吳昊，宗志敏，李秀秀

（1.徐州工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院化學(xué)工程技術(shù)學(xué)院，江蘇徐州221140；2.中國(guó)礦業(yè)大學(xué)化工工程學(xué)院，江蘇徐州221116）

超聲-微波協(xié)同萃取銀杏葉黃酮與內(nèi)酯B的工藝研究

吳昊1，2，宗志敏2，李秀秀1

（1.徐州工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院化學(xué)工程技術(shù)學(xué)院，江蘇徐州221140；2.中國(guó)礦業(yè)大學(xué)化工工程學(xué)院，江蘇徐州221116）

研究了超聲-微波協(xié)同萃取銀杏葉黃酮與內(nèi)酯B的最佳工藝條件，以銀杏葉黃酮與內(nèi)酯B得率為考核指標(biāo)，探討料液比、提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)以及浸提時(shí)間等因素對(duì)銀杏葉黃酮與內(nèi)酯B得率的影響，并通過(guò)單因素及正交試驗(yàn)對(duì)其提取工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，最優(yōu)提取工藝條件為料液比1∶20(g∶mL)，提取溫度50℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%和提取時(shí)間4 min。在此最佳條件下，銀杏葉黃酮及內(nèi)酯B的得率分別為2.25%和0.81%。

銀杏葉；黃酮；內(nèi)酯B；超聲波；微波；提取條件

銀杏（Ginkgo bilobaL.）別名白果、公孫樹，是中生代侏羅紀(jì)時(shí)期孑遺植物的稀有樹種。銀杏葉來(lái)源獲取方便且是銀杏樹的有效活性部位，主要含有豐富的黃酮類化合物和萜內(nèi)酯類等活性物質(zhì)，具有抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、防治心血管疾病及提高人體免疫能力等功效，銀杏葉化合物已成為熱門的天然產(chǎn)物活性物質(zhì)研究之一[1-2]。

目前，對(duì)銀杏葉活性成分的研究主要集中在某單個(gè)活性成分的提取、分離純化及其功效研究等方面，而對(duì)于銀杏葉中主要活性成分的同時(shí)提取研究較少[3-5]。當(dāng)前銀杏葉活性成分的提取主要有溶劑提取法、超聲波法、微波法以及超臨界流體萃取法。溶劑提取法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單、成本低。缺點(diǎn)是有機(jī)試劑容易造成環(huán)境的污染、且提取耗時(shí)長(zhǎng)，效率低；超臨界流體萃取的優(yōu)點(diǎn)是提取效率高、收率大，缺點(diǎn)是設(shè)備昂貴、成本高且操作繁瑣；超聲波和微波法是分別利用機(jī)械波和電磁波破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，將活性成分充分溶出，因而花費(fèi)時(shí)間短，不破壞活性成分，萃取高效，已被廣泛應(yīng)用于天然活性物質(zhì)的提取、樣品的預(yù)處理和污染物的清洗等方面[6-10]。唐仕榮[11]研究了微波-超聲波協(xié)同萃取銀杏黃酮工藝，將微波-超聲波協(xié)同萃取方法作為一種原材料的預(yù)處理方法，考察了銀杏黃酮這一類化合物組分的提取。

本研究旨在通過(guò)超聲-微波協(xié)同工藝提取銀杏中黃酮、萜內(nèi)酯B的主要活性成分，考察料液比、提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間對(duì)銀杏葉黃酮與內(nèi)酯B得率的影響，優(yōu)化超聲波-微波協(xié)同萃取提取工藝，為銀杏葉資源的綜合利用研究提供試驗(yàn)依據(jù)，對(duì)銀杏葉資源的綜合利用開發(fā)研究具有重要意義。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

銀杏葉：校園內(nèi)采集；甲醇、磷酸（均為色譜級(jí)）：美國(guó)Sigma-Aldrich公司；乙醇、乙酸乙酯、石油醚（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞98%）、山奈素標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞98.5%）、異鼠李素標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞98.5%）、銀杏內(nèi)酯B標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞98.5%）：中國(guó)藥品生物制品鑒定所。

