李思祺,李 姣,郭洪剛,戈 峰
(1.湖南人文科技學(xué)院 農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院,湖南 婁底 417000; 2.中國科學(xué)院 動物研究所,北京 100101)
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乙烯對番茄與煙粉虱互作的調(diào)節(jié)作用
李思祺1,李 姣1,郭洪剛2,戈 峰2
(1.湖南人文科技學(xué)院 農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院,湖南 婁底 417000; 2.中國科學(xué)院 動物研究所,北京 100101)
采取室內(nèi)測定與室外試驗相結(jié)合的方法,測定野生型AC及乙烯不敏感型NR不同品種的番茄上Q型煙粉虱種群數(shù)量及在接種與不接種Q型煙粉虱下植物信號途徑中乙烯途徑相關(guān)基因EFR1,ERF2,ETR1,ACO-1表達量、植物抗性物質(zhì)胼胝質(zhì)含量和植毛體表達基因表達量。結(jié)果表明,野生型AC及乙烯不敏感型NR兩個番茄品種未接種Q型煙粉虱的番茄乙烯途徑相關(guān)基因EFR1,ERF2,ETR1,ACO-1表達量、植物抗性物質(zhì)胼胝質(zhì)含量和植毛體表達基因表達量均顯著高于接種Q型煙粉虱的番茄;NR番茄的種群數(shù)顯著高于AC番茄,AC、NR兩個番茄品種外援噴施ACC的種群數(shù)均顯著低于未噴施的種群數(shù)。結(jié)果顯示,番茄產(chǎn)生乙烯對Q型煙粉虱種群的擴增有抑制作用,該抑制作用與乙烯產(chǎn)量正相關(guān);Q型煙粉虱可通過降低乙烯產(chǎn)量來增加種群適合度,即乙烯可以調(diào)節(jié)番茄與煙粉虱的相互作用關(guān)系。
乙烯;Q型煙粉虱;NR番茄;互作
煙粉虱為不完全變態(tài)昆蟲,目前全世界已知的煙粉虱生物型至少有24個,主要包括B型、Q型和非B/Q型;作物危害以B型煙粉虱危害為主,但由于Q型煙粉虱的耐藥性比其他生物型煙粉虱更強,在我國北方地區(qū)溫室中的Q型有取代B型煙粉虱的趨勢[1]。煙粉虱寄主植物范圍廣泛,蔬菜作物是其重要的寄主,但煙粉虱對寄主有一定的偏好性,煙粉虱成蟲喜歡在煙草上取食,卻更喜好在番茄上產(chǎn)卵[2]。我國煙粉虱危害逐年加重,給作物生產(chǎn)造成的經(jīng)濟損失巨大,尤其是2006—2010年中國部分地區(qū)爆發(fā)了TYLCV 病毒病,該病由煙粉虱傳播,導(dǎo)致我國番茄總產(chǎn)量下降甚至局部絕收[3-5]。目前該病已成為我國保護地番茄生產(chǎn)的頭號病害,每年的夏秋季是該病的高發(fā)期,全國多個地區(qū)都會爆發(fā)。
植物被昆蟲取食后會產(chǎn)生誘導(dǎo)型的防御反應(yīng),相應(yīng)的防御基因會發(fā)生相應(yīng)變化,導(dǎo)致昆蟲難以進一步取食。只有遇到機械損傷、病原菌侵染或植食性昆蟲取食等外界脅迫時才會開啟[6]。刺吸式昆蟲煙粉虱取食后會激活水楊酸和茉莉酸/乙烯途徑,在調(diào)控植物對逆境脅迫的響應(yīng)中這些激素作為信號分子起著極其重要的作用,植物在抵抗各種生物逆境時,SA、JA和ET等激素會大量合成,通過調(diào)節(jié)這些內(nèi)源激素含量水平、防御反應(yīng)基因的表達以及不同防御反應(yīng)信號途徑之間復(fù)雜的相互作用激活自身對各種病原菌和昆蟲侵染的防御反應(yīng)[7]。其中乙烯在植物的防御反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用,目前大量關(guān)于乙烯的研究在果實成熟及品質(zhì)方面,或是研究茉莉酸與乙烯交互作用對植物抗性的影響。一般而言,在植物應(yīng)對死體營養(yǎng)型病原菌和植食性昆蟲的反應(yīng)中JA和ET起重要作用[8]。