duì)于年齡>35歲者，建議采用激素替代周期方案準(zhǔn)備內(nèi)膜，這可能會(huì)提高FET臨床妊娠率。

解凍后移植時(shí)機(jī)是影響FET結(jié)局的另一可控因素。目前，F(xiàn)ET選擇胚胎的依據(jù)主要為兩種形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果，一種是觀察到解凍后胚胎卵裂球是否存活，這個(gè)過程只需短時(shí)培養(yǎng)(1～3 h)即可；另一種方法是胚胎解凍后經(jīng)過夜培養(yǎng)，觀察細(xì)胞期胚胎卵裂球是否分裂、囊胚是否擴(kuò)張等，即胚胎是否復(fù)蘇。目前，關(guān)于胚胎解凍后體外培養(yǎng)時(shí)間亦尚存爭(zhēng)議。Rato等[10]認(rèn)為與過夜培養(yǎng)相比，短時(shí)培養(yǎng)與高臨床妊娠率和種植率相關(guān)；龔紹瓊[11]的研究結(jié)果與之相似，而后者還認(rèn)為流產(chǎn)率的增加與延長(zhǎng)體外培養(yǎng)時(shí)間有關(guān)。本研究共收集過夜培養(yǎng)180周期，短時(shí)培養(yǎng)157周期，在相同的內(nèi)膜準(zhǔn)備方法內(nèi)，體外培養(yǎng)時(shí)間對(duì)FET結(jié)局影響無差別，這與Guo等[12]的研究結(jié)果相似；乜照燕等[13]認(rèn)為對(duì)于優(yōu)質(zhì)胚胎，體外培養(yǎng)時(shí)間不影響FET結(jié)局；秦祖興等[14]研究結(jié)果顯示，延長(zhǎng)體外培養(yǎng)時(shí)間不能改善胚胎質(zhì)量，但是可以合理安排次日實(shí)驗(yàn)室工作。本研究還發(fā)現(xiàn)，在相同培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，兩種內(nèi)膜準(zhǔn)備方法短時(shí)培養(yǎng)FET結(jié)局無差異，而過夜培養(yǎng)時(shí)，自然周期方案內(nèi)膜厚度大于激素替代周期方案，著床率及臨床妊娠率亦均高于后者。我國(guó)學(xué)者吳黎等[15]通過分析同濟(jì)醫(yī)院498個(gè)FET周期發(fā)現(xiàn)，延長(zhǎng)凍融胚胎體外培養(yǎng)時(shí)間可以更好地根據(jù)胚胎發(fā)育潛能挑選優(yōu)質(zhì)胚胎移植,提高妊娠率,改善妊娠結(jié)局。柴三明等[16]也認(rèn)為延長(zhǎng)體外培養(yǎng)時(shí)間可以使胚胎與子宮內(nèi)膜發(fā)育同步，還可使冷凍保護(hù)劑充分代謝，減少其對(duì)胚胎后續(xù)發(fā)育的影響，顯著提高胚胎發(fā)育潛能及臨床妊娠率。然而，上述所有研究均未涉及FET前子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備方案，所以，相對(duì)而言，我們的研究結(jié)果更可信，更具臨床實(shí)用價(jià)值。

本研究的不足之處在于為回顧性研究，研究對(duì)象不能進(jìn)行隨機(jī)分組，另外樣本量較小，但為了減少偏倚，本研究設(shè)有嚴(yán)格納入標(biāo)準(zhǔn)，使兩組對(duì)象具有可比性，確保結(jié)果的可靠性。

總之，自然周期方法準(zhǔn)備內(nèi)膜可獲得較好的FET結(jié)局，其子宮內(nèi)膜增生及轉(zhuǎn)化所需的激素來源是卵泡發(fā)育產(chǎn)生的內(nèi)源性性激素，符合生理要求，對(duì)內(nèi)膜微環(huán)境的干擾??；而激素替代周期中子宮內(nèi)膜生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)化完全依賴于外源性激素，其微觀環(huán)境受到一定程度損壞，影響了子宮內(nèi)膜容受性。在臨床實(shí)際工作中，應(yīng)綜合評(píng)估患者各方面情況，遵循個(gè)體化原則，對(duì)于有條件的患者，建議其首先考慮自然周期方法準(zhǔn)備內(nèi)膜。

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Observation on outcome of frozen-thawed embryo transfer between short-time and long-time culture to infertile patients whose endometria were prepared with natural or hormone replacement cycle protocol

FANXiaoling1,WANGLei,ZHANGYafeng,HURong

(1CaihongHospital,Xianyang712000,China)

Objective To observe the outcome of frozen-thawed embryo transfer (FET) between the short-time and long-time culture embryos of the infertile patients whose endometria were prepared with natural or hormone replacement cycle protocol.Methods A total of 293 patients and 337 FET cycles were enrolled, and all cycles were divided into two groups depending on their means of preparing the endometria: natural cycle (NC) protocol (NC group) and hormone replacement cycle (HRT) protocol (HRT group), each group was divided into two layers according to the culture time of thawed embryos in vitro: short-term and overnight layers. The outcomes of clinical pregnancy rate (CPR), implantation rate (IR), spontaneous abortion rate (SAR) and multiple pregnancy rate (MPR) per cycle were compared.Results In the NC and HRT groups, the IR was respectively 32.69% and 21.83%, the CPR was 59.15% and 41.73% , the SAR was 7.14% and 16.22%, the MPR was 21.43% and 13.51%, respectively, and the IR and CPR were all higher in the NC group than those of the HRT group (allP<0.05). In the short-term and overnight layers of the NC group, the IR was 28.13% and 35.87%, the CRP was 53.57% and 62.79%, the SAR was 6.67% and 7.41%, and the MPR was 20.00% and 22.22%, respectively; no significant differences were found between the two groups. Similarly, in the HRT group's different culture time layers, the IR was 21.92% and 21.74%, the CRP was 44.19% and 39.42%, the SAR was 21.05% and 11.11%, and the MPR was 12.28% and 14.81%, respectively; no statistically significant difference was found. In short-term layer, the outcomes of FET were not statistically different between the NC group and HRT group. Compared with the overnight layer of HRT group, IR and CPR were all higher than in the overnight layer of NC group (allP<0.05).Conclusion Endometrium prepared with NC protocol can obtain a better FET outcome than that of the HRT protocol, which mainly embodied in the selection of the thawed embryos'culture time in vitro before transplant, and culture overnight is appropriate.

embryo transfer; natural cycle; endometrial preparation; hormone replacement cycle

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81260109)；寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院特殊人才啟動(dòng)項(xiàng)目(XT201421)；寧夏醫(yī)科大學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

范曉玲(1975-),女，主治醫(yī)師，主要從事婦科生殖內(nèi)分泌的研究。E-mail: fanxl19750108@163.com

簡(jiǎn)介：胡蓉(1974-)，女，主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事婦科生殖內(nèi)分泌的研究。E-mail: hr7424@126.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.35.002

713.7

A

1002-266X(2016)35-0005-04

2016-05-30)

項(xiàng)目(XY201404);寧夏自治區(qū)科技攻關(guān)項(xiàng)目(KF2010-49)。