馬 立， 易小藝， 張壽春

(中南大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院， 長沙 410083)

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雙吡啶吡咯Cu(Ⅱ)配合物與DNA相互作用研究

馬 立， 易小藝， 張壽春*

(中南大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院， 長沙 410083)

合成了1種單核雙吡啶吡咯Cu(Ⅱ)配合物[Cu(PDPH)2] (1)，其中配體HPDPH為2，5-二(2′-吡啶基)吡咯.該配合物晶體屬于單斜晶系，空間群為C2/c，a=39.1242(16) ?，b=8.6574(5) ?，c=33.7687(14) ?，β=123.0305(16)°，中心離子Cu2+處于變形八面體配位環(huán)境.采用紫外-可見光譜、熒光光譜及圓二色譜等方法，分別研究了單核配合物[Cu(PDPH)2] (1)、雙核配合物[Cu2(PDPH)2(NO3)2] (2)和多聚配合物{[Cu2(PDPH)2(N3)2]}n(3)與DNA之間的相互作用.結(jié)果表明，3個Cu(Ⅱ)配合物均以溝面鍵合方式與CT-DNA結(jié)合，其結(jié)合強弱順序為3 > 2 > 1.此外，采用凝膠電泳法研究了3種Cu(Ⅱ)配合物對超螺旋pBR322 DNA的切割作用.結(jié)果表明，3種配合物均能將pBR322 DNA切割為開口缺刻型或者線型DNA，表現(xiàn)出良好的切割活性.

銅配合物； 雙吡啶吡咯配體； DNA鍵合； DNA切割

自上世紀(jì)70年代順鉑被發(fā)現(xiàn)具有抗腫瘤活性并成功應(yīng)用于臨床以來，小分子金屬配合物作為抗癌藥研究成為經(jīng)久不衰的熱門研究課題[1-2].DNA是生物的基本遺傳物質(zhì)和遺傳信息的載體，在前藥研究中，DNA常作為抗腫瘤藥、抗菌藥、抗病毒藥等研究的重要靶點.小分子過渡金屬配合物與DNA的相互作用研究是無機化學(xué)和生物學(xué)交叉的研究領(lǐng)域，通過它們相互作用研究有助于從分子水平上理解某些疾病的發(fā)病機理，也可以通過分子設(shè)計來尋找新的有效的治療藥物.

銅是人體一種必需的元素，在人體許多生理過程中發(fā)揮著重要作用.研究表明，許多銅配合物能夠與DNA之間發(fā)生鍵合，并能夠有效地切割DNA[3-7].研究表明，具有大環(huán)芳香結(jié)構(gòu)的配合物可以更好地插入DNA堿基對，從而使配合物與DNA的結(jié)合能力增強[8-9].本課題組報道了多種含大環(huán)芳香結(jié)構(gòu)配體菲咯啉或其衍生物的銅配合物具有很好的DNA結(jié)合能力與切割活性[10-12].此外，有課題組研究了系列三聯(lián)吡啶銅配合物(Cu-terpy)可通過嵌入或溝面鍵合的方式與DNA結(jié)合[13-15].

本文利用紫外-可見光譜、熒光光譜及圓二色譜等方法，考察了與三聯(lián)吡啶結(jié)構(gòu)相似的雙吡啶吡咯化合物為配體的幾種銅配合物與DNA之間的相互作用，并通過凝膠電泳法研究了配合物對超螺旋DNA的切割能力.

1 實驗部分

1.1試劑與儀器

小牛胸腺DNA(CT-DNA)、瓊脂糖(agarose)、溴化乙錠(EB)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)和抗壞血酸(H2A)均購自Sigma，超螺旋pBR322 DNA購自寶生物工程(大連)有限公司.其它試劑均為分析純，用前未作進(jìn)一步處理.紫外-可見光譜用UV-2450紫外-可見分光光度計測定，熒光光譜用Hitachi F4600熒光光譜儀測定，圓二色譜(CD)用Jasco J-815圓二色譜儀測定，凝膠電泳實驗用北京六一DYY6C電泳儀測定.

1.2配合物的合成

圖1 雙吡啶吡咯銅(Ⅱ)配合物1～3 的結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Structures of the dipyridylpyrrole copper(Ⅱ) complexes 1～3

配合物2和配合物3均根據(jù)本課題組以前發(fā)表的論文中的方法合成[18].

