陳彬，閆寅卓*，王德良，陳翔

（1.中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京100015；2.江蘇洋河酒廠股份有限公司，江蘇宿遷223800）

濃香型白酒窖泥鈣化成因及緩解措施的初步探究

陳彬1，閆寅卓1*，王德良1，陳翔2

（1.中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京100015；2.江蘇洋河酒廠股份有限公司，江蘇宿遷223800）

窖泥對(duì)于濃香型白酒的品質(zhì)起著重要的作用，而目前各大酒廠窖池中的窖泥卻頻頻出現(xiàn)鈣化問題，直接影響了白酒的酒質(zhì)。該研究通過對(duì)鈣化窖泥和優(yōu)質(zhì)老窖泥在理化指標(biāo)方面進(jìn)行對(duì)比，得出窖泥鈣化的主要原因是：由于窖泥中水分降低、pH降低等因素，導(dǎo)致窖泥中形成乳酸鈣、乳酸鐵等白色晶體，使得窖泥板結(jié)、出現(xiàn)白斑，質(zhì)量下降。鑒于此，該研究采取在窖泥中加入產(chǎn)堿桿菌（Alcaligenessp.）、酒花酸浸提液和乳酸鏈球菌肽（Nisin）3種措施，以此來緩解窖泥的鈣化問題。結(jié)果表明，發(fā)現(xiàn)3種措施均能夠緩解窖泥的鈣化，且3種措施緩解的側(cè)重點(diǎn)不同，綜合分析后發(fā)現(xiàn)加入Nisin的效果最佳。

窖泥；鈣化；原因；緩解措施

眾所周知，生產(chǎn)濃香型酒，窖泥是基礎(chǔ)，大曲是動(dòng)力，工藝是關(guān)鍵[1]。好酒源自好窖，便是這個(gè)道理[2]。優(yōu)質(zhì)的窖泥被稱為“泥巴國(guó)寶”、“黃金微生物”等，其一直吸引著眾多學(xué)者的高度關(guān)注[3]。窖泥中棲息著大量的微生物，這些微生物錯(cuò)綜復(fù)雜，其中對(duì)于濃香型白酒產(chǎn)生重要影響的己酸菌、乳酸菌、乙酸菌、甲烷菌等，特別是己酸菌[5-6]。因此窖泥質(zhì)量的好壞，直接影響著其內(nèi)部的菌系結(jié)構(gòu)，并對(duì)酒質(zhì)造成較大影響[7]。

由于種種因素，窖泥在使用幾年后會(huì)出現(xiàn)不同程度的退化現(xiàn)象，窖泥逐漸鹽堿化、僵硬，窖壁表面及窖底析出淺白色顆粒或針狀結(jié)晶物質(zhì)，即窖泥的“鈣化”現(xiàn)象[8-9]。這嚴(yán)重影響了窖泥中的微生物菌系，特別是己酸菌的生長(zhǎng)。目前國(guó)內(nèi)主要通過變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）技術(shù)對(duì)窖泥中的微生物組成、結(jié)構(gòu)，進(jìn)行分析研究[10-12]，而國(guó)外幾乎沒有對(duì)其研究。而對(duì)于鈣化的定義以及鈣化窖泥對(duì)酒質(zhì)的影響，還未見詳盡的報(bào)道與總結(jié)；因此分析鈣化窖泥中的成分以及如何解決鈣化現(xiàn)象，將是研究窖泥的主體方向。

本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)鈣化窖泥和優(yōu)質(zhì)窖泥的理化成分進(jìn)行分析研究，并進(jìn)行了窖泥鈣化緩解措施的初步探究，該研究系統(tǒng)揭示了窖泥鈣化形成因素，為行業(yè)中緩解窖泥鈣化提供了技術(shù)和理論上的支持。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

窖泥：江蘇洋河酒廠股份有限公司（洋河酒廠、雙溝酒廠）；產(chǎn)堿菌（Alcaligenessp.）：中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心；乳酸、乙酸、甲酸、丙酮酸、戊酸、己酸（均為色譜純）：賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司。

酒花酸浸提液：巴特哈斯（北京）貿(mào)易有限公司；Nisin：天津艾瑪斯特生物科技有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

