李蘭杰, 李緒文, 丁 健, 劉 迎, 吳 謙, 王曉中, 李 敏, 金永日

(1. 吉林大學(xué)化學(xué)學(xué)院, 長春 130012; 2. 吉林大學(xué)第四醫(yī)院, 長春 130013)

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超聲輔助結(jié)合離子液體雙水相提取-高效液相色譜法測定三七中5種稀有人參皂苷的含量

李蘭杰1, 李緒文1, 丁 健2, 劉 迎1, 吳 謙1, 王曉中1, 李 敏1, 金永日1

(1. 吉林大學(xué)化學(xué)學(xué)院, 長春 130012; 2. 吉林大學(xué)第四醫(yī)院, 長春 130013)

建立了超聲輔助結(jié)合離子液體雙水相提取-高效液相色譜法測定三七中5種稀有人參皂苷20(S)-Rg2, 20(S)-Rh1, Rk3, 20(S)-Rg3及Rk1含量的方法. 考察了影響提取率的多種因素并確立了最佳提取條件, 在該條件下, 5種稀有人參皂苷加樣回收率均在92.07%～110.55%之間, RSD值均<5.43%. 實驗結(jié)果表明, 該方法具有快速、 高效、 準(zhǔn)確且環(huán)保等優(yōu)點, 為中藥材及其制劑中微量化學(xué)成分的提取、 富集與分析提供了參考.

離子液體; 超聲輔助提取; 三七; 稀有人參皂苷

三七為五加科植物三七[Panax notoginseng (Burk.) F. H. Chen] 的干燥根和根莖, 具有散瘀止血、 消腫定痛等功效, 可用于治療咯血、 吐血、 衄血、 便血、 崩漏、 外傷出血和跌撲腫痛等癥[1]. 皂苷類化學(xué)成分是三七藥材中的主要有效成分. 迄今, 研究人員已從三七的不同部位分離并鑒定了 60余種皂苷類成分[2]. 這些皂苷類成分大多數(shù)為達(dá)瑪烷型人參皂苷, 主要有20(S)-原人參二醇型和20(S)-原人參三醇型. 此外, 三七中還含有與人參皂苷不同的獨特成分, 如三七皂苷R1, R2, R3, R4, R6, Fa, Fc和Fe等. 其中人參皂苷Rb1, Rb2, Rb3, Rc, Rd, Re和Rg1等在人參屬植物中含量較高, 因此稱為常見人參皂苷; 而一些人參皂苷如Rg2, Rh1, Rg3, Rg6, F4, Rk3, Rg5和Rk1等在人參屬植物中含量很低, 因此稱為稀有人參皂苷.

三七中皂苷類成分具有多種生物活性[3,4], 因此如何有效地從三七中提取、 檢測皂苷類化學(xué)成分對三七藥材的質(zhì)量控制及其新的醫(yī)藥應(yīng)用具有重要意義. 日前, 關(guān)于三七中常見人參皂苷和三七皂苷的提取和檢測的報道較多[5,6]. 因為稀有人參皂苷含量微少且高溫易導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)變化, 迄今尚未見三七藥材中稀有人參皂苷含量測定的報道. 研究表明, 稀有人參皂苷比常見人參皂苷具有更強(qiáng)的清除自由基[7～10]、 抗氧化以及抗癌活性[11～13].

本實驗前期考察了傳統(tǒng)的提取分離方法, 如回流法、 溶劑浸提法及滲濾法等提取與富集三七中稀有人參皂苷的效果, 發(fā)現(xiàn)這些方法存在目標(biāo)提取物回收率小、 富集倍數(shù)低和成本高的問題, 且易導(dǎo)致稀有人參皂苷化學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變. 因此, 有必要尋找提取率和富集倍數(shù)高并能防止在提取過程中稀有人參皂苷化學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化的新提取方法. 近年來, 已有采用離子液體雙水相提取技術(shù)提取天然產(chǎn)物中含量較高活性成分的報道[14～17], 結(jié)果證明其具有再現(xiàn)性好、 操作簡單、 溶劑量少、 提取條件溫和和耗能低等優(yōu)點.

