張克娟，楊明珍

?

免疫學(xué)標記在彌漫大B細胞淋巴瘤中的預(yù)后意義

張克娟，楊明珍

目的 探討彌漫大B細胞淋巴瘤中各免疫學(xué)標記的臨床預(yù)后意義。方法 回顧性分析有完整隨訪資料的新診斷DLBCL病理組織標本78例，進行國際預(yù)后指數(shù)(IPI)評分，并用免疫組化法分為GCB亞型和non-GCB亞型。分析免疫學(xué)亞型和免疫學(xué)標記的預(yù)后意義。結(jié)果 78例DLBCL患者中GCB亞型組33例，non-GCB亞型組45例；生存分析顯示GCB亞型組3年總生存期(OS)、無進展生存期(PFS)均明顯優(yōu)于non-GCB亞型組。Cox多因素回歸模型分析顯示BCL2表達、IPI評分是OS、PFS的獨立預(yù)后因素(P<0.05)。生存分析表明，non-GCB亞型中BCL2陽性組3年OS、PFS明顯低于BCL2陰性組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而GCB亞型中BCL2陽性組與陰性組3年OS、PFS差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論 免疫學(xué)標記可以初步判斷DLBCL患者的預(yù)后，免疫學(xué)亞型結(jié)合BCL2表達對預(yù)后具有一定的指導(dǎo)意義。

BCL2；彌漫大B細胞淋巴瘤；預(yù)后

彌漫大B細胞淋巴瘤(diffuselargeBcelllymphoma，DLBCL)是非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkins′slymphoma,NHL)中發(fā)病率最高的亞型，約占到NHL的30%～40%[1]，DLBCL是一組異質(zhì)性腫瘤，不同亞型患者在臨床特征、遺傳學(xué)特點和臨床預(yù)后差別很大。 目前評價DLBCL預(yù)后的是國際預(yù)后指數(shù)(internationalprognosticindex,IPI)，是根據(jù)年齡、AnnArbor臨床分期、結(jié)外侵犯、體能狀態(tài)(performancestatus,PS)和血清乳酸脫氫酶(lactatedehydrogenase,LDH)5個因素判定。但是在實際臨床工作中常會發(fā)現(xiàn)相同IPI評分的患者，治療效果相差很大，因為IPI不能完全反應(yīng)腫瘤的分子生物學(xué)本質(zhì)[2]。Hansetal[3]用免疫組織化學(xué)技術(shù)(immunohistochemistry,IHC)檢測CD10、BCL6、MUM1蛋白表達，將DLBCL分為生發(fā)中心(germinalcenterlikeBcells,GCB)和非生發(fā)中心(non-germinalcenterlikeBcells,non-GCB)兩組預(yù)后不同的亞型。雖然對于免疫組化褒貶不一，但由于其簡便易行仍被病理科廣泛應(yīng)用。該實驗通過免疫組化法檢測DLBCL患者的免疫學(xué)指標，并按文獻[3]報道進行免疫學(xué)分型，探討免疫學(xué)亞型與臨床特征的關(guān)系，同時分析免疫學(xué)指標的預(yù)后意義。

1 材料與方法

1.1 材料 收集安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2008年1月～2013年12月有完整隨訪資料的新診斷DLBCL病理組織標本(經(jīng)福爾馬林固定及石蠟包埋)78例，其中男49例，女29例；年齡22～88歲，中位年齡57歲。診斷依據(jù)2008年WHO對淋巴造血組織腫瘤分類標準[4]，并由淋巴瘤病理學(xué)專家對其進行明確診斷。臨床分期采用AnnArbor分期標準；IPI評分跟據(jù)年齡、LDH、有無結(jié)外侵犯、PS和AnnArbor臨床分期5個因素。78例患者均接受標準CHOP(環(huán)磷酰胺、表阿霉素、長春新堿、潑尼松)或R-CHOP(利妥昔單抗、環(huán)磷酰胺、表阿霉素、長春新堿、潑尼松)方案化療4～6個療程，其中有24例患者同時接受局部放療。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑 鼠抗人BCL2單克隆抗體、鼠抗人BCL6單克隆抗體、兔抗鼠IgG3-FITC二抗均購自美國SantaCruz公司；鼠抗人CD10單克隆抗體、鼠抗人MUM-1單克隆抗體均購自北京中杉金橋生物公司。