1.2儀器與設(shè)備

Essentia LC-15C高效液相色譜：島津儀器（蘇州）有限公司；ATY124電子天平：日本島津公司；CW-2000超聲波-微波協(xié)同萃取儀（超聲波固定功率50W，頻率40kHZ，微波功率可調(diào)）：上海新拓分析儀器科技有限公司；UV1901PCS紫外可見分光光度計(jì)：上海佑科儀器儀表有限公司；RV 10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：艾卡（廣州）儀器設(shè)備有限公司；GL-20B高速冷凍離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1銀杏葉的預(yù)處理

將銀杏葉在50℃條件下烘干粉碎，過(guò)60目篩，加入一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液浸泡24 h待用，以有利于后續(xù)的超聲微波協(xié)同萃取。

1.3.2超聲微波協(xié)同萃取工藝

在時(shí)間程序下設(shè)置微波功率為300 W，微波超聲協(xié)同運(yùn)行40 s（超聲功率50 W及頻率40 kHz），隨后在恒溫程序下設(shè)置一定的料液比、溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間等因素條件超聲微波協(xié)同萃取銀杏葉黃酮與萜內(nèi)酯B。

1.3.3銀杏葉黃酮含量的測(cè)定

將預(yù)處理好的銀杏葉，放置于萃取瓶?jī)?nèi)，加入乙醇溶液，設(shè)置一定的條件進(jìn)行微波超聲協(xié)同萃取，提取完畢后，于5 000 r/min條件下離心20 min，取上清液真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至無(wú)液體流出，加甲醇-25%鹽酸溶液（4∶1）的混合液25 mL，放置于水浴內(nèi)加熱回流30 min，而后冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，經(jīng)0.45μm微濾膜過(guò)濾，取樣待檢，銀杏葉黃酮含量的測(cè)定用高效液相色譜法[12]。色譜條件：Wondasil-C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.4%磷酸（50∶50，V/V）；流速：1.0mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：360 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20 μL；定量采用外標(biāo)法。

1.3.4銀杏內(nèi)酯B含量的測(cè)定

銀杏萜內(nèi)酯類化合物主要有銀杏內(nèi)酯A、B、C、J和M，均為血小板活化因子（platelet activating factor，PAF）拮抗劑，由于銀杏內(nèi)酯B對(duì)PAF產(chǎn)生的拮抗作用最強(qiáng)，因此本試驗(yàn)萜內(nèi)酯類化合物選擇以銀杏內(nèi)酯B為考察指標(biāo)。

按1.3.2方法得到的粗提液取樣真空濃縮，干燥粉碎，準(zhǔn)確稱量后分散于水中，并加入3倍體積的石油醚萃取，靜置后分層，加入乙醇溶解，濃縮至干[13]。濃縮后物質(zhì)加入乙酸乙酯，完全溶解后加入NaHCO3，調(diào)整pH 8～9，加入HCl調(diào)整pH至中性。振蕩混勻后，靜置分層，取上層溶液過(guò)濾，取樣濃縮至無(wú)液體流出，加甲醇7mL超聲溶解，定容至10mL，經(jīng)0.45 μm微濾膜過(guò)濾，取樣待檢測(cè)，銀杏內(nèi)酯B含量測(cè)定用高效液相色譜法[14-15]。色譜條件：Wondasil-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.1%磷酸（35∶65， V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：220 nm；柱溫：28℃；進(jìn)樣量：10 μL；定量采用外標(biāo)法。

1.3.5標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

槲皮素、山奈素與異鼠李素：分別精確稱取槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品50 mg、山奈素標(biāo)準(zhǔn)品20 mg、異鼠李素標(biāo)準(zhǔn)品20 mg，分別置于100 mL棕色容量瓶中，加入部分甲醇超聲溶解，再定容至刻度線，精密吸取對(duì)照品溶液適量，用甲醇分別制成質(zhì)量濃度為0.01 mg/mL、0.02 mg/mL、0.04 mg/mL、0.08mg/mL、0.10 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)使用液。分別精密吸取各濃度對(duì)照溶液20 μL注入高效液相色譜儀，測(cè)定峰面積。分別以槲皮素質(zhì)量濃度、山奈素質(zhì)量濃度、異鼠李素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)X（mg/mL），峰面積（mAU）為縱坐標(biāo)Y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得槲皮素線性回歸方程為Y=0.011 9X+0.000 5，相關(guān)系數(shù)R=0.999 9；山奈素線性回歸方程為Y=0.012 5X-0.000 1，相關(guān)系數(shù)R=0.999 9；異鼠李素線性回歸方程為Y= 0.010 7X+0.000 3，相關(guān)系數(shù)R=0.999 9。