例如,乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與擬南芥中病程相關(guān)蛋白(PR)基因的表達,并且與植物體內(nèi)的茉莉酸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在調(diào)控植物對病蟲的防御反應(yīng)中起協(xié)同或拮抗作用[9]。乙烯的產(chǎn)生也將會導(dǎo)致植物營養(yǎng)成分及理化性質(zhì)的改變。一般認為,乙烯利的誘導(dǎo)作用是其釋放內(nèi)源激發(fā)子乙烯產(chǎn)生誘導(dǎo)作用的結(jié)果。而乙烯利在一定的濃度范圍內(nèi),均能誘導(dǎo)大豆葉片內(nèi)防御蛋白如PAL活性、總多酚含量、總黃酮含量和幾丁質(zhì)酶活性的提高[10]。外用乙烯利處理可以降低擬南芥對埃及棉鈴蟲的抗性,但不降低對菱形蛾的抗性。在擬南芥 JA 和 ET 組成型激活突變體 cev1 上,桃蚜和B 型煙粉虱的種群增長速率明顯降低[9]。
煙粉虱是世界性大害蟲,它的傳播對農(nóng)作物的影響很大。其中Q型煙粉虱侵入我國后便迅速蔓延至我國北方許多地區(qū),且有替代其他生物型煙粉虱的趨勢。植物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在植物抗病蟲害及外界脅迫中起著重要作用,乙烯途徑作為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之一,其在植物抗蟲方面的作用相關(guān)研究較少。本研究以模式植物番茄的野生型AC及乙烯不敏感型NR為材料,研究乙烯調(diào)節(jié)番茄與Q型煙粉虱互作,其研究結(jié)果不但將有助于深入了解乙烯途徑在番茄與Q型煙粉虱互作中的作用,而且為Q型煙粉虱的防御提供理論依據(jù)。
(一)試驗材料
本試驗的室外試驗在北京市昌平區(qū)小湯山香屯村試驗基地的OTC(開頂式氣室)內(nèi)進行,室內(nèi)試驗在中國科學(xué)院動物研究所內(nèi)進行。試驗材料為乙烯不敏感型番茄NR,野生型番茄AC,用于本次試驗的Q型煙粉虱種群由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所張友軍研究員研究組提供。
(二)試驗設(shè)計
試驗在4個OTC內(nèi)進行。2015年5月29日將AC、NR番茄各30株移入4個OTC內(nèi)。6月12日接種Q型煙粉虱,每個OTC中AC,NR各接6株,每株20只。6月13日取接種24h和未接種番茄葉片樣品,做好標(biāo)記放置液氮中保存,用于胼胝質(zhì)含量,乙烯信號通路相關(guān)基因表達量的測定。6月23日給番茄接種Q型煙粉虱,每個OTC中AC,NR各接10株,每株10只。7月16日統(tǒng)計煙粉虱種群。8月25日移AC,NR各45株,每個品種15株用于外援噴施ACC(乙烯合成前體),15株用于外援噴施1-MCP(乙烯合成抑制劑)[11],15株用于外援噴施表面活性劑作為對照,對噴施番茄做上標(biāo)記,每隔3天噴施一次。8月26日給番茄接種Q型煙粉虱,每個OTC中AC,NR各接10株,每株10只。25天后統(tǒng)計煙粉虱種群。9月15日接種Q型煙粉虱,每個OTC中AC,NR兩個品種選ACC,1-MCP,CK各1株,每株接種20只。9月16日取接種24h和未接種番茄葉片樣品,做好標(biāo)記放置液氮中保存。繼續(xù)接種Q型煙粉虱,每個OTC中AC,NR兩個品種選ACC,1-MCP,CK各1株,每株接種20只。9月17日取接種24h和未接種番茄葉片樣品,做好標(biāo)記放置液氮中保存。繼續(xù)接種Q型煙粉虱,每個OTC中AC,NR兩個品種選ACC,1-MCP,CK各1株,每株接種20只。9月18日取接種24h和未接種番茄葉片樣品,做好標(biāo)記放置液氮中保存,用于植毛體合成基因,基因ERF1表達量的測定(圖1)。
圖1 試驗設(shè)計