本文采用超聲輔助結(jié)合離子液體雙水相提取技術(shù)作為樣品處理手段, 并采用高效液相色譜法測定了三七藥材中5種稀有人參皂苷20(S)-Rg2, 20(S)-Rh1, Rk3, 20(S)-Rg3及Rk1的含量, 通過考察影響提取率的主要因素, 確立了最佳提取條件, 為三七乃至其它中藥材中微量活性成分的分析提供了新思路.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

5種稀有人參皂苷20(S)-Rg2, 20(S)-Rh1, Rk3, 20(S)-Rg3和Rk1為本實驗室自制, 利用1H NMR與13C NMR確認(rèn)其化學(xué)結(jié)構(gòu), 經(jīng)高效液相色譜法檢測其純度均高于98%, 結(jié)構(gòu)見圖1. 實驗用3份三七樣品購自河北安國藥材市場, 經(jīng)吉林大學(xué)藥學(xué)院張靜敏教授鑒定其中2份為三七干燥根莖, 1份為三七筋條, 分別標(biāo)記為GJ-1, GJ-2和JT-1; 溴化1-丁基-3-甲基離子液體([Bmim]Br, 上海成捷化學(xué)有限公司); 磷酸氫二鉀(分析純, 西隴化工股份有限公司); 磷酸(分析純, 北京化工廠); 吐溫-20(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所); 乙腈(色譜純, Sigma-Aldrich 公司); 實驗用水為超純水.

Fig.1 Chemical structures of rare ginsenosides 20(S)-Rg2, 20(S)-Rh1, 20(S)-Rg3, Rk1 and Rk3

昆山KQ-250型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司); 飛鴿TDL80-2B和TGL-16G型臺式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠); HYQ-2121A型渦旋混勻器(上海睿玥實驗器材有限公司); Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm, 5μm)和Aglient 1200型高效液相色譜儀(HPLC), 配有DAD紫外檢測器(美國安捷倫公司).

1.2 實驗方法

稱取0.6 g三七粉末于10 mL離心管中, 加入5.0 mL水、 1.0 mL [Bmim]Br離子液體(準(zhǔn)確稱取11.92 g用水定容至25.00 mL)和0.1 mL吐溫-20, 渦旋混勻, 室溫下超聲20 min, 抽濾至10 mL離心管中, 加入7.0 g K2HPO4, 渦旋震蕩溶解, 在4000 r/min 轉(zhuǎn)速下離心5 min, 用微量注射器取20 μL上層離子液體, 注入高效液相色譜儀進(jìn)行測定, 平行測定3次.

高效液相色譜條件: 流動相為乙腈(A)和0.1%磷酸水溶液(B); 梯度條件: 0～10 min, 29% A, 10～25 min, 29%～40% A, 25～50 min, 40%～60% A, 50～60 min, 60%～75% A; 柱溫30 ℃, 流速0.8 mL/min, 檢測波長203 nm. 樣品及標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖見圖2.

Fig.2 Chromatograms of standards(a) and rhizome of Sanqi(GJ-1)(b)

2 結(jié)果與討論

2.1 雙水相體系的選擇

首先考察了多種離子液體([Bmim]BF4, [Hmim]BF4, [Omim]BF4, [Bmim]Br和[Hmim]Br)及無機(jī)鹽[K2HPO4, Na2HPO4, K3PO4, KCl, (NH4)2SO4和NaCl]的雙水相提取組合. 結(jié)果表明, [Bmim]BF4-(NH4)2SO4, [Bmim]Br-K2HPO4和[Hmim]Br-K2HPO4等體系可以形成雙水相, 但是[Hmim]Br-K2HPO4體系的離子液體相中無稀有人參皂苷, 而[Bmim]BF4-(NH4)2SO4體系由于(NH4)2SO4加入量過大造成pH值過低, 導(dǎo)致稀有皂苷結(jié)構(gòu)發(fā)生變化, 故實驗選擇[Bmim]Br-K2HPO4離子液體雙水相體系.

2.2 影響因素的考察

實驗考察了脫脂溶劑、 K2HPO4加入量、 料液比、 吐溫-20加入量、 超聲提取時間、 提取溫度及離心時間等因素對提取效率的影響.

2.2.1 脫脂溶劑的影響 三七藥材中脂類成分的存在會影響離子液體提取效率并容易造成色譜柱污染, 因此在離子液體提取前應(yīng)對三七粉末進(jìn)行脫脂處理. 實驗以20(S)-Rg2和20(S)-Rh1提取率的高低作為依據(jù), 考察了氯仿、 石油醚、 正己烷和環(huán)己烷4種脫脂溶劑的效果, 結(jié)果如圖 3所示. 可見, 使用氯仿作為脫脂溶劑時可明顯降低20(S)-Rh1的提取率; 使用正己烷和環(huán)己烷作為脫脂溶劑時2種目標(biāo)物提取率均略有下降; 使用石油醚作為脫脂溶劑時2種目標(biāo)物提取率均達(dá)最高, 故選擇石油醚作為脫脂溶劑.

