陳如敬，黃秋宇，修金生，吳學(xué)敏，嚴(yán) 山，車勇良，周倫江

（1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所 福建省畜禽疫病防治工程技術(shù)研究中心，福州 350013；2. 福建省龍巖市農(nóng)業(yè)學(xué)校，龍巖 364000；3. 福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，福州 350002）

·研究論文·

豬細(xì)環(huán)病毒k2型SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的建立

陳如敬1，黃秋宇2，修金生3，吳學(xué)敏1，嚴(yán) 山1，車勇良1，周倫江1

（1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所 福建省畜禽疫病防治工程技術(shù)研究中心，福州 350013；2. 福建省龍巖市農(nóng)業(yè)學(xué)校，龍巖 364000；3. 福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，福州 350002）

為建立檢測豬細(xì)環(huán)病毒k2型（Porcine Torque teno sus virus k2，PTTSuVk2）SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，本研究根據(jù)PTTSuVk2 ORF2基因序列特征設(shè)計(jì)引物，建立基于SYBR GreenⅠ檢測PTTSuVk2的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，該方法在PTTSuVk2 ORF2基因含量為1.92×102～ 1.92×107copies/μL反應(yīng)范圍內(nèi)有很好的線性關(guān)系。擴(kuò)增產(chǎn)物溶解曲線分析僅出現(xiàn)單一特異峰，無引物二聚體，Tm值為（83.83±0.08）℃，對(duì)豬圓環(huán)病毒（Porcine circovirus type 1 and type 2，PCV1和PCV2）、豬細(xì)小病毒（Porcine parvovirus，PPV）、豬博卡病毒5型（Porcine bovavirus type 5，PboV5）、豬細(xì)環(huán)病毒1a型（PTTSuV 1a）和1b型（PTTSuV 1b）核酸均無陽性信號(hào)擴(kuò)增，可重復(fù)性好，組內(nèi)變異系數(shù)為0.39%～1.69%，組間變異系數(shù)0.69%～2.19%。本方法的建立可用于定量分析PTTSuVk2感染噬性組織器官和感染程度，為PTTSuVk2的流行病學(xué)研究及臨床診斷等提供了一種可靠的方法。

豬細(xì)環(huán)病毒k2型；ORF2基因；SYBR GreenⅠ；實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法

細(xì)環(huán)病毒科（Anelloviridae）目前有11個(gè)屬（Genera）[1]。豬細(xì)環(huán)病毒k2型（Porcine torque teno sus virus k2，PTTSuVk2）屬于細(xì)環(huán)病毒科、Kappa細(xì)環(huán)病毒屬，該屬目前只有一個(gè)代表種，為豬細(xì)環(huán)病毒2p株（GenBank登錄號(hào)：AY823991）[2,3]。豬細(xì)環(huán)病毒基因組與豬細(xì)環(huán)病毒1a型（PTTSuV 1a）和1b型（PTTSuV 1b）組成類似，均為無囊膜的單股環(huán)狀DNA病毒，病毒全基因組大小約2．8～3．0 kb，由5'端非翻譯區(qū)（untranslated region，UTR）、3'端非翻譯區(qū)（UTR）和兩個(gè)主要開發(fā)閱讀框（open reading frame，ORF）ORF1和ORF2組成，其ORF3由ORF2和ORF1剪切形成[4-8]。ORF2長度為68個(gè)氨基酸，推測編碼的蛋白具有酪氨酸磷酸酶的特征，但具體生物學(xué)功能還未明確。本研究根據(jù)豬細(xì)環(huán)病毒k2型ORF2基因片段特征設(shè)計(jì)引物，建立檢測豬細(xì)環(huán)病毒k2型SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法。

1　材料與方法

1.1 毒株 豬圓環(huán)病毒和豬細(xì)小病毒由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所豬病研究室（以下簡稱本研究室）分離鑒定保存；豬細(xì)環(huán)病毒病毒1a型和1b型、豬博卡病毒5型和豬細(xì)環(huán)病毒k2型核酸由本研究室鑒定并保存。

1.2 主要試劑 EasyPure Blood Genomic DNA Kit、TransStart Top Green qPCR SuperMix、2×TransTaq-T PCR SuperMix、Agarose、GelStain、Trans5αChemically Competent Cell購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；pMD18-T載體、DNA Marker購自寶生物工程（大連）有限公司；Plasmid Mini Kit I和Gel Extraction Kit購自O(shè)mega Bio-Tek公司中國總代理廣州飛揚(yáng)生物工程有限公司；熒光定量PCR管購自康寧生命科學(xué)（吳江）有限公司。

