柳旭偉，葛文霞，張文舉，楊力偉

（1.石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，石河子 832000；2.新疆農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院動物科技學(xué)院，昌吉 831100）

·綜述·

膠體金免疫層析技術(shù)及其在動物疾病診斷中的應(yīng)用

柳旭偉1,2，葛文霞1,2，張文舉1，楊力偉2

（1.石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，石河子 832000；2.新疆農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院動物科技學(xué)院，昌吉 831100）

膠體金免疫層析技術(shù)是一種新型的固相免疫標(biāo)記檢測技術(shù)，因其生產(chǎn)成本低、操作簡單、檢測范圍廣、安全性好等諸多優(yōu)點，使其在動物疾病診斷、早孕檢測、藥物殘留和重金屬檢測等方面被廣泛應(yīng)用。近年來，國內(nèi)外學(xué)者多膠體金免疫層析技術(shù)的研究越來越多，文章就膠體金免疫層析技術(shù)的原理、分類、特點以及在動物疾病診斷中的應(yīng)用的最新研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，分析了其存在的缺點以及未來的發(fā)展方向等。

膠體金；免疫層析；動物疾?。辉\斷；應(yīng)用

膠體金免疫層析（colloidal gold immunochromatography assay，GICA）技術(shù)是以膠體金作為標(biāo)記物檢測特定抗體或抗原的一種新型的固相免疫標(biāo)記技術(shù)。GICA技術(shù)將膠體金標(biāo)記技術(shù)、免疫檢測技術(shù)和層析分析技術(shù)等多種檢測方法有機(jī)地結(jié)合在了一起，是繼熒光素、酶標(biāo)記和放射性同位素技術(shù)之后的又一重要的新型免疫標(biāo)記技術(shù)。目前，GICA技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于妊娠檢測、病原體抗體或抗原檢測、疾病相關(guān)的蛋白檢測等。雖然GICA技術(shù)在動物疾病診斷上的應(yīng)用起步較晚，但發(fā)展十分迅速，GICA技術(shù)已經(jīng)成為目前動物醫(yī)學(xué)快速檢測中最快速、敏感的免疫學(xué)檢測方法之一。由于該技術(shù)具有操作簡便、特異、靈敏和快速等優(yōu)點，因此特別適合廣大的基層獸醫(yī)人員使用，適用于大批量檢測以及大面積普查等，具有廣闊的應(yīng)用前景和巨大的發(fā)展?jié)摿Α１疚闹饕榻B了GICA技術(shù)的原理、分類、特點以及在動物疾病診斷中的應(yīng)用等。

1　GICA技術(shù)及其原理

1.1 膠體金 膠體金又叫金溶膠，是氯金酸在還原劑如硼氫化鈉、白磷、過氧化氫、乙醇、鞣酸、枸櫞酸鈉、抗壞血酸等的作用下，聚合成特定大小的金顆粒。金顆粒在堿性溶液中其表面帶有負(fù)電荷，金顆粒之間的靜電排斥力使在溶液中形成穩(wěn)定的膠體。如果溶液中存在較大的分子，比如蛋白質(zhì)分子時，蛋白質(zhì)分子表面的正電荷就會與金顆粒表面的負(fù)電荷結(jié)合，蛋白質(zhì)分子上就會吸附金顆粒，并且蛋白質(zhì)的生物活性依然不會受到影響[1]。膠體金溶液會隨著溶液濃度的升高其顏色將由桔紅色變?yōu)樽霞t色。正是由于膠體金具有化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、能夠吸附以及顏色變化的特性，使得膠體金具備了成為檢測標(biāo)記物的特點。

1.2 膠體金免疫技術(shù) 膠體金免疫技術(shù)是以膠體金作為檢測標(biāo)記物，應(yīng)用于抗原抗體反應(yīng)的一種新型免疫檢測技術(shù)。主要利用了金顆粒的高電子、高密度特性，在顯微鏡下可見金標(biāo)蛋白結(jié)合處有黑褐色的顆粒，當(dāng)這些標(biāo)記物大量聚集在相應(yīng)的配體處時，呈現(xiàn)出肉眼可見的粉紅色或紅色斑點，因而被用于定性或半定量的快速免疫檢測中。