1.3晶體結(jié)構(gòu)測定

配合物1的晶體結(jié)構(gòu)是用Bruker SMART APEX 1000 CCD單晶衍射儀進(jìn)行測量.將測試樣品置于X射線單晶衍射儀上，使用石墨單色器單色化的Mo-Kα射線(λ=0.71073 ?)，在296 K的溫度下，掃描收集配合物的晶體衍射數(shù)據(jù).收集到的數(shù)據(jù)通過SAINT軟件處理，SADABS進(jìn)行吸收矯正處理，由SHELXTL-97軟件利用直接法解出，從而得到確定的晶體結(jié)構(gòu)，所有非氫原子坐標(biāo)通過各向異性參數(shù)確定，有機配體的氫原子位置使用理論加氫得到，配合物結(jié)構(gòu)的各向異性參數(shù)進(jìn)行全矩陣最小二乘法修正.配合物的詳細(xì)晶體學(xué)數(shù)據(jù)列于表1中.劍橋晶體數(shù)據(jù)中心(CCDC)數(shù)據(jù)編號：1474009.

表1 配合物[Cu(PDPH)2] (1)的晶體學(xué)數(shù)據(jù)

1.4配合物與DNA相互作用

1.4.1紫外-可見光譜 用pH 為7.2的5.0 mmol·L-1Tris-HCl/50 mmol·L-1NaCl 的緩沖溶液溶解一定量的CT-DNA，測定該DNA溶液的紫外吸收光譜，并計算其在260 nm和280 nm處的吸光度比值為1.82，表明該CT-DNA中不含蛋白質(zhì)[19].DNA溶液的濃度通過測定在260 nm處的吸光度來確定(DNA在260 nm處的摩爾吸光系數(shù)為6 600 L·mol-1·cm-1).配制3.0×10-5mol·L-1的3種銅(Ⅱ)配合物溶液，將DNA溶液按一定比例(r=0.00，0.05，0.10，0.15，0.20，0.25，0.30，0.35，r為DNA與配合物的物質(zhì)的量之比)加入其中，在紫外-可見分光光度計上測定配合物溶液的紫外-可見光譜變化.通過以下公式計算出配合物與DNA的結(jié)合常數(shù)Kb[20].

[DNA]/(εa-εf)=[DNA]/(εb-εf)+

1/kb(εb-εf)，

其中，εa表示配合物的表觀摩爾吸光系數(shù)，其值為Aobsd/ccomplex，εb表示配合物與DNA完全結(jié)合后的摩爾吸光系數(shù)，εf為純配合物的摩爾吸光系數(shù).以[DNA]/(εb-εf)對[DNA]作圖，得到的直線斜率和截距的比值即為結(jié)合常數(shù)Kb.1.4.2熒光光譜 用pH為7.2的5.0 mmol·L-1Tris-HCl/50 mmol·L-1NaCl 的緩沖溶液溶解配合物，配制成濃度為6.0×10-4mol·L-1的溶液，然后將配合物溶液慢慢滴加到含有1.0×10-5mol·L-1EB和1.0×10-4mol·L-1CT-DNA的混合溶液中，在室溫下，分別測定每次加樣后的熒光光譜(激發(fā)波長為530 nm，發(fā)射波長為600 nm).

1.4.3CD光譜 取3 mL 1.0×10-4mol·L-1的CT-DNA溶液，按r=0.00，0.05，0.10，0.15(r為配合物和DNA的物質(zhì)量之比)的比例分別加入一定量的3.0×10-5mol·L-1的配合物溶液，在圓二色譜儀上設(shè)定波長220～320 nm，掃描速度10 nm/min，數(shù)據(jù)記錄間隔0.1 nm，分別測定這幾組溶液的CD曲線，樣品測試前需要先拿Tris緩沖液作為參比液掃描基線.

1.4.4凝膠電泳實驗 將配合物按照不同的濃度與pBR322 DNA混合，然后在配好的樣品中分別加入1 μL抗壞血酸(H2A)，在37 ℃、pH為7.4條件下恒溫水浴1 h.加入2 μL的上樣緩沖液(30 mmol·L-1EDTA，36%丙三醇，0.05%溴酚藍(lán))終止反應(yīng).利用EB染色的1.0%瓊脂糖電泳分析切割結(jié)果.電泳液為TAE緩沖液(40 mol·L-1Tris-HAc/1 mmol·L-1EDTA )，電泳圖用UVP凝膠成像系統(tǒng)分析.