1.3 豬細(xì)環(huán)病毒k2型ORF2基因的克隆

1.3.1 ORF2全長基因引物設(shè)計(jì) 根據(jù)本研究室前期分子流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果，檢測到1份豬血清DNA中有豬細(xì)環(huán)病毒k2型陽性。根據(jù)豬細(xì)環(huán)病毒k2型 ORF2全長基因特征設(shè)計(jì)特異性引物。ORF2F：5'-AGTTACTGAGAGCGGAGTCAA -3'；ORF2R：5'-AACCAGTGTCCGTAGCTCAA -3'，目的片段大小約為373 bp，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3.2 ORF2全長基因的克隆 以鑒定的豬細(xì)環(huán)病毒k2型DNA為模板，對(duì)豬細(xì)環(huán)病毒k2型ORF2全長基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系（50 μL）：2×TransTaq-T PCR SuperMix 25 μL、上下游引物（20μm/mL）各1 μL、DNA模板1μL，補(bǔ)充滅菌去離子水至終濃度50 μL。反應(yīng)條件：95℃ 預(yù)變性 5 min后進(jìn)入循環(huán)，循環(huán)參數(shù)為94℃變性30 s、54℃退火30 s、72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)后，72℃延伸10 min。取PCR產(chǎn)物5 μL，在1．0 %瓊脂糖凝膠上電泳。將PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒切膠回收后與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，隨機(jī)選擇8個(gè)克隆用質(zhì)粒提取質(zhì)粒，用PCR方法鑒定重組質(zhì)粒，隨機(jī)選擇3份陽性重組質(zhì)粒送由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行序列測定。測序結(jié)果經(jīng)BLAST分析表明該陽性重組質(zhì)粒符合預(yù)期，即隨機(jī)選擇1份陽性質(zhì)粒作為實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的陽性標(biāo)準(zhǔn)品（T-ORF2）。

1.4 豬細(xì)環(huán)病毒k2型SYBR GreenⅠ 實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的建立

1.4.1 引物設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)1．3克隆測序結(jié)果結(jié)合GenBank登錄的豬細(xì)環(huán)病毒k2型ORF2全長基因特征，設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的特異性引物，利用BLAST進(jìn)行檢索，初步驗(yàn)證其特異性。ORF2-SYF：5'- GATTATTCTGCGGCTGTAAAG -3'；ORF2-SYR：5'- CATCTTCGTGTCGGTCTC -3'，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段長度為93 bp，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4.2 反應(yīng)條件的優(yōu)化 采用TransStart Top Green qPCR SuperMix推薦的20 μL反應(yīng)體系，以出現(xiàn)最高的熒光值（△Rn）、最小的Ct值以及在溶解曲線分析中不出現(xiàn)非特異性峰為指標(biāo)，對(duì)退火溫度（54℃～64℃）進(jìn)行優(yōu)化。

1.4.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 用紫外分光光度計(jì)測定陽性標(biāo)準(zhǔn)品T-ORF2含量，利用微量核酸測定儀測定質(zhì)粒濃度，計(jì)算DNA拷貝數(shù)，隨后將標(biāo)準(zhǔn)陽性樣本進(jìn)行連續(xù)10倍系列稀釋（10-2～10-7），以1．4．2優(yōu)化的條件進(jìn)行擴(kuò)增，以拷貝數(shù)為橫坐標(biāo)，以Ct值為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.4 特異性檢測 用1．4．2優(yōu)化的條件分別對(duì)豬圓環(huán)病毒（Porcine circovirus 1，PCV1）和（Porcine circovirus 2，PCV2）、豬細(xì)小病毒（Porcine parvovirus，PPV）、豬細(xì)環(huán)病毒病毒1a型（Porcine torque tenovirus 1，PTTSuV1）和1b型（Porcine torque tenovirus 2，PTTSuV2）和豬博卡病毒5型（Porcine bocavirus，PBoV5）進(jìn)行檢測，評(píng)價(jià)其特異性。

圖1　實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增動(dòng)力曲線Fig. 1 The dynamic curve for real time PCR