1.3 膠體金免疫層析技術(shù) GICA技術(shù)是將膠體金標(biāo)記技術(shù)、免疫檢測技術(shù)以及層析分析技術(shù)等多種檢測方法有機(jī)結(jié)合在一起的一種固相標(biāo)記免疫檢測技術(shù)。其原理是以條狀纖維層析材料為固相，將已知的特異性抗原（或抗體）固定于膜的某一區(qū)帶（檢測帶），膠體金標(biāo)記物干燥在玻璃纖維的結(jié)合釋放墊上，一端與膜相連，另一端與樣品墊相連，膜的另一端連有吸水墊[2]。檢測時，在樣品墊處加入待檢樣品（血清、全血、尿或其它體液）后，樣品將沿層析方向向前移動，樣品中的待檢物會與層析材料上針對該待檢物的受體（抗原或抗體）結(jié)合，發(fā)生高親和性和高特異性的免疫反應(yīng)。層析過程中，形成的免疫復(fù)合物將被截留或富集在檢測帶上，標(biāo)記物（膠體金）會呈現(xiàn)直觀的顯色試驗現(xiàn)象。若樣品中不含待檢物，則會同游離標(biāo)記物一起到達(dá)控制線（圖1）[3-5]。

圖1　膠體金免疫層析試紙條構(gòu)造圖Fig. 1 Construction of colloidal gold immunochromatography assay test paper

2　GICA技術(shù)的分類

GICA技術(shù)既可以檢測抗原又可以檢測抗體，主要有：間接法、競爭法和夾心法，其中夾心法又分為雙抗原夾心法和雙抗體夾心法。

2.1 間接法 間接法一般用于抗體的檢測，其膠體金墊用待測抗體的多克隆抗體進(jìn)行包被，檢測線（T線）用待測抗體的抗原蛋白進(jìn)行包被，控制線（C線）用金標(biāo)抗體的二抗進(jìn)行包被。如一個陽性樣本進(jìn)行檢測，樣品中的抗體先與膠體金墊中的多克隆抗體結(jié)合，經(jīng)過檢測線時與檢測線上包被的抗原蛋白結(jié)合并不斷累積膠體金并顯色。多余的金標(biāo)多克隆抗體繼續(xù)前行與質(zhì)控線上包被的金標(biāo)抗體的二抗結(jié)合，不斷累積并顯色。T線和C線均顯色為陽性，T線不顯色、C線顯色為陰性，T線和C線均不顯色為無效。

2.2 競爭法 競爭法經(jīng)常用來檢測小分子抗原，其膠體金墊上吸附的金標(biāo)抗原或抗體和待測物與檢測線（T線）上包被的抗體或抗原進(jìn)行競爭性結(jié)合。如一個陽性樣本進(jìn)行檢測，待測物中的抗體與檢測線包被的抗體可競爭性結(jié)合金標(biāo)抗原表面有限的抗原位點。隨著待測物的增多，待測物與金標(biāo)抗原結(jié)合越多，便導(dǎo)致檢測線上包被的抗體無法和金標(biāo)抗原結(jié)合，則檢測線（T線）無法顯色。而質(zhì)控線（C線）上的二抗與抗原卻不存在競爭關(guān)系，金標(biāo)抗原層析到質(zhì)控線時與二抗結(jié)合并不斷累積而顯色。與間接法結(jié)果不同的是，T線和C線均顯色為陰性，T線不顯色、C線顯色為陽性，T線和C線均不顯色為無效。

2.3 雙抗體夾心法 常用來檢測抗原樣本，膠體金墊用待測物的單克隆抗體包被，檢測線（T線）用針對待測物另一位點的單克隆抗體包被，控制線（C線）用金標(biāo)抗體的二抗進(jìn)行包被。如一個陽性樣本進(jìn)行檢測，待測物同時與金標(biāo)抗體和檢測線單抗結(jié)合形成一個雙抗體夾心待測物（抗原）的大分子，這個大分子在檢測線上聚集并顯色，多余的金標(biāo)抗體繼續(xù)層析至控制線并與其包被的二抗結(jié)合而顯色。T線和C線均顯色為陽性，T線不顯色、C線顯色為陰性，T線和C線均不顯色為無效。