Fig.3 Effects of different degreasants on the extraction efficiencyConditions: 1.00 mL ionic liquid, 5.0 mL water, 7.00 g K2HPO4, 0.60 g Sanqi, ultrasonic time was 20 min. Error bars represent SDs.

Fig.4 Effects of different amounts of K2HPO4 on the extraction efficiencyConditions: 1.00 mL ionic liquid, 5.0 mL water. Error bars represent SDs.

2.2.2 K2HPO4加入量的影響 在提取體系中加入K2HPO4直接影響離子液體雙水相比例, 其加入量對萃取效率影響很大. 實驗固定離子液體體積為1.0 mL, 水相體積為5.0 mL, 考察K2HPO4加入量為1.0～7.5 g時上層離子液體相的體積, 結(jié)果見圖4. 可見, K2HPO4加入量低于2.0 g時, 未形成雙水相體系; 當(dāng)K2HPO4加入量在2.0～6.5 g范圍內(nèi)時, 雙水相體系形成且上層離子液體相的體積逐漸增加; 當(dāng)K2HPO4加入量大于6.5 g時, 上層離子液體相的體積基本保持不變, 故選擇K2HPO4加入量為7.0 g.

2.2.3 料液比的影響 料液比(m/V, g/mL)是指三七粉末的質(zhì)量與離子液體的體積之比. 料液比的大小影響提取效率和富集倍數(shù), 料液比過大, 目標(biāo)皂苷提取不完全; 料液比過小, 富集倍數(shù)降低. 實驗固定離子液體體積為1.0 mL, 考察了三七粉末質(zhì)量為0.1～1.0 g時人參皂苷20(S)-Rg2和20(S)-Rh1的提取效率, 結(jié)果見圖 5. 可見, 當(dāng)三七粉末質(zhì)量為0.1～0.6 g時, 人參皂苷20(S)-Rg2和20(S)-Rh1的峰面積呈線性增長, 此時目標(biāo)皂苷提取完全; 當(dāng)三七粉末質(zhì)量為0.6～0.8 g時, 人參皂苷20(S)-Rg2和20(S)-Rh1峰面積的增長趨勢減緩; 當(dāng)三七粉末質(zhì)量大于0.8 g時, 人參皂苷20(S)-Rg2和20(S)-Rh1的峰面積反而呈明顯下降趨勢, 表明料液比過大時, 目標(biāo)皂苷提取不完全; 當(dāng)料液比為0.6/1.0時富集倍數(shù)最高, 故選擇0.6/1.0作為最佳料液比.

Fig.5 Effects of different amounts of Sanqi on the extraction efficiencies of 20(S)-Rg2(a) and 20(S)-Rh1(b)The degreasant was petroleum ether. Conditions: 1.00 mL ionic liquid, 5.0 mL water, 7.00 g K2HPO4, ultrasonic time was 20 min. Each data point represents two analytes.

Fig.6 Effects of the ultrasonic treatment time on the extraction efficiencies of 20(S)-Rg2(a) and 20(S)-Rh1(b)The degreasant was petroleum ether. Conditions: 1.00 mL ionic liquid. 5.0 mL water, 7.00 g K2HPO4, 0.60 g Sanqi. Each data point represents two analytes. Error bars represent SDs.

2.2.4 吐溫-20加入量的影響 吐溫-20是一種非離子表面活性劑, 它的加入能夠消除離子液體雙水相形成過程中出現(xiàn)的乳化現(xiàn)象. 實驗在0.01～0.2 mL范圍內(nèi)對吐溫-20的加入量進(jìn)行了考察. 結(jié)果表明, 當(dāng)吐溫-20加入量為0.1 mL時, 雙水相體系界面乳化層消失并保持清晰穩(wěn)定. 故選擇0.1 mL作為吐溫-20的最佳加入量.

2.2.5 超聲提取時間的影響 超聲提取時間能影響提取目標(biāo)物在細(xì)胞內(nèi)外的動態(tài)平衡, 時間過短會降低提取效率. 實驗考察了80 min內(nèi)超聲提取時間對人參皂苷20(S)-Rg2和20(S)-Rh1提取率的影響, 結(jié)果見圖 6. 可見, 在20 min內(nèi)超聲輔助可提高稀有人參皂苷20(S)-Rg2和20(S)-Rh1的提取率, 之后無明顯影響. 這是由于在20 min內(nèi)隨著提取時間的延長, 細(xì)胞內(nèi)的人參皂苷在超聲作用下大量溶出和擴(kuò)散, 所以提取率顯著提高; 當(dāng)提取時間大于20 min 時, 由于細(xì)胞內(nèi)外有效成分含量已達(dá)到動態(tài)平衡, 濃度差推動力幾乎為0, 所以提取率趨于平緩. 故選擇20 min作為最佳超聲提取時間.