2 結(jié)果與討論

2.1晶體結(jié)構(gòu)

配合物[Cu(PDPH)2]的晶體結(jié)構(gòu)如圖2所示，其主要鍵長和鍵角列于表2.該配合物分子由1個金屬中心Cu2+離子和2個PDPH配體鍵合而成，Cu2+中心處于六配位的畸變八面體構(gòu)型的配位環(huán)境中，其中2個PDPH配體吡啶環(huán)上氮原子N(1)、N(3)、N(5)、N(6)位于赤道平面，鍵角分別為

N(3)-Cu(1)-N(1) (150.16(17)°)和N(6)-Cu(1)-N(5) (150.43(16)°)均小于180°，2個PDPH配體吡咯環(huán)上氮原子N(2)和N(4)占據(jù)2個極軸上的頂點，與中心原子Cu構(gòu)成的鍵角N(4)-Cu(1)-N(2)為176.5(2)°，也偏離180°，這與已經(jīng)報道的三聯(lián)吡啶銅配合物[Cu(terpy)2]2+的結(jié)構(gòu)非常相似[21].兩個吡咯N原子與中心Cu2+離子間的鍵長比四個吡啶N原子與中心Cu2+離子間的鍵長明顯更短，說明在該配合物中，中心Cu2+離子與吡咯N原子的相互作用能力強于吡啶N原子.

圖2 配合物[Cu(PDPH)2](1)的分子結(jié)構(gòu)圖(為清晰可見，分子中氫原子已被省略掉)Fig.2 The molecular structure of complex[Cu(PDPH)2] (1)

Cu(1)-N(1)2349(4)Cu(1)-N(2)1861(4)Cu(1)-N(3)2315(4)Cu(1)-N(4)1874(4)Cu(1)-N(5)2365(5)Cu(1)-N(6)2268(5)N(1)-Cu(1)-N(5)9028(15)N(2)-Cu(1)-N(1)7466(19)N(2)-Cu(1)-N(3)7554(19)N(2)-Cu(1)-N(4)1765(2)N(2)-Cu(1)-N(5)10913(18)N(2)-Cu(1)-N(6)10044(18)N(3)-Cu(1)-N(1)15016(17)N(3)-Cu(1)-N(5)9791(15)N(4)-Cu(1)-N(1)10704(18)N(4)-Cu(1)-N(3)10280(17)N(4)-Cu(1)-N(5)7404(19)N(4)-Cu(1)-N(6)764(2)N(6)-Cu(1)-N(1)9804(16)N(6)-Cu(1)-N(3)8888(15)N(6)-Cu(1)-N(5)15043(16)

2.2紫外-可見光譜

金屬配合物與DNA作用前后紫外-可見吸收譜帶的位置及強弱會發(fā)生一定程度的變化，不同的作用方式對應(yīng)著特定的譜帶變化規(guī)律，據(jù)此可以判斷二者的相互作用方式.研究表明，金屬配合物中加入DNA后，配合物與DNA分子發(fā)生嵌插作用會造成其紫外-可見光譜的吸收峰強度減小(減色效應(yīng))，且吸收峰位置顯著紅移[22-23].本實驗中的3個銅(Ⅱ)配合物中芳香環(huán)之間的π-π躍遷以及金屬中心與配體之間的電荷遷移躍遷能夠在紫外可見區(qū)域形成強烈的電子吸收譜帶.配合物與CT-DNA相互作用的紫外-可見光譜如圖3所示.隨著配合物中CT-DNA濃度的逐漸升高，配合物的吸收強度均逐漸減弱(減色效應(yīng)).配合物1～配合物3在388 nm處的減色率分別為20.48%，22.77%和27.31%，且未見明顯的紅移，說明該3個銅(Ⅱ)配合物不是通過經(jīng)典的插入方式與DNA發(fā)生相互作用.配合物1～配合物3與CT-DNA的結(jié)合常數(shù)Kb分別為4.8×104L·mol-1，5.01×104L·mol-1和5.61×104L·mol-1，均低于經(jīng)典插入試劑EB的結(jié)合常數(shù)1.0×106L·mol-1[24].說明3個銅(Ⅱ)配合物與DNA的鍵合作用較EB要弱，可能是通過非經(jīng)典嵌入方式，如溝槽鍵合等方式與DNA相互作用.根據(jù)鍵合常數(shù)(Kb)比較，3個配合物與DNA的作用強弱順序為3>2>1.