Multiwave 3000安東帕微波消解儀：奧地利安東帕（中國(guó)）有限公司；DNP-9162電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；NexION 350電感耦合等離子體質(zhì)譜儀：珀金埃爾默企業(yè)管理（上海）有限公司；ISC3000離子色譜儀：美國(guó)DIONEX公司；Autosystem XV氣相色譜儀：美國(guó)PerkinElmer公司；PHS-3C pH計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器股份公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1窖泥水分、pH和氧化還原電位的測(cè)定

取窖泥10 g（精確至0.001 g），在105℃烘箱內(nèi)烘3 h，取出后，迅速移入干燥器內(nèi)冷卻0.5 h，稱量。再放入電熱干燥箱內(nèi)，繼續(xù)烘干1 h，冷卻稱量，直至恒質(zhì)量，以此來計(jì)算窖泥水分含量；取窖泥10 g，溶解在100 mL超純水中，過濾后，用pH計(jì)測(cè)定其pH值和氧化還原電位。

1.3.2窖泥中金屬離子的測(cè)定[10]

為了測(cè)定窖泥中的金屬離子，該實(shí)驗(yàn)采用NexION 350電感耦合等離子體質(zhì)譜儀，具體操作如下：取少量窖泥，風(fēng)干7 d后進(jìn)行研磨，并過200目篩子。稱量0.2 g（精確至0.001 g），放置到消解罐中，在消解罐中加入4 mL硝酸（HNO3），2 mL H2O2，2 mL氫氟酸（HF）后置于微波消解儀中消解1 h。消解結(jié)束后，加入1 mL高氯酸（HClO4），放置到加熱板上，蒸發(fā)至剩余1 mL左右。消解罐中的樣本轉(zhuǎn)入50 mL的定容瓶中，用1%的HNO3進(jìn)行定容，再用1%的HNO3將其稀釋100倍進(jìn)行上機(jī)測(cè)試[13-14]。

1.3.3窖泥中有機(jī)酸的測(cè)定

采用ISC3000離子色譜儀對(duì)窖泥中有機(jī)酸進(jìn)行測(cè)定。取窖泥5g，溶解于25mL的超純水中，充分振蕩后，1 800 r/min離心10 min；采用0.45 μm的水相膜進(jìn)行過濾，稀釋100倍后上機(jī)測(cè)樣。儀器設(shè)置條件如下：柱子型號(hào)為IONPAAG11-HC（4 mm×50 mm），柱溫30℃，氮壓6 kPa。為了保證樣品數(shù)據(jù)的真實(shí)性，需每隔5個(gè)樣本加入一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣（質(zhì)量濃度為50 μg/L的乳酸）進(jìn)行校正。

1.3.4窖泥鈣化的緩解措施

表1　實(shí)驗(yàn)中窖泥3種添加方式的添加量Table 1　Additive amounts of pit muds by three measures in the experiments

由于雙溝酒廠窖泥鈣化現(xiàn)象較為嚴(yán)重，在對(duì)其窖泥進(jìn)行了理化性質(zhì)探究的基礎(chǔ)上，主要采取了以下3種措施：①加入產(chǎn)堿菌（Alcaligenessp.）液；②加入酒花酸浸提液；③加入Nisin；制備方式，添加量及所用窖泥、酒醅量詳情見表1。將3種制備液與窖泥混合均勻，然后涂抹到小型瓷罐壁上，加入酒醅后密封。經(jīng)過40 d的發(fā)酵，并結(jié)合窖泥和酒醅理化指標(biāo)，以此來判斷這些措施是否有效。

1.3.5酒醅中風(fēng)味物質(zhì)的測(cè)定

取發(fā)酵完成后的酒醅25 g，加入50 mL體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇，蒸餾出25 mL，然后過0.45 μm的有機(jī)膜，進(jìn)行氣相色譜檢測(cè)。氣相色譜條件：CP-Wax 57 CB毛細(xì)管柱（50 m×0.25 mm×0.2 μm），載氣（高純氮）：流速1 mL/min，分流比：10∶1；氫氣：流速為45 mL/min；空氣：流速為450 mL/min；檢測(cè)器溫度270℃；進(jìn)樣器溫度240℃；進(jìn)樣量1 μL。為了保證測(cè)得結(jié)果的準(zhǔn)確性，加入3個(gè)混合內(nèi)標(biāo)，其分別為異戊醛、異戊醇、己酸異戊酯。

