黃 琪，汪 凱，涂 健，潘 玲，祁克宗，李澤君，陳鴻軍，劉紅梅

（1. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，合肥 230036；2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

·研究論文·

雞SP-A在293T細(xì)胞中的表達(dá)及免疫學(xué)檢測(cè)

黃 琪1,2，汪 凱1,2，涂 健1，潘 玲1，祁克宗1，李澤君2，陳鴻軍2，劉紅梅1

（1. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，合肥 230036；2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

為表達(dá)雞肺表面活性蛋白A（chicken palmonary surfactant protein A，cSP-A）基因，本研究擴(kuò)增去除終止子的cSP-A，通過(guò)Nhe I和Apa I雙酶切，連接進(jìn)入真核表達(dá)載體pcDNA3.1/myc-His(-)A中，構(gòu)建獲得重組載體pcSP-A；同時(shí)，將cSP-A和gfp基因按Nhe I-BamH I和BamH I-Apa I分別連接至pcDNA3.1/myc-His(-)A載體中，構(gòu)建獲得融合表達(dá)載體pcSP-A-GFP。通過(guò)脂質(zhì)體法將這兩類(lèi)真核載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48 h 4%多聚甲醛固定細(xì)胞，利用cSP-A特異性鼠多抗進(jìn)行間接免疫熒光，于倒置熒光顯微鏡下觀(guān)察cSP-A表達(dá)和亞細(xì)胞定位情況，然后收獲細(xì)胞進(jìn)行Western blot檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，cSP-A在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，pcSP-A和pcSP-A-GFP融合蛋白的相對(duì)分子量分別約為30 kDa和55 kDa。上述研究結(jié)果為進(jìn)一步研究cSP-A的功能奠定了基礎(chǔ)。

雞肺表面活性蛋白A；真核表達(dá)；檢測(cè)

先天性免疫防御系統(tǒng)是機(jī)體抵抗病原體入侵的第一道防線(xiàn)。先天性免疫反應(yīng)的主要特征為細(xì)胞吞噬、溶菌作用、免疫調(diào)節(jié)以及模式識(shí)別[1]。凝集素屬于可溶性的模式識(shí)別受體，存在于動(dòng)物不同的組織中，與不同的微生物表面的多糖相互作用。雞肺表面活性蛋白A（chicken surfactant protein-A，cSP-A）是雞肺泡上皮分泌的一種親水性糖蛋白。與大多數(shù)哺乳動(dòng)物相似，成熟的cSP-A單體從N端到C端依次為5個(gè)結(jié)構(gòu)域：短的N-端區(qū)、N-末端膠原樣結(jié)構(gòu)域（collagen-like region，CLR）、未知區(qū)、莖區(qū)和C-末端的凝集素糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域（carbohydrate-recognition domain，CRD），屬于鈣依賴(lài)型凝集素（C-type lectin）[2]。研究表明，哺乳動(dòng)物SP-A主要分布于呼吸道、消化道、腎臟、膀胱、睪丸，胸腺、脾臟等[3]。cSP-A蛋白的組織分布與哺乳動(dòng)物是否一致尚不清楚。SP-A能夠通過(guò)凝集或者聚合作用來(lái)刺激吞噬細(xì)胞進(jìn)行清除或殺死多種病原微生物[4]。Reemers等[5]發(fā)現(xiàn)禽流感病毒感染后，氣管中cSP-A的mRNA表達(dá)上調(diào)，在肺臟中表達(dá)下調(diào)，表明cSP-A可能在先天免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。

本研究室前期嘗試從雞肺臟灌洗液中提取并純化蛋白，但未得到高質(zhì)量的純化蛋白，且純化成本較高，原核表達(dá)產(chǎn)物也沒(méi)有明顯抑菌效果。為制備有生物活性的SP-A重組蛋白，本研究利用真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)cSP-A，以期為進(jìn)一步研究cSP-A功能與臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1 細(xì)胞、菌株及載體 HEK-293T細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存，用含10%胎牛血清的Opti-MEM培養(yǎng)基（購(gòu)自美國(guó)Gibco公司）培養(yǎng)；大腸桿菌工程菌DH5α感受態(tài)購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；pcDNA3．1/myc-His（-）A、pEGFP-C1載體由本實(shí)驗(yàn)室保存；pCold-cSP-A載體由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，將cSP-A基因克隆至原核表達(dá)pCold-TF載體（購(gòu)自大連寶生物公司）中。