雙抗原夾心法與雙抗體夾心法的原理基本一致，只是膠體金墊和檢測線（T線）用已知的抗原進(jìn)行包被，主要用來進(jìn)行抗體的檢測。

3　GICA技術(shù)的特點

3.1 GICA技術(shù)的優(yōu)點

3.1.1 生產(chǎn)成本低 試紙結(jié)構(gòu)較為簡單，耗材和生產(chǎn)設(shè)備等成本較低，相對易于制造和大批量生產(chǎn)，生產(chǎn)成本低。

3.1.2 操作簡單 GICA技術(shù)檢測樣本不需要特殊處理，不需要特殊儀器設(shè)備，操作簡單，可用肉眼直接判斷檢測結(jié)果，基層工作人員均可操作。

3.1.3 檢測范圍廣 GICA技術(shù)可用于抗原和抗體的檢測，目前被廣泛應(yīng)用于妊娠檢測、病原體抗體或抗原檢測、疾病相關(guān)的蛋白檢測等，可檢測全血、血漿、血清、唾液、尿、體液等樣品。

3.1.4 靈敏快速 應(yīng)用高質(zhì)量的單克隆抗體，檢測分析下限可達(dá)到10 pg，靈敏度可以超過ELISA。一般情況下，應(yīng)用PCR技術(shù)檢測需3～4 h，ELISA需1～2 h才能出結(jié)果，而GICA技術(shù)一般只需5～10 min，檢測時間大大減少，是目前其他檢測方法達(dá)不到的。

3.1.5 特異性高 一般用單克隆抗體標(biāo)記膠體金，對組織細(xì)胞的非特異性吸附作用較小，因此具有較高的特異性。

3.1.6 安全性好 與其他檢測方法相比，GICA技術(shù)沒有鄰苯二胺、放射性同位素等有害物質(zhì)，所以既不會污染環(huán)境，也不會污染操作人員的健康，安全性好。

3.1.7 穩(wěn)定方便 GICA試紙往往不需要冷藏，保質(zhì)期可達(dá)12～24個月。由于膠體金標(biāo)記蛋白質(zhì)是一個物理結(jié)合過程，結(jié)合十分牢固，極少引起蛋白質(zhì)生物活性的改變，所以試劑十分穩(wěn)定，不易受到外界溫度等環(huán)境因素的影響，可以隨身攜帶并隨時檢測，因而使用方便。

3.2 GICA技術(shù)的缺點 雖然GICA技術(shù)具有眾多的優(yōu)點，但是與其他檢測方法相比，仍然具有特異性和靈敏度低、假陽性和假陰性率高等缺點，還不能較好的實現(xiàn)定量檢測。

4　GICA技術(shù)在動物疾病診斷中的應(yīng)用

4.1 GICA技術(shù)在細(xì)菌性疾病診斷中的應(yīng)用

4.1.1 豬鏈球菌 Ju等[6]研制出了檢測豬2型鏈球菌的GICA試紙條，其靈敏度高達(dá)106CFU/mL，并與其他血清型（除SS1/2型以外）鏈球菌無交叉反應(yīng)，10 min即可檢測出結(jié)果。

4.1.2 沙門氏菌 Moongkarndi等[7]研制了快速檢測腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌的GICA試紙條，該試紙條能夠快速檢測培養(yǎng)基中的腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌，檢測靈敏度為106CFU/mL和104CFU/ mL。臨床檢測結(jié)果表明，該試紙條檢測腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌的敏感性分別為87．50%和98．89%。與商業(yè)化的檢測方法相比，特異性為100%，是首個能同時檢測兩種不同的沙門氏菌的膠體金方法，為養(yǎng)雞場以及其它肉制品進(jìn)行腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌的大批量檢測提供了一種快速、簡單、特異性高的檢測手段[8]。