2　結(jié)果與分析

2.1窖泥鈣化的成因

為了找到窖泥鈣化的形成原因，將鈣化窖泥和優(yōu)質(zhì)窖泥的理化性質(zhì)（水分含量、pH值、氧化還原電位、金屬離子和有機(jī)酸含量）進(jìn)行對(duì)比。

2.1.1窖泥含水量、pH值和氧化還原電位

根據(jù)前人研究發(fā)現(xiàn)，鈣化窖泥相對(duì)于優(yōu)質(zhì)窖泥，其主要表現(xiàn)為窖泥僵硬，甚至出現(xiàn)白色晶體，且其主要發(fā)生在窖泥使用周期的中后期。因此窖泥質(zhì)量的優(yōu)劣，最直觀的表現(xiàn)即為含水量和pH值。鈣化窖泥和優(yōu)質(zhì)窖泥在含水量、pH值和氧化還原電位方面的對(duì)比結(jié)果見表2。

表2　窖泥的含水量、pH值和氧化還原電位Table 2　Moisture content,pH and redox potential of the pit mud

由表2可知，鈣化窖泥無論是窖底還是窖壁，其含水量均較低；pH值也較低，而氧化還原電位較高。同時(shí)發(fā)現(xiàn)窖池的窖壁含水量高于窖底；而窖底的pH略高，氧化還原電位較低，提高窖泥的pH值可能是緩解窖泥發(fā)生鈣化的一個(gè)途徑。因此結(jié)合生態(tài)釀酒的理念，提出采用添加產(chǎn)堿桿菌，從微生物的角度改善窖泥的鈣化現(xiàn)象。

2.1.2窖泥中金屬離子

由于鈣化窖泥的主要成分是乳酸鈣及乳酸鐵結(jié)晶[15]，因此鈣、鐵等金屬離子是導(dǎo)致鈣化的主要原因，也是需要重點(diǎn)考察的因素之一。本實(shí)驗(yàn)采集洋河和雙溝兩個(gè)基地的鈣化窖泥及未鈣化的窖泥進(jìn)行對(duì)比分析，結(jié)果如圖1所示。

圖1　不同窖泥中主要金屬離子含量的對(duì)比Fig.1　Comparison of main metal ions contents in different pit mud

由圖1可知，鈣化窖泥比無鈣化窖泥中的Ca、Mg、Fe等金屬離子含量高，且雙溝基地的窖泥含量均高于洋河基地。計(jì)算得到洋河基地中的鈣化窖泥中的鈣離子約為無鈣化窖泥的17倍、鎂離子約12倍、鐵離子約5倍；而雙溝基地的鈣化窖泥中的鈣離子約為無鈣化窖泥的26倍、鎂離子約23倍、鐵離子約101倍。結(jié)果表明，洋河基地中的鈣化窖泥主要是鈣離子，而雙溝基地的鈣化窖泥中，鐵離子的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他窖泥，且高于鈣離子的含量。

2.1.3鈣化和無鈣化窖泥中有機(jī)酸的對(duì)比分析

由于窖泥普遍為酸性，且形成的鈣化結(jié)晶主要為有機(jī)酸鹽類[8]，因此需要對(duì)窖泥中的有機(jī)酸進(jìn)行分析檢測(cè)，結(jié)果如圖2所示。

圖2　不同窖泥中的有機(jī)酸離子含量的對(duì)比Fig.2　Comparison of organic acid ions contents in different pit mud

由圖2可知，在各樣品中的乳酸含量較高，而鈣化樣品的乳酸含量更占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，同時(shí)存在一定量的乙酸。洋河基地的鈣化窖泥中的乳酸約為無鈣化窖泥的8倍；雙溝基地的為12倍。鈣化窖泥中乳酸大量增加，其含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了正常釀造體系中的乳酸含量，從而導(dǎo)致了鈣化現(xiàn)象的發(fā)生。因此若想緩解或解決鈣化的問題，需要一定程度上抑制有機(jī)酸產(chǎn)生菌，通過大量前期研究工作，本實(shí)驗(yàn)選取1%的酒花酸浸提液和5‰的Nisin進(jìn)行抑制有機(jī)酸產(chǎn)生菌的生長(zhǎng)。