1.2 試劑 凝膠回收試劑盒及質(zhì)粒小量和中量提取純化試劑盒購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司；T4 DNA連接酶、Nhe I、BamH I、Apa I等限制性?xún)?nèi)切酶購(gòu)自英國(guó)NEB公司；ECL顯色發(fā)光試劑盒購(gòu)自美國(guó)熱電公司；TransIT?-293轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Mirus公司；4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）購(gòu)自美國(guó)Molecular Probe公司。

1.3 抗體 HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；Fluor?594標(biāo)記羊抗鼠IgG（H+L）購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；利用pCold-cSP-A進(jìn)行原核表達(dá)，將純化產(chǎn)物作為免疫原，包裹弗氏佐劑經(jīng)腹腔注射6周齡Balb/c小鼠（100 μg/只），7 d后加強(qiáng)免疫1次，隨后再隔7 d后追加免疫純化抗原（100 μg/只），5 d后采集血液，分離血清備用。

1.4 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中雞SP-A基因核苷酸序列（登錄號(hào)：AF411083），利用Lasergene 10設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，同時(shí)在cSP-A的C端融合綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因，設(shè)計(jì)引物序列如下（表1），下劃線(xiàn)標(biāo)記的為酶切位點(diǎn)。

表1　本研究中引物設(shè)計(jì)Table 1 Primers for amplifi cation in this study

1.5cSP-A成熟肽PCR擴(kuò)增 以pCold-cSP-A質(zhì)粒為模板，以P1、P2引物和P1、P3引物，分別擴(kuò)增不同酶切位點(diǎn)的去除終止密碼子cSP-A基因片段cSP-A1和cSP-A2。熱循環(huán)條件：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性15 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行DNA電泳檢測(cè)，回收純化目的條帶，-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 pcSP-A真核表達(dá)載體構(gòu)建 對(duì)cSP-A1的PCR產(chǎn)物及pcDNA3．1/myc-His(-)A載體分別用限制性?xún)?nèi)切酶Nhe I和Apa I進(jìn)行雙酶切。膠回收目的基因片段，經(jīng)T4 DNA連接酶16℃過(guò)夜連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)菌DH5α，PCR鑒定為陽(yáng)性克隆后，送蘇州金唯智公司測(cè)序，測(cè)序正確的陽(yáng)性質(zhì)粒命名為pcSP-A。

1.7 pcSP-A-GFP真核表達(dá)載體構(gòu)建 用限制性?xún)?nèi)切酶Nhe I和Bam H I分別對(duì)cSP-A PCR產(chǎn)物及pcDNA3．1/ myc-His(-)A載體雙酶切，回收、連接、轉(zhuǎn)化，構(gòu)建pcSPA-NB重組載體；利用pEGFP-C1載體作為模板，擴(kuò)增GFP基因（gfp），將重組載體pcSP-ANB和gfp PCR產(chǎn)物分別用BamH I和Apa I雙酶切，回收、連接、轉(zhuǎn)化，挑取陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒，送蘇州金唯智公司測(cè)序，測(cè)序正確的陽(yáng)性質(zhì)粒命名為pcSPA-GFP。

1.8 重組真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞 用含10%小牛血清的Opti-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染前12 h消化細(xì)胞，接種至6孔板中。分別將1μg pcSP-A和pcSP-A-GFP，溶于500 μL無(wú)抗性無(wú)血清的Opti-MEM培養(yǎng)液中，加入2 μL TransIT?-293轉(zhuǎn)染試劑，振蕩混勻，室溫孵育30 min，加至6孔板，同時(shí)設(shè)空質(zhì)粒和pEGFP-C1做對(duì)照。37℃、5% CO2培養(yǎng)4～6 h后，更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.9 利用間接免疫熒光試驗(yàn)（indirect immunoflu orescence assay，IFA）進(jìn)行亞細(xì)胞定位 pcSP-AGFP和pcSP-A質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h后，4%多聚甲醛固定293T細(xì)胞10 min，用0．2% Triton X-100的PBS溶液滲透2 min，以1:100稀釋的cSP-A多抗為一抗，F(xiàn)luor?594標(biāo)記羊抗鼠IgG（H+L）（1:500）為二抗，同時(shí)用DAPI染細(xì)胞核，IFA檢測(cè)cSP-A的表達(dá)情況及亞細(xì)胞定位。