4.1.3 野兔熱土拉桿菌 Kilic等[9]研制了檢測野兔熱土拉桿菌的GICA試紙條，該方法的特異性和敏感性分別為94．6%和99．3%，在檢測正常血清樣品，自身免疫性疾病及細(xì)菌、病毒和寄生蟲感染的血清學(xué)樣品時均無交叉反應(yīng)。

4.1.4 金黃色葡萄球菌 劉洪貴等[10]建立了一種雙抗體夾心法GICA試紙條用于金黃色葡萄球菌的快速檢測，結(jié)果表明，該試紙條的敏感性為104CFU/mL，與鏈球菌、大腸桿菌、巴氏桿菌、芽孢桿菌和李氏桿菌均無交叉反應(yīng)，特異性較好。布日額等[11]研制出了致奶牛乳腺炎的金黃色葡萄球菌GICA試紙條，檢測結(jié)果表明，該試紙條具有較好的敏感性、特異性和穩(wěn)定性。

4.1.5 大腸桿菌 高成秀[12]制備了大腸桿菌O157和Stx2雙抗體夾心試紙條，可同時檢測大腸桿菌O157抗原以及Stx2毒素，檢測結(jié)果表明，大腸桿菌O157試紙條的敏感性、特異性和重復(fù)性較好，但Stx2試紙條的重復(fù)性和陽性檢測率還有待進(jìn)一步的提高。孫洋等[13]以兔抗O157多克隆抗體包被于硝酸纖維素膜作為捕獲抗體，以腸出血性大腸埃希菌O157單克隆抗體為標(biāo)記探針，制成雙抗夾心O157GICA試紙條，該試紙條與其他菌株均不反應(yīng)，僅與O157反應(yīng)，特異性強、操作簡便、檢測速度快、敏感性高，可用于大量樣品的現(xiàn)場檢測。

4.1.6 結(jié)核分枝桿菌 Soo等[14]研制了檢測結(jié)核分枝桿菌的GICA試紙條，臨床試驗證實，該方法快速、簡便、具有良好的敏感性和特異性。馮向輝等[15]建立的了牛結(jié)核分枝桿菌GICA快速診斷法，所研制的試紙條不與牛巴貝斯病、牛副結(jié)核、牛傳染性鼻氣管炎病和口蹄疫陽性血清作用，具有較好的特異性。Wassie等[16]和Mduli等[17]建立了檢測人結(jié)核分枝桿菌的GICA快速診斷法，研制的試紙條具有較好的檢測效果。

4.1.7 布魯氏菌 朱明東等[18]所研制的診斷布魯菌病的GICA試紙條，通過采用不同血清的用量來確定試紙條的特異性和敏感性，特異性和敏感性分別達(dá)到97．3%和91．3%，具有特異、敏感、操作簡便、血清用量少等特點，更適合于布魯菌病的診斷、流行病學(xué)調(diào)查及現(xiàn)場應(yīng)用。

4.2 GICA技術(shù)在病毒性疾病診斷中的應(yīng)用

4.2.1 口蹄疫病毒 Jiang等[19]建立了檢測FMDV的雙抗體夾心GICA法，該方法的檢測靈敏度為11．7 ng/ mL，15 min即可得出結(jié)果。Yang等[20]還研制了一種基于合成肽技術(shù)的GICA試紙條，該試紙條能夠區(qū)別O型FMDV感染豬與疫苗免疫豬。蔣韜等[21]建立了檢測O型、A型和AsiaⅠ型FMDV的定型診斷GICA方法。林彤等[22]建立的AsiaⅠ型FMDV的膠體金試紙條，不與豬水皰病病毒以及FMDV的其他血清型發(fā)生交叉反應(yīng)，有較好的特異性，該試紙條與其他傳統(tǒng)診斷方法的符合率達(dá)98．8%。