圖3 配合物1～配合物3在不同CT-DNA濃度下的紫外-可見光譜圖(圖中箭頭表示CT-DNA濃度逐漸增大時的吸光度的變化趨勢)Fig.3 UV-Vis absorption spectra of complex 1～ complex 3 in the absence (---) and presence (-) of increasing concentration of CT-DNA

2.3熒光光譜

進(jìn)一步通過熒光光譜法研究配合物與CT-DNA之間的相互作用及鍵合強弱.EB是研究小分子化合物與DNA相互作用最常用的熒光探針.DNA分子本身的熒光強度很弱，EB在溶液中的熒光強度也不高，但當(dāng)EB插入到DNA的堿基對之間后，其熒光強度大大增強；當(dāng)EB從DNA雙螺旋堿基對間出來時，熒光強度則顯著降低.因此，可以根據(jù)化合物對EB-DNA復(fù)合物熒光的影響來研究兩者間的相互作用.

配合物1～配合物3與DNA相互作用的熒光光譜如圖4所示.隨著配合物的不斷加入，EB-DNA復(fù)合物的熒光強度逐步減弱(熒光強度減弱率分別為18.35%，19.16%和23.66%)，表明這3個銅(Ⅱ)配合物與DNA有較弱的鍵合作用，并可能是通過溝槽模式與CT-DNA相結(jié)合[25].配合物作用在雙螺旋DNA的大溝或者小溝區(qū)，競爭了EB與DNA的結(jié)合，引起了DNA結(jié)構(gòu)微環(huán)境的變化，使得部分EB從DNA復(fù)合物中游離出來，從而引起其熒光強度的降低.配合物與DNA的結(jié)合強弱還可通過如下Stern-Volmer方程式，計算淬滅常數(shù)進(jìn)行比較[26].

I0/I=1+KSV.[Complex]，

其中，KSV為淬滅常數(shù)，I0/I為加入和未加入配合物時EB-DNA體系的熒光強度的比值，[Complex]為體系中配合物的濃度.以加入和未加入配合物時體系的熒光強度的比值I0/I為縱坐標(biāo)，[Complex]為橫坐標(biāo)，作出Stern-Volmer曲線，如圖4(d)所示，得到配合物1～配合物3的淬滅常數(shù)KSV分別為6 422，7 398和13 977 L·mol-1.淬滅常數(shù)的大小反映了配合物與DNA的結(jié)合能力，即淬滅常數(shù)越大，結(jié)合力越大.因此，3個銅(Ⅱ)配合物與DNA的結(jié)合能力的大小順序為3>2>1，該結(jié)論與紫外光譜所得結(jié)論一致.

圖4 EB-DNA體系在不同配合物濃度下的熒光光譜圖(圖中箭頭表示配合物濃度逐漸增大時的變化趨勢)(a～c)和配合物1～配合物3對EB-DNA 體系的熒光淬滅圖(d)Fig.4 (a～c)Fluorescence emission spectra of EB-DNA system in the absence (---) and presence (-) of increasing amounts of complex 1 ～ complex 3; (d) Fluorescence quenching of EB-DNA system by complex 1 ～ complex 3

2.4圓二色譜

將不同濃度的配合物溶液分別加入到CT-DNA溶液中，測量其圓二色譜(CD)的變化，其結(jié)果如圖5所示.隨著配合物濃度的增加，DNA的CD譜圖發(fā)生了明顯的變化.245 nm處的負(fù)峰與275 nm處的正峰的強度均有明顯的降低，但是沒有明顯的位移.說明銅(Ⅱ)配合物的加入使DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)部分被破壞，雙螺旋結(jié)構(gòu)變得松散.結(jié)果表明，銅(Ⅱ)配合物1～3對DNA均有鍵合作用.