1.10 Western blot分析 分別收集轉(zhuǎn)染pcSP-A-GFP和pcSP-A質(zhì)粒的293T細(xì)胞及上清液，加入2×loading buffer，經(jīng)12% SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)印至NC膜；5%脫脂奶粉4℃封閉過(guò)夜，0．1mol/L TBST洗滌15 min后，以1:1000稀釋的抗cSP-A單抗為一抗，室溫孵育2～4 h；TBST洗膜3次，每次10 min，以1:5000稀釋的HPR標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗，室溫孵育1 h；TBST洗膜3次，每次10 min，用化學(xué)發(fā)光試劑盒（ECL）進(jìn)行顯色，在天能發(fā)光成像系統(tǒng)中成像分析。

2　結(jié)果

2.1 cSP-A蛋白真核表達(dá)載體構(gòu)建 以真核表達(dá)載體pcSP-A為模板，PCR擴(kuò)增均得到666 bp的目的條帶（圖1A），以真核表達(dá)載體pcSP-A-GFP為模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后也得到666 bp的目的條帶，與預(yù)期相符（圖1B）。測(cè)序結(jié)果表明cSP-A真核表達(dá)載體構(gòu)建成功。

2.2 SP-A基因在293T細(xì)胞中的表達(dá)及亞細(xì)胞定位pEGFP-C1空載體和pcSP-A-GFP重組質(zhì)粒同樣條件轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24～48 h，熒光倒置顯微鏡下進(jìn)行觀(guān)察可見(jiàn)綠色熒光主要分布在細(xì)胞質(zhì)中（圖2A），表明融合蛋白cSP-A-GFP已經(jīng)成功在293T細(xì)胞中獲得表達(dá)，且主要在細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜表面表達(dá)。用DAPI染細(xì)胞核，以cSP-A單抗為一抗進(jìn)行IFA檢測(cè)，結(jié)果與此相符，紅色熒光均在細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜表面（圖2B）。對(duì)熒光表達(dá)結(jié)果、IFA結(jié)果以及核染結(jié)果（圖2C）進(jìn)行Merge，結(jié)果如圖2D所示，而對(duì)照組中綠色熒光分布整個(gè)細(xì)胞（圖2E），且免疫組化沒(méi)有紅色熒光表達(dá)（圖2F）。同樣方法轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pcSP-A，IFA結(jié)果顯示紅色熒光也主要在細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜表面（圖3A，圖3B），而空質(zhì)粒pcDNA3．1（-）則無(wú)紅色熒光表達(dá)（圖3C，圖3D）。

2.3 Western blot分析 分別收集轉(zhuǎn)染pcSP-A-GFP和pcSP-A質(zhì)粒的細(xì)胞及上清，用抗cSP-A-CRD小鼠多抗血清進(jìn)行Western blot檢測(cè)。結(jié)果顯示細(xì)胞上清組沒(méi)有出現(xiàn)特異性條帶，而pcSP-A-GFP的細(xì)胞裂解產(chǎn)物在分子量約為55 kDa處出現(xiàn)特異性的雜交條帶（圖4），pcSPA的細(xì)胞裂解產(chǎn)物在分子量約為30 kDa處出現(xiàn)特異性的雜交條帶（圖4）。根據(jù)理論計(jì)算，cSP-A分子量約為24 kDa，由于它還有一個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)，所以Western blot顯示分子量大于其理論值。而空載體對(duì)照未見(jiàn)特異性條帶，表明cSP-A基因在293T細(xì)胞中表達(dá)。

圖1　cSP-A 基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig. 1 PCR analysis of cSP-A gene

圖2　pcSP-A-GFP重組質(zhì)粒的間接免疫熒光試驗(yàn)鑒定Fig. 2 Identifi cation of the pcSP-A-GFP recombinant plasmid by indirect immunofl uorescence assay（IFA）

圖3　pcSP-A重組質(zhì)粒的間接免疫熒光試驗(yàn)鑒定Fig. 3 Identifi cation of the pcSP-A recombinant plasmid by immunofl uorescence assay（IFA）

圖4　重組cSP-A蛋白的Western blot檢測(cè)Fig. 4 Detection of the recombinant cSP-A protein by Western blot analysis