4.2.2 豬圓環(huán)病毒 Jin等[23]采用重組核衣殼蛋白作為檢測抗原，建立了檢測豬圓環(huán)病毒2型的GICA方法，研究結(jié)果表明，該方法具有良好的敏感性和特異性。王慧杰等[24]用豬圓環(huán)病毒2型重組Cap蛋白，研制了檢測豬圓環(huán)病毒2型Cap抗體的GICA試紙條，檢測來自不同豬場的165份送檢血清，其結(jié)果與間接免疫熒光符合率在85%以上。

4.2.3 豬瘟病毒 Li等[25]用純化的嵌合蛋白（CnC2）為抗原建立了檢測豬瘟血清中豬瘟病毒疫苗抗體滴度的GICA試紙條，該試紙條與商業(yè)化的ELISA試劑盒的檢測符合率為93．5%，特異性和敏感性分別為100%和97%。鄭鳴等[26]用膠體金分別標(biāo)記豬瘟強毒和弱毒抗原，用雙抗原夾心法建立了區(qū)分豬瘟強毒和弱毒抗體的GICA試紙條，該方法特異性好、靈敏度高、操作簡單，能區(qū)分強毒和弱毒感染，適合豬瘟的臨床診斷。

4.2.4 輪狀病毒 劉兆磊等[27]研制的A群豬輪狀病毒GICA試紙條的最低檢測限為1:32稀釋的病毒培養(yǎng)液。該試紙條具有較好的特異性，與豬傳染性胃腸炎病毒和流行性腹瀉病毒無交叉反應(yīng)，且不同批次試紙條的重復(fù)檢測結(jié)果一致。

4.2.5 禽流感病毒 Cui等[28]研制出了檢測H5亞型禽流感病毒抗體的GICA試紙條，特異性和敏感性分別為97．6%和88．8%。彭伏虎等[29,30]在研制的H9亞型禽流感病毒GICA檢測方法的基礎(chǔ)上組裝了試劑盒，可在室溫下保存6個月，4℃保存12個月，在10 min內(nèi)即可準(zhǔn)確檢測出結(jié)果，準(zhǔn)確率可達(dá)到100%。徐一鳴等[31]建立了針對H3和H7亞型禽流感病毒的GICA試紙條，其與H5和H9亞型AIV標(biāo)準(zhǔn)抗原、病料以及新城疫抗原、傳染性支氣管炎均無交叉反應(yīng)，具有較好的特異性。

4.2.6 新城疫病毒 李希友等[32]用膠體金標(biāo)記NDV抗原，兔抗NDV抗體和NDV抗原分別包被到檢測線和質(zhì)控線上，研制出了半定量GICA試紙條用于快速測定新城疫抗體。

4.2.7 犬瘟熱病毒 Oh等[33]研制出了檢測犬瘟熱病毒抗體的GICA試紙條，通過386份臨床樣品檢測試驗，可知GICA相對于血凝抑制試驗的特異性為76．6%，敏感性為97．1%。

4.2.8狂犬病毒 Joon等[34]建立了GICA試紙條用于檢測偽狂犬病病毒，樣品僅需25 μL，5 min即可檢測出，與其他常見豬病無交叉反應(yīng)。

4.2.9 其它 近幾年，國內(nèi)外的學(xué)者還研制了一些檢測其它病毒的GICA試紙條。Kameyama等[35]研制了GICA試紙條用于快速檢測BVDV抗原。王翌等[36]建立了檢測鵝副粘病毒膠體金試紙條，該試紙條可以檢測出血凝價24以上的鵝副粘病毒尿囊液。Sheng等[37]建立了檢測魚淋巴囊腫病毒GICA試紙條，其靈敏度為1 μg/mL，穩(wěn)定性也較好。

4.3 GICA技術(shù)在寄生蟲病診斷中的應(yīng)用

4.3.1 弓形蟲 卓國榮等[38]發(fā)明的檢測犬弓形蟲的GICA試紙條與IHA試劑盒的符合率為99%。檢測人工感染弓形蟲的犬血清，兩者符合率高達(dá)100%。

