程琳?薛亞杰?袁紅雨

摘 要：SSR分子標(biāo)記是一種基于DNA重復(fù)序列長(zhǎng)度多態(tài)性的分子標(biāo)記技術(shù)，是進(jìn)行群體遺傳學(xué)結(jié)構(gòu)分析、構(gòu)建遺傳連鎖圖譜非常有力的工具。應(yīng)用該技術(shù)的前提條件是要有相應(yīng)的SSR引物，可利用CTAB法提取茶樹基因組DNA，對(duì)茶樹基因組DNA進(jìn)行MseI酶切連接獲得目的基因，將目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增后通過磁珠法洗脫，對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，得到目的基因的序列組成。

關(guān)鍵詞：茶樹；SSR；分子標(biāo)記；序列

真核生物基因組中含有一類DNA堿基序列，稱作微衛(wèi)星。微衛(wèi)星DNA即簡(jiǎn)單序列重復(fù)（SSR，Simple Sequence Repeat），是一類由1～6個(gè)堿基組成的基序串聯(lián)重復(fù)而成的DNA序列。

本實(shí)驗(yàn)以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，利用磁珠富集法獲取開發(fā)茶樹SSR分子標(biāo)記序列所需的引物。

一、材料和方法

1.茶葉基因組DNA提取與檢測(cè)

（1）取幼嫩的茶樹葉片洗凈，用70%乙醇消毒后再用無菌水沖洗，吸干水分，將材料放入研缽，加液氮研磨成粉末狀。

（2）將粉末轉(zhuǎn)移至2.0ml離心管中，放入剛才制作的預(yù)處理液1mL（0.4mol/L的葡萄糖，3%的聚乙烯吡烷酮），混勻后5000rpm離心，棄上清。

（3）向沉淀中加入630μL預(yù)熱（65℃）1.5×CTAB提取緩沖液（1.5%CTAB，1.5mol/L NaCl，15mmol/L EDTA，100mmol/L Tris-HCl pH 8.0，0.2%β-巰基乙醇），加入70μL無水乙醇，65℃水浴45min。

（4）從水浴中取出離心管，冷卻后加入600μL氯仿：異戊醇（24∶1），混勻后10000rpm離心10min。

（5）將離心后的上清液轉(zhuǎn)移至另一2mL離心管中，加入2/3體積預(yù)冷的異丙醇混勻，置于-20℃冰箱中30min，5000rpm離心3min，棄上清。

（6）加入800μLTE buffer（10m mol/L Tris-HCl，1m mol/L EDTA，pH8.0），溶解DNA。

2.茶樹基因組DNA的MseI酶切及電泳檢測(cè)

取一個(gè)離心管向其中先后加入16.3μL ddH2O、0.2μL 100×BSA、1μL茶樹基因組DNA、2.0μL 10×Buffer、0.5μL MseI（10U/μL），混勻后放至37℃水浴鍋中反應(yīng)三小時(shí)，然后65℃處理20min。

3.酶切產(chǎn)物與接頭連接

取Oligo-MseI A和Oligo-MseI B分別配制成50μM貯存液，充分溶解后取出等體積Oligo-MseI A和Oligo-MseI B各50μL充分混勻后94℃變性5 min，取出緩慢冷卻至室溫，保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

二、結(jié)果

MseI酶切產(chǎn)物電泳后在200bp-800bp范圍內(nèi)出現(xiàn)明顯smear區(qū)域（圖1）。

PCR預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后在200bp-800bp處出現(xiàn)明顯smear區(qū)域（圖2）。

電泳檢測(cè)可發(fā)現(xiàn)有明顯smear區(qū)域（圖3）。

三、討論

在常用的獲取微衛(wèi)星引物的辦法里，有一種方法比較方便，也是很經(jīng)濟(jì)的一種方法，即在已經(jīng)發(fā)表過的文獻(xiàn)里面，可以找到微衛(wèi)星引物，還有一種辦法就是可以從總的數(shù)據(jù)庫(kù)里面挑選出微衛(wèi)星的具體位置。到今天有些動(dòng)植物還沒有關(guān)于SSR標(biāo)記的研究報(bào)道，近緣物種又相對(duì)較少，必須開發(fā)引物。在選擇以何種方法獲得微衛(wèi)星位點(diǎn)時(shí)，有2個(gè)因素決定了篩選方法的選擇：①研究的目的；②所需要的微衛(wèi)星數(shù)目。除以上2個(gè)因素外，對(duì)于多數(shù)研究者來說，實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)設(shè)備，以及分離微衛(wèi)星的費(fèi)用也是不得不考慮的因素。綜合以上因素，對(duì)于SSR含量較少的物種最好采用富集策略提高分離效率，以此來節(jié)約時(shí)間和資金。比較富集法中各種微衛(wèi)星位點(diǎn)開發(fā)策略，基于磁珠富集法所需設(shè)備簡(jiǎn)單，技術(shù)要求較低，周期相對(duì)較短，適合多數(shù)實(shí)驗(yàn)室開展工作。

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