1.4.5 變異系數(shù)測定 對(duì)同一陽性標(biāo)準(zhǔn)品設(shè)3個(gè)重復(fù)管，用優(yōu)化的實(shí)時(shí)熒光定量PCR條件進(jìn)行對(duì)陽性標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測，評(píng)價(jià)其重復(fù)性，計(jì)算組內(nèi)變異系數(shù)；將該標(biāo)準(zhǔn)陽性樣本置于-20℃冰箱保存，分別于第2周、第4周和第6周后重檢，評(píng)價(jià)其再現(xiàn)性，計(jì)算其組間變異系數(shù)。

1.5 建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的初步應(yīng)用 將建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，對(duì)臨床送檢15份經(jīng)臨床診斷患豬斷奶后多系統(tǒng)衰弱綜合癥（postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS）仔豬血液，利用EasyPure Blood Genomic DNA Kit提取其DNA后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量檢測，并和常規(guī)PCR方法進(jìn)行比較。

2　結(jié)果

2.1 優(yōu)化的實(shí)時(shí)熒光定量PCR條件 優(yōu)化出的20 μL最佳反應(yīng)體系：TransStart Top Green qPCR SuperMix 10 μL、上下游引物（10 μmol/mL）各0．2 μL、模板2 μL、補(bǔ)充滅菌去離子水至20 μL。最佳反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2 min后進(jìn)入循環(huán)，95℃變性15 s、58℃延伸10 s、72℃退火15 s，共40個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后，制作溶解曲線。

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線 陽性標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線（圖1）和標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2）顯示，實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)豬細(xì)環(huán)病毒K2型為19．2 copies/μL反應(yīng)，并且在1．92×102～1．92×107copies/μL反應(yīng)范圍內(nèi)有很好的線性關(guān)系。所建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率為-3．459，Y軸截距31．86。相關(guān)系數(shù)為0．999，擴(kuò)增效率（R2）為99．8%。

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR溶解曲線分析 從溶解曲線分析可見，在Tm=（83．83±0．08）℃出現(xiàn)單一的特異性峰，無引物二聚體及非特異性產(chǎn)物（圖3）。

2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR特異性 實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)陽性標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)溶解曲線分析只有1個(gè)特異性峰，而豬圓環(huán)病毒（PCV1和PCV2）、豬細(xì)小病毒（PPV）、豬細(xì)環(huán)病毒1a型和1b、豬博卡病毒5型（PBoV5）基因組DNA均未檢測到陽性熒光信號(hào)（圖4），PCR產(chǎn)物經(jīng)常規(guī)電泳也未見條帶。

圖2　實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 2 The standard curve for real time PCR

圖3　實(shí)時(shí)熒光定量PCR溶解曲線的建立Fig. 3 The melting curve for real time PCR

圖4　實(shí)時(shí)熒光定量PCR特異性檢測結(jié)果Fig. 4 The specifi city test of real time PCR

2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR重復(fù)性與再現(xiàn)性 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測標(biāo)準(zhǔn)陽性樣品的組內(nèi)變異系數(shù)為0．39%～1．69%，組間變異系數(shù)0．69%～2．19%，見表1。

2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)臨床樣品的檢測 對(duì)臨床送檢15份經(jīng)臨床診斷患豬斷奶后多系統(tǒng)衰弱綜合癥（postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS）仔豬血液，利用EasyPure Blood Genomic DNA Kit提取其DNA后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量檢測，并和常規(guī)PCR方法進(jìn)行比較。結(jié)果可見，有2份樣品檢測陽性，常規(guī)PCR方法檢測也僅有2份陽性，符合率為100%。

表1　實(shí)時(shí)熒光定量PCR組內(nèi)和組間統(tǒng)計(jì)Table 1 The intra group and inter group statistics for real time PCR

3　討論

病毒的分離鑒定是研究新發(fā)傳染疫病的重要研究手段。目前尚無豬細(xì)環(huán)病毒病毒1a型和1b型以及豬細(xì)環(huán)病毒K2型成功培養(yǎng)的研究報(bào)道，這極大限制了對(duì)豬細(xì)環(huán)病毒的深入研究。關(guān)于豬群細(xì)環(huán)病毒感染的研究主要集中在分子流行病學(xué)調(diào)查和基因組結(jié)構(gòu)分析研究方面。豬群中的細(xì)環(huán)病毒可以經(jīng)過糞—口傳播、精液垂直傳播、疫苗傳播等[9-12]。此外，豬群細(xì)環(huán)病毒也和其他病毒混合感染[13-17]。

