王鴻磊+王紅艷+劉彤

摘要：空冷凍干燥是保存微生物材料最有效的方法之一，凍干保護劑對冷凍干燥后微生物的存活率具有重要影響。本研究以煙臺產區(qū)優(yōu)良葡萄酒酵母菌為研究對象，通過單因素實驗和正交試驗設計，研究了脫脂乳粉、蔗糖和抗壞血酸3種物質對葡萄酒酵母凍干存活率的影響，結果表明，3種保護劑的保護效果依次為：蔗糖>脫脂乳粉>抗壞血酸；最佳保護劑的配方為：脫脂奶粉8%+蔗糖12%+抗壞血酸6%，加入優(yōu)化后的凍干保護劑后，葡萄酒酵母凍干后存活率可達95.3%。

關鍵詞：葡萄酒酵母；冷凍干燥；保護劑；正交優(yōu)化

葡萄酒是一種營養(yǎng)豐富的低度發(fā)酵酒，是僅次于啤酒的第二大酒精飲料，深受人們的喜愛[1]。葡萄酒釀造是一個復雜的生物轉化過程，葡萄酒質量的好壞與酵母菌有著密切的關系[2-4]。在世界著名的葡萄和葡萄酒產區(qū)，由于地理位置、氣候、土壤等的不同，形成了各自不同的葡萄風格，各產區(qū)的酵母菌也逐漸適應了當地的氣候、土壤和葡萄品種，形成了適于當地葡萄酒釀造的菌系[5]。國外在產地葡萄酒發(fā)酵專用酵母篩選上進行了一系列的研究，獲得了一系列適于表現本地葡萄風格的專用酵母發(fā)酵劑，使得所釀葡萄酒具有很強的甚至獨一無二的產地特性。然而，我國目前葡萄酒發(fā)酵中使用的酵母菌完全依賴進口，這種引進的發(fā)酵劑，往往在當地葡萄酒生產上并不能完全表現出其優(yōu)良性狀，不能完全體現產地葡萄的品質和特色[6]，降低了葡萄酒產品的獨特性和風味的多樣性，造成各地葡萄酒質量和風格的趨同化。因此，我國應加強本土葡萄酒酵母菌發(fā)酵劑的研究，以生產具有獨特產地特性的優(yōu)質葡萄酒。煙臺產區(qū)是我國葡萄酒工業(yè)的發(fā)祥地，是我國最大的葡萄和葡萄酒的生產基地，擁有聞名于世的葡萄酒第七大葡萄海岸[7]，葡萄酒產量約占全國葡萄酒總產量的1/3[8]。煙臺產區(qū)的葡萄釀出的葡萄酒具有區(qū)別于其他葡萄酒產區(qū)獨特的海岸葡萄酒風格。煙臺產區(qū)的葡萄園歷史悠久，在葡萄園內形成了穩(wěn)定的天然酵母區(qū)系，蘊含著豐富的天然酵母菌資源。

真空冷凍干燥（簡稱凍干）是制備和保存微生物材料最有效的方法之一[9]。利用此方法生產的發(fā)酵劑具有活菌存活率高，接種量小，保存期長等優(yōu)點[10-15]。本研究以篩選自煙臺葡萄園的優(yōu)質葡萄酒酵母為研究對象，研究了不同凍干保護劑對葡萄酒酵母的保護效果，并通過正交試驗對葡萄酒酵母凍干保護劑配方進行了優(yōu)化，為研發(fā)適于煙臺產區(qū)的優(yōu)質活性葡萄酒干酵母發(fā)酵劑提供技術支持。

1 材料方法

1.1 材料

1.1.1 菌種：葡萄酒酵母：本實驗室分離保藏。

1.1.2 試劑、培養(yǎng)基：蔗糖、抗壞血酸、脫脂奶粉、馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（PDA液體培養(yǎng)基）、馬鈴薯葡萄糖固體培養(yǎng)基（PDA固體培養(yǎng)基）

1.1.3 儀器設備：超凈工作臺（上海博訊實業(yè)有限公司）、恒溫培養(yǎng)箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）、高壓蒸汽滅菌鍋（上海博訊實業(yè)有限公司）、電熱鼓風干燥箱（上海博訊實業(yè)有限公司）、萬分之一分析天平（賽多利斯）、冷凍干燥機（東京理化）、恒溫振蕩器（上海博訊實業(yè)有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 葡萄酒酵母增殖培養(yǎng)