1.2.2 免疫組化 采用SP法免疫組化染色，BCL2陽性表達位于細胞質(zhì)，CD10陽性表達位于細胞膜，BCL6、MUM1陽性表達位于細胞核，結(jié)果采用定性判斷，腫瘤細胞數(shù)≥30%為陽性[3]。根據(jù)DLBCL中CD10、BCL6和MUM1的表達情況分為GCB型和non-GCB型，具體參照Hansetal[3]標準：若CD10+或CD10-BCL6+MUM1-即為GCB型；CD10-BCL6+MUM1+或CD10-BCL6-即為non-GCB型。

1.2.3 病例隨訪 總生存期(overallsurvival,OS) 的計算是從DLBCL的確診到腫瘤本身引起的死亡或隨訪的終止。無進展生存期(progression-freesurvival,PFS)的計算從DLBCL的確診到腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移或病情惡化。隨訪采取查閱病例資料、電話結(jié)合的方式進行。隨訪時間截止至2015年10月。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS16.0軟件進行分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗。生存曲線分析采用Kaplan-Meier法，單因素生存曲線比較采用Log-rank檢驗，多因素預(yù)后分析應(yīng)用Cox比例風(fēng)險模型。

2 結(jié)果

2.1 免疫學(xué)亞型與臨床特征的關(guān)系 78例DLBCL患者中GCB亞型組33例(42.3%)，non-GCB亞型組45例(57.7%),分析研究表明GCB亞型組和non-GCB亞型組在年齡、性別、血清LDH、分期、化療方案、IPI評分、原發(fā)部位、骨髓侵犯、A/B癥狀等之間的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

表1 免疫學(xué)亞型與臨床特征的關(guān)系[n(%)]

2.2 各免疫學(xué)標記在免疫亞型中的表達 78例DLBCL患者中BCL2陽性表達率為59.0%，BCL6陽性表達率為65.4%，CD10陽性表達率32.1%，MUM1陽性表達率60.3%。分析顯示BCL2在GCB亞型和non-GCB亞型之間的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義；BCL6在GCB亞型中的陽性表達率高于non-GCB亞型(P<0.05)，而MUM1在GCB亞型中的陽性表達率低于non-GCB亞型(P<0.05)。見表2。

表2 各免疫學(xué)標記在免疫亞型中的表達[n(%)]

2.3 免疫學(xué)標記的預(yù)后意義

2.3.1 各免疫學(xué)標記的生存分析 通過單變量Kaplan-Meier法對78例DLBCL患者的免疫學(xué)標記進行生存分析，結(jié)果顯示BCL2陽性組3年OS、PFS均明顯差于BCL2陰性組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。BCL6陽性組3年OS、PFS明顯優(yōu)于BCL6陰性組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。CD10陽性組和陰性組之間的3年OS、PFS差異無統(tǒng)計學(xué)意義。MUM1陽性組和陰性組之間的3年OS、PFS差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表3。

表3 免疫學(xué)標記的生存分析

2.3.2 免疫學(xué)亞型的生存分析 生存分析顯示GCB亞型和non-GCB亞型3年OS分別為80.2%、57.9%(χ2=4.229，P=0.040)；3年P(guān)FS分別為74.4%、4.8%(χ2=5.496，P=0.019)；分析結(jié)果顯示GCB亞型3年OS、PFS均明顯優(yōu)于non-GCB亞型。

2.3.3IPI的生存分析 78例DLBCL患者按照NHLIPI進一步分為低危組(59例)和高危組(19例)，低危組和高危組3年OS分別為77.6%、36.1%(χ2=13.527，P=0.000)，3年P(guān)FS分別為63.6%、28.5%(χ2=11.458，P=0.001)，分析顯示低危組3年OS、PFS均明顯優(yōu)于高危組。