豬細(xì)環(huán)病毒k2型（PTTSuVk2）是ICTV根據(jù)豬群感染細(xì)環(huán)病毒的特征，并對(duì)其ORF1基因核苷酸序列進(jìn)行分析后，建議設(shè)立的一個(gè)新的屬：Kappa細(xì)環(huán)病毒屬[18]。目前，GenBank中關(guān)于豬群感染細(xì)環(huán)病毒的序列信息還比較雜亂無章，很多學(xué)者在上傳相關(guān)研究序列至GenBank時(shí)并未對(duì)豬細(xì)環(huán)病毒病毒1a型和1b型（PTTSuV1和PTTSuV2）感染還是豬細(xì)環(huán)病毒k2型（PTTSuVk2）感染加以明確，有不少上傳序列并未獲得完整的ORF-1序列，繪制遺傳進(jìn)化時(shí)可能導(dǎo)致錯(cuò)誤，對(duì)該病的研究造成極大困擾。

目前，檢測豬群感染細(xì)環(huán)病毒的手段較多，主要有PCR（多重PCR）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（SYBR GreenⅠ和TaqMan探針）、LAMP和DHPLC等[19,20]，但由于不同豬群感染細(xì)環(huán)病毒類型之間核苷酸差異較大，有部分文章發(fā)表時(shí)ICTV還未對(duì)豬群感染細(xì)環(huán)病毒類型進(jìn)行正確劃分，建議還是在先分型的基礎(chǔ)上再建立相應(yīng)的檢測方法，以免造成檢測結(jié)果的假陰性。本研究建立了針對(duì)豬細(xì)環(huán)病毒k2型ORF2基因基于SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法，該方法線性關(guān)系好、擴(kuò)增效率高；組內(nèi)和組間的變異系數(shù)?。ǚ謩e為0．39%～1．69%、0．69%～2．19%）；準(zhǔn)確性高，在1．92×102～1．92×107拷貝/反應(yīng)范圍主要內(nèi)有很好的線性關(guān)系；特異性強(qiáng)，對(duì)其他常見豬群DNA病毒病檢測結(jié)果均為陰性，可用于豬群PTTSuVk2的流行病學(xué)監(jiān)測和感染器官的定量分析，為豬細(xì)環(huán)病毒k2型的流行病學(xué)研究及臨床診斷等提供了一種可靠的方法。

[1] ICTV． Virus taxonomy:2015 release[EB/OL]． http: // ictvonline．org/virusTaxonomy．a(chǎn)sp

[2] Biagini P． Create genus Kappatorquevirus in the family Anelloviridae[J]． ICTV, 2010,005:a-dV．

[3] 王礞礞, 周艷君, 陳宗艷, 等． 我國豬群中TTV的鑒定及其分子流行病學(xué)分析[J]． 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2009, 31(10): 751-755．

[4] 劉建波, 劉長明． 豬細(xì)環(huán)病毒流行病學(xué)調(diào)查與遺傳變異研究進(jìn)展[J]． 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2012, 33(3): 89-93．

[5] Niel C, Diniz-Mendes L, Devalle S． Rolling-circle amplification of Torque teno virus (TTV) complete genomes from human and swine sera and identification of a novel swine TTV genogroup[J]． J Gen Virol, 2005, 86: 1343-1347．

[6] Huang Y, Ni Y, Dryman B, et al． Multiple infection of porcine Torque teno virus in a single pig and characterization of the full-length genomic sequences of four U．S． prototype PTTV strains: implication for genotyping of PTTV[J]． Virology, 2010, 396(2): 289-297．

[7] Cortey M, Macera L, Segalés J, et al． Genetic variability and phylogeny of Torque teno sus virus 1 (TTSuV1) and 2 (TTSuV2) based on complete genomes[J]． Vet Microbiol, 2011, 148(2-4): 125-131．

[8] Li K, Wang L, Wu Y, et al． Molecular detection and genomic characterization of Torque teno sus virus 1 and 2 from domestic pigs in central China [J]． Virus Genes, 2013, 46(3): 479-486．

[9] 翟少倫, 龍進(jìn)學(xué), 岳城, 等． 中國部分地區(qū)豬細(xì)環(huán)病毒1型和2型的分子檢測[J]． 微生物和感染, 2010, 5(2): 84-88

[10] Zhai S L, Long J X, Wei W K, et al． High prevalence of torque teno sus virus in China and genetic diversity ofthe 5' non-coding region [J]． Arch Virol, 2013, 158(7): 1567-73．

[11] Pozzuto T, Mueller B, Meehan B, et al． In utero transmission of porcine torque teno viruses[J]． Vet Microbiol, 2009, 137(3-4): 375-379．