(三)測定項目與方法
1.種群的測定
用自制適合大小的紗網(wǎng)用于套住接種的葉片,接種的Q型煙粉虱放入網(wǎng)后,25d后先觀察統(tǒng)計煙粉虱數(shù)目,再取網(wǎng)統(tǒng)計葉片上的產(chǎn)卵數(shù)。
2.外援噴施種群試驗
8月25日對噴施番茄做上1-MCP,ACC,NONE標(biāo)記每隔3天噴施1次,其中ACC濃度為50ppm、1-MCP濃度為1ppm。給番茄接種Q型煙粉虱,每個OTC中AC,NR各接10株,每株10只。25天后統(tǒng)計煙粉虱種群。用自制紗網(wǎng)用于套住接種的葉片,接種的Q型煙粉虱放入網(wǎng)后,25d后先觀察統(tǒng)計煙粉虱數(shù)目,再取網(wǎng)統(tǒng)計葉片上的產(chǎn)卵數(shù)。
3.乙烯信號通路相關(guān)基因及植毛體合成基因表達量的測定
試驗樣品為未經(jīng)過外援噴施處理接種Q型煙粉虱24h番茄葉片和經(jīng)過外援噴施處理接種Q型煙粉虱24h番茄葉片。0.5g新鮮番茄葉片置冰上,加入2000ul萃取液(2:1:0.005, 異丙醇:水:氯化氫)研磨成為勻漿,轉(zhuǎn)移至5ml的離心管中。加入內(nèi)標(biāo)樣品d4-SA(40 ng), d5-JA (15 ng), 和 d6-ABA。將樣品放在低溫搖床上搖30分鐘后,加入1.5ml二氯甲烷,放在低溫搖床搖30分鐘,然后高速離心,13 000g,離心5分鐘。樣品分為3層,棄上層和殘渣,用注射器吸取下層約1.5ml液體轉(zhuǎn)移至新的2ml離心管內(nèi)。放置于吹干儀上吹干,或者自然晾干。晾干后,用200ul甲醇水溶液重溶吹干后的樣品(如果重溶后樣品有沉淀可以再次離心,13 000g,3min),吸取離心后溶液,150ul溶液轉(zhuǎn)移至內(nèi)襯管內(nèi),5ul上樣。使用Trizol方法提取RNA[12],50-70mg新鮮的植物樣品液氮研磨,加入1ml Trizol細胞碎裂液,轉(zhuǎn)移入離心管進行,然后用渦流振蕩器充分勻漿1-2分鐘,得到勻漿液。室溫放置5min,使其充分裂解。進行高速離心,12 000rpm ,5min,放棄沉淀。按照200ul氯仿/ml Trizol的比例加入三氯甲烷,輕微振蕩混勻樣品,室溫靜置15min。進行高速低溫離心,4℃, 12 000g,15min。樣品分層,吸取上層水相,移入到新的離心管中,根據(jù)每0.5ml異丙醇/ml Trizol 的比例加入異丙醇充分混勻,室溫放置10min。然后4℃,12 000g,離心10min,棄上清,RNA沉于管底。按1ml 75%乙醇/ml Trizol加入75%的用DEPC水稀釋的乙醇,溫和振蕩離心管,懸浮沉淀。清洗RNA沉淀,反復(fù)重復(fù)兩次,4℃,8 000g,離心5min,棄上清。晾干沉淀,然后用DEPC水重溶,55-60℃,5-10min,得到RNA,用于后期測定。
4.胼胝質(zhì)含量測定
苯胺藍混合液配制:A液,0.1% 苯胺藍,稱取0.1g 苯胺藍溶于1M HCl 溶液中,定容至100ml;B液1M 甘氨酸緩沖液,稱取75.07g 甘氨酸,溶于800ml 超純水中, NaOH 調(diào)至pH 9.5 ,定容至1L ;將 A 液與 B 液按1:3的比例混合,即為苯胺藍混合液。苯胺藍空白液配制:將1M HCl 溶液與 B 液按1:3得比例混合,即為苯胺藍空白混合液。(提取胼胝質(zhì)時用的是1M? NaOH,那么標(biāo)線的配置也需要用1M NaOH。)切取約50mg的根尖,立即用98%乙醇將其固定在1.5ml的離心管中,過夜后棄掉乙醇,加入400?l 1M NaOH后,用微量研磨忤將根系充分研磨;勻漿在85℃下加熱15min后,在1000g下離心10min。提取液中的胼胝質(zhì)按以下方法測定:71μl的上清液,142μl的苯胺藍混合液,75μ1M HCL和210μ 1M 甘氨酸-NaOH緩沖液(1mol/L,pH9.5)充分混均勻,在50℃下加熱20min后冷卻至室溫,用熒光分光光度計(F-4500GL熒光分光光度計上測定熒光強度,測定的激發(fā)波長為400nm,發(fā)射波長為500nm,夾縫寬度為5nm)比色鑒定[13]。