將葡萄酒酵母接種于PDA培養(yǎng)基斜面上，28℃活化24h，將活化的菌種接入PDA液體培養(yǎng)基中，28℃，180r/min培養(yǎng)48h。

1.2.2 單因素試驗及正交優(yōu)化試驗

取增殖培養(yǎng)后的培養(yǎng)液4000r/min離心20min，棄上清液，用無菌生理鹽水清洗3遍，補入同體積保護劑，制成懸浮液。

1.2.3 預凍

將均勻混合了保護劑的菌懸液轉入凍干瓶中，在-85℃的低溫條件下預凍12h至樣品完全凍結后取出。

1.2.4 冷凍干燥

將預凍完結的菌懸液置于冷凍干燥機中進行干燥處理，待菌懸液完全成粉末狀時預示冷凍干燥完成。

1.2.5 冷凍存活率計算

利用平板涂布法測定凍干前后酵母菌的活菌數，利用以下公式計算存活率。

1.2.6 數據分析

采用SPSS軟件對數據進行分析，采用OriginPro7.5進行圖形繪制。

2 結果分析

2.1葡萄酒酵母凍干保護劑的單因素試驗

2.1.1 脫脂奶粉濃度菌體存活率的影響

在生理鹽水中加入脫脂奶粉，使脫脂奶粉的終濃度達到4%、6%、8%、10%、12%，凍干后測定酵母存活率，結果如圖1所示。

隨著脫脂奶粉加量的增加，酵母的存活率逐漸上升，脫脂奶粉濃度達到8%，酵母存活率達到最高，之后隨著脫脂奶粉濃度的增加，酵母存活率逐漸降低。

2.1.2蔗糖濃度菌體存活率的影響

在生理鹽水中加入蔗糖，使蔗糖的終濃度達到9%、10%、11%、12%、13%、14%，凍干后測定酵母存活率，結果如圖2所示。

蔗糖對酵母存活率的影響與脫脂奶粉相似，隨著蔗糖濃度的增加，酵母的存活率逐漸上升，蔗糖濃度達到12%時酵母存活率達到最高，之后隨著蔗糖濃度的增加，酵母存活率略有下降。

2.1.3抗壞血酸濃度菌體存活率的影響

在生理鹽水中加入抗壞血酸，使抗壞血酸的終濃度達到4%、6%、8%、10%、12%，凍干后測定酵母存活率，結果如圖3所示。

抗壞血酸濃度達到8g/L時酵母存活率達到最高，之后隨著抗壞血酸濃度的增加，酵母存活率逐漸降低。

2.2 葡萄酒酵母凍干保護劑的正交優(yōu)化

在單因素的基礎上，為獲得最佳的保護劑配方，采用三因素三水平正交試驗設計對脫脂乳粉、蔗糖和抗壞血酸3個因素進行考察，確定最佳的保護劑組合。各種保護劑水平設計見表1。

按表1的因素水平設計正交試驗，其結果如表2所示。

由表2極差R分析可知，3種保護劑對菌種存活率影響由大到小順序為B>A>C，即蔗糖對酵母存活率影響最大，其次是脫脂乳粉，最后是抗壞血酸。根據極差分析，酵母存活率最高的組合為A2B2C1，由于這個組合不在已做的9次試驗中，所以對其進行了驗證，結果如表3所示。

經過三次重復試驗，葡萄酒酵母菌的存活率平均達到95.3%，均高于表2中的存活率，所以最佳組合為A2B2C1，即最佳凍干保護劑配方為：脫脂奶粉8%+蔗糖12%+抗壞血酸6%。

3 討論

在冷凍干燥技術制備葡萄酒酵母制劑的過程中，冷凍是導致酵母菌死亡的主要原因。凍干保護劑的加入將大大提高酵母菌冷凍干燥后的存活率。試驗證明3種保護劑中蔗糖的保護效果是最好的。由于蔗糖具有多個羥基，可以阻止細胞膜因失水而融合，可與蛋白質形成氫鍵防止蛋白質因凍干而變性，同時蔗糖在溶液中易結合水分子，減緩了晶核的生長過程，所以具有很好的保護細胞的作用。但是單靠蔗糖一種保護劑不能達到最佳的保護效果，本試驗利用三種保護劑的協同作用，得到了高于單一保護劑的酵母存活率，為進一步研制活性干酵母奠定了基礎。

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[8]煙臺葡萄與葡萄酒局成立 謀劃葡萄產區(qū)聯盟.http：//www.chinadaily.com.cn/m/shandong/c/2010-12/21/content_11735650.htm

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