3　討論

禽類(lèi)防御系統(tǒng)主要包括非特異性免疫反應(yīng)和特異性免疫反應(yīng)，特異性免疫反應(yīng)的建立需要一定的時(shí)間，因此，研究非特異性天然防御活性物質(zhì)對(duì)降低家禽的呼吸系統(tǒng)疾病有著重要意義。SP-A在肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白中含量最豐富。作為一類(lèi)天然免疫分子，SP-A依靠其CRD識(shí)別多種微生物糖基[6]，又借其CLR與吞噬細(xì)胞表明的ClqR結(jié)合，從而調(diào)理吞噬作用[7]，此外，SP-A的Neck區(qū)和CRD區(qū)可以識(shí)別流感病毒的血凝素，使流感病毒聚集，以降低其感染性[8]。

SP-A的來(lái)源主要是天然提取和基因工程合成。天然提取SP-A在結(jié)構(gòu)和活性的完整性方面優(yōu)于基因工程合成，由于取材困難，國(guó)外學(xué)者多采用maltose-agarose親和層析及Superose-6凝膠過(guò)濾[9]，而Superose-6凝膠過(guò)濾柱價(jià)格高昂，使天然提取方法的應(yīng)用受到限制，國(guó)內(nèi)目前尚無(wú)提取雞SP-A的文獻(xiàn)報(bào)道。有研究人員嘗試用原核表達(dá)系統(tǒng)，pCold-TF表達(dá)載體對(duì)cSP-A成熟肽進(jìn)行原核表達(dá)，得到高效表達(dá)的可溶性蛋白，但抑菌試驗(yàn)證明該蛋白并沒(méi)有明顯抑菌功能，這可能由于原核產(chǎn)物沒(méi)有天然蛋白的翻譯后修飾，也不能形成三聚體，從而不能發(fā)揮生物活性[10]。

為制備具有生物活性的SP-A重組蛋白，本研究構(gòu)建了pcSP-A-GFP重組真核表達(dá)載體，并在C端融合了His標(biāo)簽，以便于通過(guò)His-Bind瓊脂糖凝膠親和層析法從培養(yǎng)基中純化cSP-A重組蛋白。pcSP-AGFP載體表達(dá)的融合蛋白具有cSP-A和GFP的雙重特性，可用gfp作為報(bào)告基因觀(guān)察cSP-A的表達(dá)與定位?？紤]到GFP對(duì)cSP-A蛋白活性可能造成影響，同時(shí)構(gòu)建了pcSP-A載體。目前融合蛋白主要在細(xì)胞中表達(dá)，并沒(méi)有分泌到上清，下一步計(jì)劃構(gòu)建SP-A基因的真核分泌性表達(dá)載體pCD5-cSP-A，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行親合層析純化，利用純化的蛋白進(jìn)行病毒抑制試驗(yàn)在體內(nèi)外研究cSP-A的功能，為臟肺表面活性物質(zhì)制劑研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

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EUKARYOTIC EXPRESSION AND IMMUNOLOGICAL ASSAYS OF CHICKEN PULMONARY SURFACTANT PROTEIN A IN 293T CELLS

HUANG Qi1,2, WANG Kai1,2, TU Jian1, PAN Ling1, QI Ke-zong1, LI Ze-jun2, CHEN Hong-jun2, LIU Hong-mei1
(1. College of Animal Science and Technology, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China; 2. Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China)

Chicken pulmonary surfactant protein A (cSP-A) gene was amplifi ed without the stop codon and subcloned into pcDNA3.1/ myc-His (-) A vector with Nhe I and Apa I for expression in eukaryotic system. The resulting plasmid pcSPA was subsequently linked with the green fl uorescence protein (GFP) gene into pcDNA3.1/myc-His (-) A vector with Nhe I/BamH I and BamH I/Apa I sites to construct a recombinant eukaryotic expression vector pcSP-A-GFP. The pcSPA-GFP plasmids were then transfected into 293T cells by TransIT-293 reagent. The sublocalization of cSP-A protein was detected using indirect immunofl uorescence assay (IFA) with the specifi c antibody against cSP-A. The expressed fusion protein was identifi ed in Western blot. Expression of cSP-A was visualized in cytoplasms of the transfected 293T cells. The relative molecular mass of the fusion proteins pcSP-A-GFP and pcSP-A were about 55 kDa and 30 kDa, respectively. The biological activities of cSP-A expressed in the eukaryotic system will be investigated in the future study.

Chicken SP-A; eukaryotic expression; detection

S852.42

A

1674-6422（2016）05-0063-06

2016-03-07

安徽省自然科學(xué)基金（1408085MC49）

黃琪，女，碩士研究生，基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)專(zhuān)業(yè)

劉紅梅，E-mail：1030775529@qq．com；陳鴻軍，E-mail：vetchj@shvri．a(chǎn)c．cn