2.3.4 免疫學(xué)標記的預(yù)后分析 通過單因素分析表明BCL2陽性、BCL6陰性、IPI高危組、non-GCB亞型均是OS、PFS的不良預(yù)后因素(P<0.05)。將以上因素與OS、PFS相關(guān)指標代入Cox多因素回歸模型分析顯示，BCL2、IPI高危組對OS、PFS的影響差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，是獨立的預(yù)后因素。見表4。

表4 免疫學(xué)標記預(yù)后因素的Cox回歸分析

RR：相對危險度；95% CI：95%置信區(qū)間

2.4 免疫學(xué)亞型伴BCL2表達的預(yù)后意義 按不同免疫學(xué)亞型結(jié)合BCL2陽性和陰性患者可分為GCB+BCL2+、GCB+BCL2-、non-GCB+BCL2+、non-GCB+BCL2-4種類型，通過分析可見non-GCB亞型中BCL2陽性組3年OS、PFS均明顯低于BCL2陰性組(46.7% vs 70.5%，χ2=5.070，P=0.024；19.2% vs 73.7%，χ2=10.881，P=0.001)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；而GCB亞型中BCL2陽性組與陰性組3年OS、PFS差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(76.6% vs 84.6%，χ2=0.161，P=0.688；72.7% vs 76.9%，χ2=0.366，P=0.545)。

3 討論

DLBCL存在生物學(xué)和預(yù)后因素的異質(zhì)性，許多研究者努力探究有效的預(yù)測生物學(xué)標志物，從而指導(dǎo)臨床治療。研究[5]表明IPI評分可以對DLBCL患者進行危險度分層，對生存預(yù)后具有重要意義。本研究結(jié)果顯示低危組患者3年OS、PFS均明顯優(yōu)于高危組，同時Cox多因素回歸分析顯示IPI評分是DLBCL患者的獨立預(yù)后因素。目前對DLBCL患者的預(yù)后研究不僅局限于IPI，而且達到了分子生物學(xué)水平階段。使用互補脫氧核糖核酸陣列基因表達模式(Geneexpressionprofiling,GEP)可以將DLBCL分為GCB、活化B細胞(activitatedBcell-like,ABC)和第3種類型[6]。但是GEP需要新鮮的組織標本且操作復(fù)雜，在實際工作中很難普及。本研究表明IHC具有很大的實用價值，并用IHC將DLBCL分為GCB亞型和non-GCB亞型，兩種亞型之間具有不同的生物學(xué)特性及預(yù)后意義。

CD10是肽鏈內(nèi)切酶以及生發(fā)中心細胞的標記物，正常表達在生發(fā)中心B細胞。20%～40%的DLBCL患者表達CD10，而CD10表達的預(yù)后意義一直存在爭議[7]。本研究中CD10陽性表達率為32.1%，生存分析可見CD10陽性表達與預(yù)后無明顯相關(guān)性，與報道[8]相似。BCL6是一種原癌基因，在生發(fā)中心的形成過程中發(fā)揮重要作用。本研究顯示BCL6陽性表達率為65.4%，生存分析表明BCL6陽性表達有利于預(yù)后，與報道[9]相符。MUM1是一種在基因表達調(diào)控中發(fā)揮重要作用的轉(zhuǎn)錄因子[10]，主要調(diào)節(jié)B細胞分化的最終階段。在約70%的DLBCL患者中可檢測到MUM1表達，國內(nèi)外對于MUM1表達預(yù)后意義的研究存在爭議[11]。在本研究中MUM1陽性表達率為60.3%，與報道[11]相似；但生存分析顯示MUM1表達與預(yù)后無相關(guān)性。正因為國內(nèi)外對CD10、BCL6、MUM1表達的獨立預(yù)后意義結(jié)果差異很大，因此將上述免疫學(xué)指標結(jié)合起來進行免疫學(xué)分型對DLBCL患者預(yù)后分析具有重要價值。Hansetal[3]用IHC檢測152例DLBCL患者的CD10、BCL6、MUM1蛋白表達，并將DLBCL分為GCB型64例(42%)及non-GCB型88例(58%)；生存分析顯示GCB亞型預(yù)后明顯優(yōu)于non-GCB亞型。本研究中GCB亞型患者33例，non-GCB亞型45例，non-GCB亞型組3年OS、PFS明顯低于GCB亞型，進一步分析可見non-GCB亞型是DLBCL不良的預(yù)后因素，與研究[12]報道相似。因此，使用IHC將DLBCL患者進行免疫學(xué)分型，可以對患者作初步的預(yù)后判斷。