2.2三種措施緩解窖泥鈣化的結(jié)果

由于雙溝窖泥鈣化較為嚴(yán)重，因此特地選取雙溝窖泥進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。通過對(duì)比實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組窖泥在水分含量、pH值、氧化還原電位、金屬離子、有機(jī)酸和酒醅的風(fēng)味物質(zhì)方面的差異，以此來判斷措施的可行性。

2.2.1三種緩解措施在水分含量、pH值和氧化還原電位的對(duì)比

對(duì)發(fā)酵40 d后的窖泥進(jìn)行了基本的指標(biāo)測(cè)定，具體結(jié)果見表3。

表3　窖泥的基本理化指標(biāo)Table 3　Basic physical and chemical indexes of pit mud

由表3可知，在發(fā)酵40 d后，經(jīng)過三種措施處理后，發(fā)現(xiàn)其能顯著緩解窖泥的pH值降低，氧化還原電位升高的問題。而含水量則基本不變，推測(cè)可能由于實(shí)驗(yàn)密封性較好，水分基本沒有揮發(fā)。而通過橫向?qū)Ρ龋l(fā)現(xiàn)加入酒花酸浸提液和Nisin的窖泥在pH和氧化還原電位效果較好，尤其是酒花酸浸提液。

2.2.2金屬離子含量的結(jié)果對(duì)比

通過對(duì)比分析窖泥中金屬離子含量，特別是鈣離子和鐵離子，可以大體的了解窖泥的鈣化狀況。ICP-MS法測(cè)量得到的窖泥中金屬離子含量結(jié)果見表4。

表4　窖泥中部分金屬離子的含量Table 4　Contents of partial metal ions in pit mudmg/g

由表4可知，在發(fā)酵過程中，Na+、Mg2+、Al3+、Ca2+、Fe3+和Zn2+，都有顯著的提高，特別是Ca2+和Zn2+，分別提高了大約10倍和40倍；而通過前面鈣化窖泥和非鈣化窖泥的對(duì)比分析，了解影響窖泥鈣化的主要金屬離子是Ca2+、Fe2+和Mg2+，因此主要對(duì)這三種離子進(jìn)行了分析，結(jié)果見圖3。

圖3　窖泥中3種金屬離子含量對(duì)比圖Fig.3　Comparison of 3 metal ions contents in pit mud

由圖3可知，窖泥中加入產(chǎn)堿菌、酒花酸和Nisin，都能夠有效降低窖泥中Ca2+、Fe3+和Mg2+，特別是加入產(chǎn)堿菌后；與對(duì)照組相比，其Ca2+降低了26.1%，F(xiàn)e3+降低了15.1%，Mg2+降低了12.8%。通過采取的三種措施，能夠解決窖泥鈣化過程中金屬離子含量增多的問題，從而緩解了窖泥的鈣化；其中，效果最明顯的是加入產(chǎn)堿菌，這可能是由于升高了窖池的pH，減少了Ca2+、Fe3+等金屬離子形成乳酸鈣、乳酸鐵等沉淀的量。

2.2.3有機(jī)酸含量的結(jié)果對(duì)比

前期工作發(fā)現(xiàn)鈣化窖泥中乳酸根離子含量極高，因此在采取三種緩解措施后，本實(shí)驗(yàn)針對(duì)有機(jī)酸根離子，特別是乳酸根離子進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果見表5。

表5　窖泥中各種有機(jī)酸的含量對(duì)比Table 5　Comparison of various organic acids contents in pit mud mg/g

由表5可知，在初始窖泥中，各種有機(jī)酸都是比較均勻，但是在經(jīng)過發(fā)酵后，可以看出己酸、乙酸和丙酮酸都有所下降，特別是己酸，而乳酸則含量大增。雖然發(fā)酵后的乳酸大量增加，但經(jīng)過三種措施處理后，其乳酸含量有著明顯的降低。在窖泥中加入產(chǎn)堿菌、酒花酸浸提液和Nisin處理后，分別下降了63.2%、62.0%、96.1%。結(jié)果表明Nisin的效果最佳。推測(cè)產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因是窖泥中的乳酸鈣、乳酸鐵等沉淀量下降，進(jìn)而使乳酸含量降低，緩解窖泥的鈣化。