(四)數(shù)據(jù)處理
原始數(shù)據(jù)輸入Excel(Microsoft 2003,USA), 通過SPSS(SPSS 13.0,USA)對不同處理之間的差異顯著性進行分析(新復(fù)極差檢驗,P < 0.05)。煙粉虱種群動態(tài)數(shù)據(jù)采用one-way ANOVA分析,植物的相關(guān)基因表達量采用裂區(qū)(split-split plot)分析方法。
(一)乙烯途徑對煙粉虱種群數(shù)量的影響
通過對野生型AC及乙烯不敏感型NR這2個番茄品種上種群數(shù)量調(diào)查分析,結(jié)果如圖2所示,乙烯不敏感型NR種群數(shù)量明顯高于野生型AC,說明乙烯途徑產(chǎn)生的乙烯不利于Q型煙粉虱種群增長。
圖2 AC、NR番茄上煙粉虱種群數(shù)量
(二)外援噴施ACC、1-MCP對種群數(shù)量的影響
進一步對外援噴施試驗下種群差異進行分析,結(jié)果(如圖3)表明,野生型AC及乙烯不敏感型NR品種間,NR噴施表面活性劑種群數(shù)量顯著高于AC,NR噴施乙烯合成前體ACC的種群數(shù)量顯著高于AC。AC品種中,噴施乙烯合成前體ACC的種群數(shù)量顯著高于噴施表面活性劑種群數(shù)量和噴施乙烯合成抑制劑1-MCP的種群數(shù)量。NR品種中,噴施表面活性劑的種群數(shù)量顯著高于噴施乙烯合成抑制劑1-MCP的種群數(shù)量,噴施乙烯合成抑制劑1-MCP的種群數(shù)量顯著高于噴施乙烯合成前體ACC的種群數(shù)量。說明乙烯產(chǎn)生的多少影響Q型煙粉虱種群數(shù)量,試驗結(jié)果也進一步表明,乙烯產(chǎn)生多對Q型煙粉虱種群不利,乙烯產(chǎn)生少對Q型煙粉虱種群有利。
圖3 不同噴施處理下Q型煙粉虱種群數(shù)量
注:不同的小寫字母表示同一品種不同噴施處理間差異達到了顯著水平;不同的大寫字母表示同一噴施處理下不同品種處理間差異達到了顯著水平(新復(fù)極差檢驗,P < 0.05)。
(三)乙烯信號通路相關(guān)基因表達量差異
EFR1和ERF2作為番茄乙烯信號轉(zhuǎn)錄因子,是在蛋白水平單獨或和其它蛋白質(zhì)協(xié)同與啟動子或增強子相結(jié)合發(fā)揮其調(diào)控功能[14],ETR1為乙烯受體基因,NR表型是由于ETR1相關(guān)的乙烯受體家族成員突變引起。ACO-1是ACC氧化酶編碼基因之一,ACC經(jīng)過ACC氧化酶氧化合成乙烯。總而言之,以上四種基因與乙烯最終產(chǎn)生量有關(guān)。對乙烯信號通路相關(guān)基因表達量差異進行分析,結(jié)果(如圖4)表明,不論是品種AC還是NR,不接種Q型煙粉虱的基因表達量都顯著高于接種Q型煙粉虱的基因表達量。這說明Q型煙粉虱可能通過降低乙烯信號通路相關(guān)基因表達量從而降低乙烯的產(chǎn)量來增加種群適合度。
圖4 乙烯信號通路相關(guān)基因表達量
(四)外噴施ACC、1-MCP對ERF1基因表達量的影響
進一步對外援噴施試驗下乙烯信號通路相關(guān)基因表達量差異進行分析,結(jié)果(如圖5)表明,外噴施ACC后,不論是品種AC還是NR,不接種Q型煙粉虱的基因表達量都顯著高于接種Q型煙粉虱的基因表達量。外援噴施表面活性劑后,AC品種不接種Q型煙粉虱的基因表達量都顯著高于接種Q型煙粉虱的基因表達量。而外援噴施1-MCP后,不同處理間無顯著差異。說明Q型煙粉虱可能通過降低ERF1相對表達量從而降低乙烯的產(chǎn)量來增加種群適合度。
圖5 不同噴施處理下的番茄ERF1基因表達量
(五)乙烯途徑對胼胝質(zhì)含量的影響