BCL2是一種腫瘤凋亡抑制基因，其基因產(chǎn)物是一種重要的調(diào)節(jié)正常B細胞發(fā)育和分化的抗凋亡蛋白[13]。BCL2蛋白表達發(fā)生在約30%～60%的DLBCL患者中[2]，目前對于BCL2蛋白異常表達的研究最常見的是t(14；18)的易位，BCL2基因從正常位點的(18q21)易位到免疫球蛋白重鏈附近，導(dǎo)致BCL2基因的轉(zhuǎn)錄啟動和BCL2蛋白的過度表達。其次，還有可能因為BCL2基因的拷貝數(shù)擴增所致。研究[14]顯示BCL2表達與不良預(yù)后有關(guān)。本研究中BCL2陽性表達率為59.0%，與報道[9]相似；同時研究顯示BCL2陽性組3年OS、PFS均明顯低于BCL2陰性組，在多變量Cox回歸分析中顯示BCL2是DLBCL的獨立預(yù)后因素。因此，BCL2表達是DLBCL的不良預(yù)后因素，對于預(yù)測DLBCL患者預(yù)后具有重要意義。此外non-GCB亞型中BCL2陽性組生存預(yù)后明顯差于陰性組，而GCB亞型中BCL2陽性組與陰性組之間生存預(yù)后差異無統(tǒng)計學(xué)意義，由此可見免疫學(xué)亞型伴BCL2表達與預(yù)后存在一定關(guān)系，提示免疫學(xué)亞型與免疫標記物之間還可能有著內(nèi)在聯(lián)系，需要進一步研究探討。

由于DLBCL是高度異質(zhì)性疾病，需要把相關(guān)的一些預(yù)后因素結(jié)合起來，才可能更準確地將患者進行危險度分層，采取個體化治療。本研究顯示CD10、BCL6、MUM1、BCL2等免疫學(xué)標記對于預(yù)測DLBCL患者的預(yù)后具有重要的指導(dǎo)意義，由于病例數(shù)少，不能詳細探究這些預(yù)后因素之間的內(nèi)在聯(lián)系，因此，需要大樣本量來進一步研究。

[1]MartelliM,FerreriAJ,AgostinelliC,etal.DiffuselargeB-celllymphoma[J].CritRevOncolHematol,2013 , 87(2):146-71.

[2]MaeshimaAM,TaniguchiH,FukuharaS,etal.Bcl-2,Bcl-6,andtheInternationalPrognosticIndexareprognosticindicatorsinpatientswithdiffuselargeB-celllymphomatreatedwithrituximab-containingchemotherapy[J].CancerSci, 2012 ,103(10):1898-904.

[3]HansCP,WeisenburgerDD,GreinerTC,etal.ConfirmationofthemolecularclassificationofdiffuselargeB-celllymphomabyimmunohistochemistryusingatissuemicroarray[J].Blood, 2004, 103(1): 275-82.

[4]JaffeES.The2008WHOclassificationoflymphomas:implicationsforclinicalpracticeandtranslationalresearch[J].HematologyAmSocHematolEducProgram, 2009: 523-31.

[5]FuK,WeisenburgerDD,ChoiWW,etal.AdditionofrituximabtostandardchemotherapyimprovesthesurvivalofboththegerminalcenterB-cell-likeandnon-germinalcenterB-cell-likesubtypesofdiffuselargeB-celllymphoma[J].JClinOncol, 2008, 26(28): 4587-94.

[6]LiJM,HouJ,LiL,etal.ImmunohistochemicalsubtypesofdiffuselargeB-celllymphomaintheheadandneckregion[J].GenetMolRes, 2015,14 (2): 3889-96.