銀杏內(nèi)酯B：精密稱取50 mg的內(nèi)酯B標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解并定容至10mL容量瓶中，搖勻，分別精密移取2.5 mL、2.0 mL、1.0 mL、0.5 mL標(biāo)準(zhǔn)液，分別轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶中，加入甲醇定容，搖勻，分別配制成質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL、2.0 mg/mL、1.0 mg/mL、0.5 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別精密吸取各濃度對(duì)照溶液10 μL注入高效液相色譜儀，測(cè)定峰面積。以銀杏內(nèi)酯B質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)X，峰面積（mAU）為縱坐標(biāo)Y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程為Y=357.59X-3.491 3，相關(guān)系數(shù)R=0.999 9。

1.3.6提取條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

稱取10 g經(jīng)預(yù)處理的銀杏葉粉，按不同料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g∶mL）），加入不同體積分?jǐn)?shù)（40%、50%、60%、70%、80%）乙醇溶液，在不同提取溫度（25℃、35℃、45℃、55℃、65℃），不同提取時(shí)間1min、2min、3min、4 min、5 min條件下，分別考察料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度及提取時(shí)間對(duì)銀杏葉黃酮與內(nèi)酯B得率的影響。

1.3.7提取條件優(yōu)化正交試驗(yàn)

選定超聲-微波協(xié)同萃取銀杏黃酮和內(nèi)酯B工藝中的料液比、提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間作為考察的4個(gè)因素，每個(gè)因素各取3個(gè)水平，以銀杏黃酮和內(nèi)酯B的綜合得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用L9（34）正交設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)，正交試驗(yàn)因素水平見表1。

表1　提取條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1　Factors and levels of orthogonal experiments for extraction conditions optimization

1.3.8銀杏葉黃酮、銀杏葉內(nèi)酯B及綜合得率的計(jì)算

總黃酮醇苷質(zhì)量（mg）=[槲皮素質(zhì)量（mg）+山奈素質(zhì)量（mg）+異鼠李素質(zhì)量（mg）]×2.51[16]

式中：2.51是中國(guó)藥典總黃酮醇苷質(zhì)量計(jì)算中的黃酮醇苷

與苷元之間的平均換算因子。

式中：C為測(cè)定樣液的質(zhì)量濃度，mg/mL；N為樣品稀釋倍數(shù)；V為樣液濃縮體積，mL；W為樣品質(zhì)量，g。

權(quán)衡銀杏葉中黃酮、內(nèi)酯B兩類物質(zhì)對(duì)藥理活性的貢獻(xiàn)，設(shè)定銀杏葉中黃酮、內(nèi)酯B得率的權(quán)重分別為40%和60%，故綜合得率（%）=銀杏葉黃酮得率×40%＋銀杏葉內(nèi)酯B得率×60%。

2　結(jié)果與分析

2.1料液比對(duì)超聲協(xié)同微波萃取銀杏葉黃酮與內(nèi)酯B得率的影響

圖1　料液比對(duì)銀杏葉黃酮與內(nèi)酯B得率的影響Fig.1　Effect of solid-liquid ratio on yield of flavonoids and ginkgolide B fromGinkgo biloba