2.2.6 提取溫度的影響 由于高溫下稀有人參皂苷20(S)-Rg2, 20(S)-Rh1, Rk3, 20(S)-Rg3和Rk1等化學(xué)結(jié)構(gòu)容易發(fā)生改變[18], 會影響實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性, 所以提取溫度選擇為室溫25 ℃.

2.2.7 離心時間的影響 為獲得一個清晰的雙水相體系界面, 在2～10 min范圍內(nèi)對離心時間進(jìn)行了考察. 結(jié)果表明, 離心時間超過5 min時可形成清晰穩(wěn)定的雙水相體系界面. 故選擇5 min作為最佳離心時間.

2.3 方法學(xué)考察

考察了該方法的線性關(guān)系、 日內(nèi)精密度、 日間精密度、 檢出限(S/N=3)和定量限(S/N=10), 實驗結(jié)果見表 1.

Table 1 Regression equations, LODs, LOQs, intra-day and inter-day precision

2.4 加標(biāo)回收率

準(zhǔn)確稱取0.6 g三七粉末于10 mL離心管中, 加入5.0 mL水、 1.0 mL [Bmim]Br離子液體(準(zhǔn)確稱取11.92 g用水定容至25.00 mL)和0.1 mL吐溫-20, 渦旋混勻, 在混合液中加入一定濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液, 按照實驗方法處理后注入高效液相色譜儀測定, 平行測定6次, 考察方法的加標(biāo)回收率, 結(jié)果列于表2. 結(jié)果表明, 5種稀有人參皂苷的加標(biāo)回收率在92.07%～110.55%之間, RSD值均小于5.43%, 表明本方法的回收率良好, 測定結(jié)果準(zhǔn)確.

Table 2 Recoveries of the analytes(N=6)

2.5 三七藥材中5種稀有人參皂苷含量的測定

測定了3份市售三七藥材中5種稀有人參皂苷的含量, 實驗結(jié)果列于表3. 結(jié)果表明, 3份三七藥材中5種稀有人參皂苷的含量差別不大.

Table 3 Contents(%) of the rare ginsenosides in Sanqi(N=6)

3 結(jié) 論

采用超聲輔助結(jié)合離子液體雙水相提取-高效液相色譜法測定了三七中5種稀有人參皂苷含量, 該方法具有快速、 高效、 準(zhǔn)確且環(huán)保等優(yōu)點, 為三七藥材質(zhì)量控制提供了新方法, 也為超聲輔助結(jié)合離子液體雙水相提取應(yīng)用于其它藥材中微量化學(xué)成分的分析提供了新思路.

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(Ed.: N, K)

? Supported by the Jilin Provincial Scientific and Technological Development Program, China(No.20140203005YY).

Ionic Liquid Surfactant-mediated Ultrasonic-assisted Extraction Coupled with HPLC for the Determination of Five Rare Ginsenosides in Panax notoginseng (Burk.) F. H. Chen?

LI Lanjie1, LI Xuwen1, DING Jian2, LIU Ying1, WU Qian1, WANG Xiaozhong1,LI Min1, JIN Yongri1*

(1. College of Chemistry, Jilin University, Changchun 130012, China; 2.The Fourth Hospital of Jilin University, Changchun 130013, China)

A method of ultrasonic-assisted ionic liquid-salt aqueous two-phase extraction coupled with high-performance liquid chromatography(HPLC) was developed for the determination of the contents of five rare ginsenosides[20(S)-Rg2, 20(S)-Rh1, Rk3, 20(S)-Rg3and Rk1] in Panax notoginseng(Burk.) F.H.Chen(Sanqi). The factors influencing the ultrasonic-assisted extraction were investigated in detail. Under the optimized conditions, satisfactory extraction efficiency was achieved with the recoveries ranging from 92.07% to 110.55%, and the RSDs were lower than 5.43%. The results showed that the method had the advantages of fast, efficient, accurate and environmental protection. It provided a strong basis for the extraction, enrichment and analysis of the trace bio-active chemical composition of the traditional Chinese medicine and its preparations.

Ionic liquid; Ultrasonic-assisted extraction; Panax notoginseng(Burk.) F.H.Chen; Rare ginsenoside

10.7503/cjcu20150703

2015-09-09.

日期: 2016-01-24.

吉林省科技發(fā)展計劃項目(批準(zhǔn)號: 20140203005YY)資助.

O657.7

A

聯(lián)系人簡介: 金永日, 男, 博士, 教授, 博士生導(dǎo)師, 主要從事藥物分析研究. E-mail: jinyr@jlu.edu.cn