胼胝質(zhì)的沉積是植物的防御反應(yīng),其在植物生長發(fā)育或響應(yīng)生物和非生物脅迫過程中具有非常重要的作用[15]。結(jié)果(如圖6)表明,無論是品種AC還是NR,不接種Q型煙粉虱胼胝質(zhì)含量都顯著高于接種Q型煙粉虱的胼胝質(zhì)含量。且AC品種胼胝質(zhì)含量都高于NR品種,并且AC品種處理間的差異要比NR品種更明顯。乙烯信號途徑可能與胼胝質(zhì)產(chǎn)生與積累存在一定聯(lián)系,可能Q型煙粉虱可能通過降低乙烯產(chǎn)量從而降低胼胝質(zhì)的含量來增加種群適合度。
圖6 胼胝質(zhì)含量
(六)植毛體合成基因表達量的差異
圖7 植毛體合成基因表達量
葉片植毛體可以通過分泌次生代謝物及蛋白阻止昆蟲取食,是植物的防御機制。結(jié)果(如圖7)表明,無論是品種AC還是NR,不接種Q型煙粉虱植毛體合成基因表達量都顯著高于接種Q型煙粉虱的植毛體合成基因表達量。并且AC品種處理間的差異要比NR品種更明顯,乙烯信號途徑可能與植毛體合成基因表達量存在一定聯(lián)系。說明Q型煙粉虱可能通過降低乙烯產(chǎn)量從而降低植毛體合成基因表達量來增加種群適合度。
隨著生活質(zhì)量水平的提高,人們對營養(yǎng)質(zhì)量高的食物要求提高,番茄作為一種高營養(yǎng)的經(jīng)濟作物,其種植范圍必然會得到進一步擴大。怎樣良好地防止病蟲害,以提高番茄的產(chǎn)量和質(zhì)量,是本試驗的重要出發(fā)點。通過種群試驗和外援噴施后種群試驗測定,結(jié)果顯示,乙烯的產(chǎn)生降低了Q型煙粉虱種群數(shù)量,且乙烯產(chǎn)量多會大大降低Q型煙粉虱種群數(shù)量。說明乙烯產(chǎn)量對Q型煙粉虱種群數(shù)量有直接影響,產(chǎn)量多則對Q型煙粉虱不利。通過對植物信號途徑乙烯途徑相關(guān)基因EFR1,ERF2,ETR1,ACO-1表達量和植物抗性物質(zhì)胼胝質(zhì)含量、植毛體表達基因表達量的測定顯示,無論是品種AC還是NR,不接種Q型煙粉虱乙烯途徑相關(guān)基因EFR1,ERF2,ETR1,ACO-1表達量和植物抗性物質(zhì)胼胝質(zhì)含量、植毛體表達基因表達量都顯著高于接種Q型煙粉虱的,且AC品種都高于NR品種。說明Q型煙粉虱可能通過降低乙烯產(chǎn)量來增加種群適合度。而Q型煙粉虱通過何種途徑來降低乙烯產(chǎn)量以保證種群適合度還有待進一步研究。
通過乙烯對番茄與煙粉虱的調(diào)節(jié)作用的試驗發(fā)現(xiàn),在乙烯產(chǎn)量增多時,出現(xiàn)了煙粉虱種群擴增受抑制的現(xiàn)象,和先前的研究相符,由此可以通過對乙烯方面來調(diào)節(jié)植物對煙粉虱的抵抗能力,由于噴施乙烯合成前體ACC可以限制煙粉虱種群擴增,因此可以考慮通過噴施乙烯合成前體ACC來有效限制煙粉虱種群擴增,從而在一定程度上降低作物被蟲害后的損失。
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(責(zé)任編校:李傳熹)
Moderating Effects of Ethylene on the Interaction Between Tomatoes and Bemisia tabaci
LISi-qi1,LIJiao1,GUOHong-gang2,GEFeng2
(1.College of Agriculture and Biotechnology, Hunan University of Humanities, Science and Technology, Loudi 417000, China; 2 Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China)