由圖1可以看出，料液比在1∶10～1∶25（g∶mL）時(shí)，銀杏葉黃酮與內(nèi)酯B得率逐漸增加，并且黃酮的溶出速率高于內(nèi)酯B，可能是因?yàn)殂y杏中黃酮的溶解性高于銀杏內(nèi)酯B；當(dāng)料液比增加到1∶25（g∶mL）時(shí)，黃酮與內(nèi)酯B得率即達(dá)到了較高值，當(dāng)料液比＞1∶25（g∶mL）時(shí)，不僅得率沒有明顯增加，而且不利于后續(xù)的離心濃縮操作。因此，料液比為1∶25（g∶mL）為宜。

2.2提取溫度對(duì)超聲協(xié)同微波萃取銀杏葉黃酮與內(nèi)酯B得率的影響

由圖2可以看出，提取溫度分別在25～45℃及25～55℃時(shí)，隨提取溫度增大銀杏葉黃酮與內(nèi)酯B得率相應(yīng)提高，這是因?yàn)樘崛囟仍礁?，較高的溫度促進(jìn)活性物質(zhì)分子的分子運(yùn)動(dòng)擴(kuò)散，有利于銀杏葉黃酮與內(nèi)酯B的滲出。但在提取溫度分別超過(guò)45℃及55℃之后，銀杏葉黃酮與內(nèi)酯B得率逐漸減小?？赡苁怯捎跍囟冗^(guò)高，超聲-微波協(xié)同瞬間熱效應(yīng)過(guò)于明顯，使得局部溫度過(guò)高導(dǎo)致黃酮和內(nèi)酯成分的破壞，從而影響了銀杏葉黃酮和內(nèi)酯B的得率；提取溫度分別達(dá)到45℃、55℃時(shí)，銀杏葉黃酮、銀杏葉內(nèi)酯B得率最高，由此可以得出黃酮對(duì)溫度的敏感程度高于內(nèi)酯B對(duì)溫度的敏感程度。因此，提取溫度50℃為宜。

圖2　提取溫度對(duì)銀杏葉黃酮與內(nèi)酯B得率的影響Fig.2　Effect of extraction temperature on yield of flavonoids and ginkgolide B fromGinkgo biloba

2.3乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)超聲協(xié)同微波萃取銀杏葉黃酮與內(nèi)酯B得率的影響

圖3　乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)銀杏葉黃酮與內(nèi)酯B得率的影響Fig.3　Effect of ethanol content on yield of flavonoids and ginkgolide B fromGinkgo biloba

由圖3可以看出，乙醇體積分?jǐn)?shù)分別在40%～60%及40%～70%，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，銀杏葉黃酮與內(nèi)酯B得率逐漸增大；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為60%、70%時(shí)，銀杏葉黃酮、銀杏葉內(nèi)酯B得率達(dá)到最大值；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)分別高于60%、70%時(shí)，銀杏葉黃酮、銀杏葉內(nèi)酯B得率逐漸降低。這與活性組分極性有關(guān)，由于銀杏葉內(nèi)酯B由倍半萜內(nèi)酯和二萜內(nèi)酯組成，極性相比較黃酮來(lái)說(shuō)較小，因此容易被高體積分?jǐn)?shù)乙醇溶劑浸提，低體積分?jǐn)?shù)乙醇會(huì)導(dǎo)致活性組分不能完全溶出。因此，考慮到兩種有效活性成分的提取，選60%為最佳的乙醇體積分?jǐn)?shù)。

2.4提取時(shí)間對(duì)超聲協(xié)同微波萃取銀杏葉黃酮與內(nèi)酯B得率的影響

由圖4可以看出，提取時(shí)間在1～4 min內(nèi)，銀杏葉黃酮與內(nèi)酯B的得率隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，這是因?yàn)殡S著提取時(shí)間的增加，在超聲波微波協(xié)同作用下，溶劑分子運(yùn)動(dòng)加快，不斷促進(jìn)銀杏葉活性成分的溶出；當(dāng)提取時(shí)間為4 min，銀杏葉黃酮與內(nèi)酯B的得率達(dá)到最大值；當(dāng)提取時(shí)間＞4 min后，銀杏葉黃酮與內(nèi)酯B的得率出現(xiàn)下降趨勢(shì)，一方面可能是因?yàn)橐掖既軇┑膿]發(fā)造成浸提不充分，另一方面可能是超聲波微波協(xié)同長(zhǎng)時(shí)間的作用有可能造成活性成分的損失或破壞。因此，提取時(shí)間4 min為宜。