2.2.4酒醅中的風(fēng)味物質(zhì)對(duì)比

雖然采用三種措施可以一定程度上緩解窖泥的鈣化，但由于外源添加非釀酒物質(zhì)，需要針對(duì)這些措施是否會(huì)影響最終的酒質(zhì)進(jìn)行評(píng)估。經(jīng)過40 d的發(fā)酵，酒醅經(jīng)過蒸餾，氣相色譜分析，酒醅中風(fēng)味物質(zhì)檢測(cè)結(jié)果見表6。

表6　酒醅中各種風(fēng)味物質(zhì)的對(duì)比Table 6　Comparison of various flavor substances in fermented grains mg/100 mL

由表6可知，經(jīng)過三種措施的實(shí)施后，酒醅中的風(fēng)味物質(zhì)有所改變，酒醅中的己酸乙酯均有了顯著提高，乙酸乙酯也有所提高，乳酸乙酯有所下降。由于己酸乙酯是濃香型白酒中的主體呈香呈味物質(zhì)，己酸乙酯含量增加有助于提高濃香型白酒的特有香氣、口感，并且經(jīng)過專家鑒定酒質(zhì)更加醇厚、酯香更加突出。因此采取加入Nisin這種措施，對(duì)酒質(zhì)提升也是非常好的幫助。

3　結(jié)論

通過分析鈣化窖泥和非鈣化窖泥的理化性質(zhì)，總結(jié)窖泥鈣化產(chǎn)生的原因主要有以下幾點(diǎn)：含水量的降低、pH的降低、氧化還原電位的升高、金屬離子的升高（主要是Ca2+、Fe3+和Mg2+）、乳酸含量的升高。這幾個(gè)原因之間是相互聯(lián)系的，例如，由于鈣化窖泥中含有較多的Ca2+和乳酸跟離子，其在pH較低、水分含量降低的環(huán)境下，會(huì)結(jié)晶形成白色的乳酸鈣。因此，要解決窖泥的鈣化問題，必須綜合治理；不能單獨(dú)根據(jù)單一指標(biāo)來判斷某一項(xiàng)措施對(duì)窖泥鈣化問題緩解的成效。

經(jīng)過采取加入產(chǎn)堿菌、酒花酸浸提液和Nisin措施后，研究發(fā)現(xiàn)這幾種措施對(duì)于緩解窖泥鈣化均有所幫助，不同的措施側(cè)重點(diǎn)不同，例如，酒花酸浸提液對(duì)于緩解窖泥含水量降低、pH降低、氧化還原電位升高方面有著較好的效果；產(chǎn)堿菌對(duì)于降低金屬離子，特別是Ca2+方面有著顯著效果；Nisin對(duì)于緩解窖泥含水量降低、pH降低、氧化還原電位升高等方面均有顯著的效果。

總體來說，窖泥中添加Nisin的效果更佳，其不僅可以改善窖泥鈣化的問題，還可以提高濃香型白酒的品質(zhì)。

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Preliminary research on the calcification causes and mitigation measures of Luzhou-flavourBaijiupit mud

CHEN Bin1,YAN Yinzhuo1*,WANG Deliang1,CHEN Xiang2
(1.China National Research Institute of Food&Fermentation Industries,Beijing 100015,China; 2.Jiangsu Yanghe Distillery Co.,Ltd.,Suqian 223800,China)

Pit mud plays an important role in the quality of Luzhou-flavourBaijiu.However,at present,most manufactories find that the calcification of pit mud appears frequently,which directly influence the quality ofBaijiu.The physicochemical indexes of calcified pit mud and quality aged pit mud were compared.It was concluded that the main reasons of the pit mud calcification were low moisture content,low pH and other related factors, which might result in the formation of white crystal(calcium lactate and lactic acid,iron,etc)in pit mud to make it compacted,white patches appeared,and quality degraded.In order to alleviate the calcification of pit mud,three measures were carried out by addingAlcaligenessp.,hop α-acid extract liquid and Nisin in pit mud.The results showed that the all three measures could alleviate the calcification of pit mud,and adding Nisin had the optimal effects by comprehensive analysis.

pit mud;calcification;reason;mitigation measures

TS261.4

0254-5071（2016）10-0036-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.10.009

2016-07-19

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31401680）

陳彬（1990-），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称钒l(fā)酵。

閆寅卓（1986-），女，高級(jí)工程師，博士，研究方向?yàn)槭称钒l(fā)酵。