4.3.2 旋毛蟲 秦銀霞等[39]研制的免疫層析試紙條，通過檢測旋毛蟲患者以及旋毛蟲感染的大鼠、小鼠、豬和兔的陽性血清，除了小鼠的檢出率為97．87%外，其余均為100%。

4.3.3 豬帶絳蟲 張少華等[40]研制的檢測豬帶絳蟲GICA試紙條，以膠體金標(biāo)記豬帶絳蟲六鉤蚴TSOL18重組蛋白抗原，與全囊蟲抗原ELISA的相對特異性和敏感性分別為95．2%和75．0%，和剖檢計數(shù)法的相對敏感性為80．0%，并具有較好的穩(wěn)定性。

4.3.4 其他 近年來，國內(nèi)外的學(xué)者還研制了一些檢測諸如血吸蟲、新孢子蟲的GICA試紙條，并取得了較好的檢測結(jié)果，開始應(yīng)用于生產(chǎn)。

5　展望

GICA技術(shù)生產(chǎn)成本低、操作簡單、檢測范圍廣、安全性好等諸多優(yōu)點，使得該技術(shù)成為多種領(lǐng)域應(yīng)用與研究的熱點，相關(guān)研究不斷深化，檢測范圍不斷拓寬。國內(nèi)外學(xué)者一直在進(jìn)行GICA技術(shù)對動物疾病檢測的研究，使其成為得基層廣大獸醫(yī)工作利用一種可靠的技術(shù)手段，對動物疾病進(jìn)行快速診斷成為了可能。但是由于GICA技術(shù)存在諸多的不足，今后可在以下幾個方面需加強研究。

5.1 定量檢測 目前應(yīng)用于生產(chǎn)的GICA試紙條多數(shù)都用于進(jìn)行定性檢測，半定量檢測也只是少數(shù)幾種，主要通過肉眼觀察顏色的變化判定結(jié)果，初略檢測。但是定量檢測能夠給疾病的診斷帶來更多的幫助，所以加強對定量GICA試紙條的研究是未來的一個重要方向，具有十分重要的意義。

5.2 提高靈敏度 GICA技術(shù)同樣存在檢測的特異性和靈敏度低、假陽性和假陰性率高的問題，最終疾病的確診還需借助其它的診斷方法和手段，造成了診斷時間的延長和成本的增加，這給實際生產(chǎn)應(yīng)用中帶來了非常大的麻煩。因此，提高GICA試紙條的靈敏度也是將來研究的重點。

5.3 多樣本檢測 目前應(yīng)用于生產(chǎn)的GICA試紙條大多數(shù)只能檢測一個樣本，主要針對一種疾病，這樣會造成重復(fù)采樣、重復(fù)檢測，同時延長疾病診斷的時間，并增加檢測成本。研究可應(yīng)用于多種疾病的GICA試紙條也是未來的重要發(fā)展方向。

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APPLICATION OF COllOIDAL-GOLD IMMUNOCHROMATOGRAPHY ASSAY (GICA) TO DIAGNOSTICS OF ANIMAL DISEASES

LIU Xu-wei1,2, GE Wen-xia1,2, ZHANG Wen-ju1, YANG Li-wei2
(1.College of Animal Science and Technology, Shihezi University, Shihezi 832000, China; 2.College of Animal Science and Technology, Xinjiang Agricultural Vocational and Technical College, Changji 831100, China)

Colloidal gold immunochromatography assay (GICA) is a solid phase immune labeling technique. Because of its low production cost, simple operation, wide detection range and good safety, GICA has been widely used in the diagnosis of animal diseases, early pregnancy testing, drug residues and heavy metal detection. In recent years, domestic and foreign scholars have conducted a number of studies on the colloidal GICA technology. This article reviewed the principle, classifi cation, characteristics and latest research progress of colloidal GICA technology as well as its shortcomings and future study.

Colloidal gold; immunoassay; animal disease; diagnosis; application

S852.43

A

1674-6422（2016）05-0074-07

2015-12-24

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))專項經(jīng)費(201303062)；新疆農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院科研基金項目（XJNZYKJ2014006）

柳旭偉，男，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

葛文霞，E-mail：gewenx9260@163．com