Using laboratory and outdoor experiments, the authors of this paper have measured the population of Bemisia tabaci biotype Q on the wild type AC tomatoes and the ethylene-insensitive NR tomatoes.They have also measured, through treatments with inoculation of Bemisia tabaci biotype Q and those without, 1)the expression level of the ethylene-related genes such as EFR1, ERF2, ETR1 and ACO-1, 2)the content of the plant resistance material callose, 3)the expression quantity of the plant body hair expression genes, in the plant signaling pathways.The results show that 1)when inoculated with Bemisia tabaci biotype Q, the wild type AC tomatoes and the ethylene-insensitive NR tomatoes have higher expression level of the ethylene-related genes such as EFR1, ERF2, ETR1 and ACO-1, higher content of the plant resistance material callose, and larger expression quantity of the plant body hair expression genes, than the tomatoes without being inoculated with Bemisia tabaci biotype Q, 2)the population of Bemisia tabaci biotype Q on NR tomatoes is significantly larger than AC tomatoes, 3)the population of Bemisia tabaci biotype Q is much smaller when the tomatoes were sprayed on ACC than when they were not.According to the experiments, ethylene produced by the tomatoes can inhibit the growth of Bemisia tabaci biotype Q population, and the inhibiting effect is directly related to the amount of ethylene; Bemisia tabaci biotype Q can improve the population fitness by reducing the production of ethylene, namely, the ethylene can moderate the interaction between tomatoes and theBemisiatabaci.
ethylene;Bemisiatabacibiotype Q; NR tomato; interaction
2016-04-22.
李思祺(1994—),女,湖南長沙人,湖南人文科技學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院 2016 屆本科畢業(yè)生;
李姣(1980—),女,湖南岳陽人,湖南人文科技學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院講師,碩士,本文指導(dǎo)老師,研究方向:昆蟲生態(tài)、有害生物防控。
G642
A
1673-0712(2016)05-0115-07