2.5DNA切割活性

在pH 7.4和37 °C，并以抗壞血酸(H2A)還原劑條件下，配合物1～配合物3均可將超螺旋pBR322 DNA(Form I，I型)切割成缺刻型(Form Ⅱ，Ⅱ型)和線型(Form Ⅲ，Ⅲ型)DNA.隨著配合物濃度的增大，DNA的切割活性顯著增強，I型DNA逐漸減少甚至是最終完全轉(zhuǎn)變?yōu)棰蛐秃廷笮虳NA，其結(jié)果如圖6所示.配合物1當(dāng)濃度達(dá)到40 μmol·L-1時，開始有Ⅲ型DNA產(chǎn)生，濃度達(dá)到48 μmol·L-1時，Ⅱ型DNA和Ⅲ型DNA同時存在，而I型DNA基本消失.配合物2在32 μmol·L-1時開始出現(xiàn)Ⅲ型 DNA；當(dāng)濃度為40 μmol·L-1時，I型DNA完全變?yōu)棰蛐虳NA和Ⅲ型DNA.配合物3在28 μmol·L-1時開始出現(xiàn)Ⅲ型 DNA；當(dāng)濃度為32 μmol·L-1時，I型DNA即完全降解為Ⅱ型及Ⅲ型DNA；而當(dāng)其濃度增大到48 μmol·L-1或更大時，DNA已被切割成碎片.以上結(jié)果表明，配合物1～配合物3均有良好的DNA切割活性，且3個配合物的切割活性大小順序為3 > 2 > 1.與單核配合物1相比，雙核配合物2和多聚配合物3具有更強的DNA結(jié)合能力及更好的DNA切割活性，這可能歸因于在雙核及多聚配合物中，兩個或多個中心金屬離子之間存在協(xié)同效應(yīng)[27-28].一個配合物的金屬中心離子數(shù)目愈多，這種協(xié)同效應(yīng)可能愈明顯，從而可能呈現(xiàn)愈強的DNA結(jié)合能力及DNA切割活性.

圖5 CT-DNA在不同配合物濃度下的圓二色譜圖(圖中箭頭表示配合物濃度逐漸增大時的變化趨勢)Fig.5 CD spectra of CT-DNA in the absence (---) and presence (-) of increasing amounts of complex 1～ complex 3

(a) 泳道1，DNA；泳道2，DNA+H2A；泳道3，DNA+配合物1 (44 μmol·L-1)；泳道4～12，DNA+H2A+配合物1 (8，16，24，28，32，36，40，44，48 μmol·L-1)；(b) 泳道1，DNA；泳道2，DNA+H2A；泳道3，DNA+配合物2 (44 μmol·L-1)；泳道4～12，DNA+H2A+配合物2 (8，16，24，28，32，36，40，44，48μmol·L-1)；(c) 泳道1，DNA；泳道2，DNA+H2A；泳道3，DNA+配合物3 (44 μmol·L-1) ；泳道4～12，DNA+H2A+配合物3 (8，16，24，28，32，36，40，44，48 μmol·L-1).圖6 配合物(1～3)濃度對超螺旋pBR332DNA切割活性的影響Fig.6 Gel eletrophoresis diagram showing the cleavage of pBR322 DNA

3 結(jié)論

本文采用多種方法研究了3個不同雙吡啶吡咯Cu(Ⅱ)配合物與DNA之間的相互作用.光譜研究結(jié)果表明，配合物與CT-DNA相互作用的主要模式是溝槽結(jié)合，即配合物作用在雙螺旋DNA的大溝或者小溝區(qū)，引起DNA結(jié)構(gòu)微環(huán)境的變化，配合物與DNA作用的強弱順序3>2>1.3個配合物均能有效地切割超螺旋pBR322 DNA為缺刻型或者線型DNA，且隨著配合物濃度的增大，切割活性顯著增強.

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Interaction betweeen dipyridylpyrrole copper(Ⅱ) complexes and DNA

MA Li， YI Xiaoyi， ZHANG Shouchun

(School of Chemistry and Chemical Engineering， Central South University， Changsha 410083)

A new mononuclear copper complex， [Cu(PDPH)2](1) was synthesized and characterized. The complex was crystallized in a monoclinic system with space group C2/c，a=39.1242(16) ?，b=8.6574(5) ?，c=33.7687 (14) ?， β=123.0305(16)°. The interaction of [Cu(PDPH)2] (1)， dinuclear [Cu2(PDPH)2(NO3)2] (2) and polymer {[Cu2(PDPH)2(N3)2]}n(3) with CT-DNA was investigated respectively by UV-Vis absorption spectra， fluorescence spectra and circular dichroism (CD) spectra. The results indicated that these complexes bind to CT-DNA via groove binding mode， and the binding ability followed an order of 3 > 2 > 1. In addition， these copper(Ⅱ) complexes exhibited efficient DNA cleavage property and were able to promote the conversion of supercoiled DNA to nicked or linear form in the presence of ascorbate as a reducing agent.

copper(Ⅱ) complex; dipyridylpyrrole ligand; DNA-binding; DNA cleavage

2016-03-19.

國家自然科學(xué)基金項目(21571190).

1000-1190(2016)04-0551-08

O614.121

A

*通訊聯(lián)系人. E-mail: zhang_shch@sina.cn.