[12] Martínez-Guinó L, Kekarainen T, Segalés J． Evidence of Torque teno virus (TTV) vertical transmission in swine [J]． Theriogenology, 2009, 71(9): 1390-1395．

[13] Aramouni M, Segalés J, Cortey M, et al． Age-related tissue distribution of swine Torque teno sus virus 1 and 2 [J]． Vet Microbiol, 2010, 146(3-4): 350-353．

[14] Nieto D, Aramouni M, Grau-Roma L, et al． Dynamics of Torque teno sus virus 1 (TTSuV1) and 2 (TTSuV2) DNA loads in serum of healthy and postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) affected pigs [J]． Vet Microbiol, 2011, 152(3-4): 284-190．

[15] 劉建波, 郭龍軍, 危艷武, 等． 豬輸血傳播病毒（TTV）與豬圓環(huán)病毒混合感染的檢測及TTV異常變異分析[J]．中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2011, 33(1): 6-10．

[16] 韋建興, 梁兆強(qiáng), 歐陽康, 等． 豬細(xì)環(huán)病毒的檢測及與多種病原混合感染的調(diào)查分析[J]． 中國畜牧獸醫(yī), 2013, 40(10): 197-202．

[17] 施研進(jìn), 王禮偉, 屈勇剛, 等． 新疆北疆地區(qū)豬Torque teno 病毒的PCR檢測和序列分析[J]． 中國人獸共患病學(xué)報(bào), 2014, 30(3): 255-254．

[18] Gallei A, Pesch S, Esking W, et al． Create genus Kappatorquevirus in the family Anelloviridae Porcine Torque teno virus: determination of viral genomic loads by genogroup-specific multiplex rt-PCR, detection of frequent multiple infections with genogroups 1 or 2, and establishment of viral full-length sequences[J]． Vet Microbiol, 2010, 143 (2-4): 202-212．

[19] 向海洋, 聶福平, 楊俊, 等． 豬細(xì)環(huán)病毒LAMP檢測方法的建立[J]． 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2013, 35(9): 747-751．

[20] 楊春華, 周延, 孫思揚(yáng), 等． 豬細(xì)環(huán)病毒PCR-DHPLC檢測技術(shù)的建立及應(yīng)用[J]． 中國獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2012, 43(9): 1422-1428．

DEVELOPMENT OF A SYBR GREENⅠ QUANTITATIVE REAL-TIME PCR METHOD FOR PORCINE TORQUE TENO SUS VIRUS K2

CHEN Ru-jing1, HUANG Qiu-yu2, XIU Jin-sheng3, WU Xue-min1, YAN Shan1, CHE Yong-liang1; ZHOU Lun-jiang1
(1. Fujian Animal Disease Control Technology Development Center, Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou 350013, China; 2. Fujian Longyan Agricultural School, Longyan 364000, China; 3. College of Animal Sciences, Fujian Agricultural and Forestry University, Fuzhou 350002, China)

In order to rapidly and quantitatively detect Porcine Torque teno sus virus k2 (PTTSuVk2) , a SYBR GreenⅠ-based quantitative real time PCR assay was developed using specifi cally paired primers targeting to the ORF2 gene of PTTSuVk2. The PCR assay was linear in the range of 1.92×102～1.92×107copies per microliter. A series of experiments were carried out to assess the sensitivity, specifi city and reproducibility of the method, followed by the intra-assay and inter-assay CVs for CT values obtained with the standard plasmids. The melting curve analysis using SYBR GreenⅠ dye showed one specifi c peak with a melting temperature (Tm) at (83.83±0.08) ℃ without primer-dimers peak. The intra-assay CVs were equal or less than 1.69 % and the inter-assay CVs were equal or less than 2.19 %. No cross-reaction occurred with nucleic acids extracted from Porcine circovirus (type 1 and type 2), Porcine parvovirus,Porcine bovavirus type 5 and Porcine torque teno virus 1a and 1b. The results demonstrated that the assay was specifi c and reproducible, suggesting the quantitative PCR might be used for rapid laboratory diagnosis and epidemiological investigation for PTTSuVk2.

Porcine Torque teno sus virus k2; ORF2 gene; SYBR Green I; real time PCR

S852.659.2

A

1674-6422（2016）05-0010-06

2016-01-21

福建省屬公益類科研專項(xiàng)（2014R1023-13、2015R1023-10）

陳如敬，男，碩士，主要從事動(dòng)物傳染病研究

周倫江，E-mail：lunjiang@163．com