[7]SallesG,deJongD,XieW,etal.PrognosticsignificanceofimmunohistochemicalbiomarkersindiffuselargeB-celllymphoma:astudyfromtheLunenburgLymphomaBiomarkerConsortium[J].Blood, 2011, 117(26):7070-8.

[8]LuTX,MiaoY,WuJZ,etal.ThedistinctclinicalfeaturesandprognosisoftheCD10+MUM1+andCD10-Bcl6-MUM1-diffuselargeB-celllymphoma[J].SciRep, 2016, 6:20465.

[9]JovanovicMP,MihaljevicB,JakovicL,etal.BCL2positiveandBCL6negativediffuselargeBcelllymphomapatientsbenefitfromR-CHOPtherapyirrespectiveofgerminalandnongerminalcenterBcelllikesubtypes[J].JBUON, 2015,20(3):820-8.

[10]DeMelloCA,DeAndradeVP,DeLimaVC,etal.PrognosticimpactofMUM1expressionbyimmunohistochemistryonprimarymediastinallargeB-celllymphoma[J].LeukLymphoma, 2011,52(8):1495-503.

[11]IqbalJ,GreinerTC,PatelK,etal.DistinctivepatternsofBCL6molecularalterationsandtheirfunctionalconsequencesindifferentsubgroupsofdiffuselargeB-celllymphoma[J].Leukemia, 2007, 21(11): 2332-43.

[12]CulpinRE,SieniawskiM,AngusB,etal.Prognosticsignificanceofimmunohistochemistry-basedmarkersandalgorithmsinimmunochemotherapy-treateddiffuselargeBcelllymphomapatients[J].Histopathology, 2013, 63(6):788-801.

[13]JohnsonNA,SavageKJ,LudkovskiO,etal.LymphomaswithconcurrentBCL2andMYCtranslocations:thecriticalfactorsassociatedwithsurvival[J].Blood, 2009, 114(11): 2273-9.

[14]vanImhoffGW,BoermaEJ,vanderHoltB,etal.Prognosticimpactofgerminalcenter-associatedproteinsandchromosomalbreakpointsinpoor-riskdiffuselargeB-celllymphoma[J].JClinOncol, 2006,24(25):4135-42.

Prognostic significance of immunological markers in diffuse large B cell lymphoma

ZhangKejuan,YangMingzhen

(Dept of Hematology,The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022)

Objective To investigate the clinical prognostic significance of immunological markers in diffuse large B cell lymphoma.Methods The cases of 72 DLBCL pathological tissue samples with complete follow-up data newly were retrospectively analyzed and the IPI was analyzed.The patients were divided into GCB and non-GCB subtypes by the immunohistochemical staining,and the prognostic significance of immunophenotypic subtypes and immuno-

BCL2; diffuse large B cell lymphoma; prognosis

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160810.1104.022.html

2016-06-27接收

安徽高校省級自然科學(xué)研究項目(編號：KJ2011A164)

安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液內(nèi)科，合肥 230022

張克娟，女，碩士研究生；

楊明珍，男，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail:yangmz@163.com

R733.4

A

10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2016.10.022

logical markers was analyzed.Results The GCB subtype group was 33 cases, and non-GCB subtype group was 45 cases in 78 patients with DLBCL;survival analysis showed that the 3-year overall survival(OS) and the progression-free survival(PFS) were significantly better in GCB subtype group than that in non-GCB subtype group.Multivariate analysis showed that BCL2 expression and international prognostic index were independent prognostic factors for OS and PFS.Survival analysis showed that the 3-year of OS and PFS were significantly lower in BCL2 positive group than that in negative group for non-GCB subtype,the difference was statistically significant(P<0.05). Then the 3-year of OS and PFS had no significant difference between BCL2 positive group and negative group for GCB subtype.Conclusion The immunological markers can preliminaryly judge the prognosis of patients with DLBCL,and the combination of immunophenotypic subtype and BCL2 has a certain guiding significance on prognosis.