圖4　提取時(shí)間對(duì)銀杏葉黃酮與內(nèi)酯B得率的影響Fig.4　Effect of extraction time on yield of flavonoids and ginkgolide B fromGinkgo biloba

2.5提取條件優(yōu)化正交試驗(yàn)

以銀杏葉黃酮與內(nèi)酯B綜合得率為考察指標(biāo)進(jìn)行正交試驗(yàn)，結(jié)果與分析見表2，方差分析見表3。

表2　提取條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2　Results and analysis of orthogonal experiments for extraction conditions optimization

表3　正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3　Variance analysis of orthogonal experiments results

由表2可以看出，各因素對(duì)銀杏葉黃酮和內(nèi)酯B綜合得率的影響因素順序?yàn)椋禾崛囟龋玖弦罕龋疽掖俭w積分?jǐn)?shù)＞提取時(shí)間，提取條件的最佳組合為A1B2C3D2，即超聲-微波協(xié)同提取銀杏葉黃酮與內(nèi)酯B的最優(yōu)工藝條件為：料液比1∶20（g∶mL），提取溫度50℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%和提取時(shí)間4 min。在此最佳條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，銀杏葉黃酮得率為2.25%，內(nèi)酯B得率為0.81%。

由表3可知，對(duì)銀杏葉黃酮與內(nèi)酯B綜合得率影響顯著的是料液比和乙醇體積分?jǐn)?shù)（P＜0.05）。提取溫度對(duì)銀杏葉黃酮與內(nèi)酯B的影響極顯著（P＜0.01）。

3　結(jié)論

超聲-微波協(xié)同萃取銀杏葉黃酮與內(nèi)酯B的最佳工藝條件為：料液比1∶20（g∶mL），提取溫度50℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，提取時(shí)間4 min。在此最佳條件下，銀杏葉黃酮得率為2.25%，內(nèi)酯B得率為0.81%，綜合得率為1.39%。超聲-微波協(xié)同提取銀杏葉黃酮與內(nèi)酯B兩種有效成分可以大大縮短提取時(shí)間，有效地提高了銀杏葉黃酮和內(nèi)酯B的得率，優(yōu)于傳統(tǒng)提取方法，是一種新型有效的提取方法，并為后續(xù)銀杏葉黃酮與內(nèi)酯B的分離奠定了基礎(chǔ)。

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Extraction of flavonoids and ginkgolide B fromGinkgo bilobaby ultrasonic wave and microwave synergistic technology

WU Hao1,2,ZONG Zhimin2,LI Xiuxiu1
(1.School of Chemical Engineering,Xuzhou College of Industrial Technology,Xuzhou 221140,China; 2.School of Chemical Engineering＆Technology,China University of Mining and Technology,Xuzhou 221116,China)

The optimum extraction conditions of flavonoids and ginkgolide B fromGinkgo bilobawere researched by ultrasonic wave and microwave synergistic technology.Using the yield ofG.bilobaflavonoids and ginkgolide B as evaluation indexes,the effects of solid-liquid ratio,extraction temperature,ethanol content and extraction time on the yield ofG.bilobaflavonoids and ginkgolide B were discussed,and the extraction conditions were optimized by single factor and orthogonal experiments.The results showed that the optimum extraction conditions were solid-liquid ratio 1∶20 (g∶ml),extraction temperature 50℃,ethanol content 70%and extraction time 4 min.Under the optimum conditions,the yield ofG.bilobaflavonoids and ginkgolide B were 2.25%and 0.81%,respectively.

Ginkgo biloba;flavonoids;ginkgolide B;ultrasonic wave;microwave;extraction conditions

R282.71

0254-5071（2016）10-0153-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.10.034

2016-09-13

徐州市生化資源綜合利用與清潔生產(chǎn)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室課題和校級(jí)課題（20550886599950）

吳昊（1980-），男，副教授，博士研究生，研究方向?yàn)樯锘钚晕镔|(zhì)提取及資源綜合利用。