卞合濤，初建峰

?

高壓氧預(yù)處理對(duì)大鼠腦梗死后腦水腫的影響及機(jī)制研究

卞合濤，初建峰

目的 探討高壓氧預(yù)處理對(duì)大鼠腦梗死后腦水腫的影響及可能機(jī)制。方法 選擇SD大鼠96只,隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、高壓氧預(yù)處理組，每組各32只。采用大腦中動(dòng)脈線栓法建立大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞模型，在腦缺血后24、72 h進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分；在腦缺血后72 h處死動(dòng)物取出腦組織，檢測(cè)腦梗死側(cè)腦組織濕重干重比值(W/D)，利用TTC染色法計(jì)算腦梗死體積，利用Western blot法檢測(cè)腦梗死側(cè)腦組織白細(xì)胞介素1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)蛋白的表達(dá)。結(jié)果 腦梗死后24 h和72 h，高壓氧預(yù)處理組與模型組比較，大鼠神經(jīng)功能評(píng)分明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，高壓氧預(yù)處理組在腦缺血后72 h腦梗死體積、腦水腫明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，高壓氧預(yù)處理組在腦缺血后72 h IL-1β、TNF-α、MMP-9的表達(dá)明顯降低(P<0.05)。結(jié)論 高壓氧預(yù)處理可能通過(guò)抑制IL-1β、TNF-α、MMP-9的表達(dá)，保護(hù)血腦屏障的完整性，減輕腦梗死后腦水腫。

腦梗死；高壓氧；腦水腫；基質(zhì)金屬蛋白酶9

腦卒中目前已成為人類(lèi)第二位死因，有發(fā)病率高、致殘率高和致死率高等特點(diǎn)，其中缺血性腦卒中約占腦卒中的80%。溶栓治療是目前較為肯定和有效的方法[1]，但溶栓治療有嚴(yán)格的時(shí)間窗限制，僅有少部分患者獲益。因此針對(duì)缺血性腦卒中的發(fā)病機(jī)制，選擇性地研究新的治療方法至關(guān)重要。腦組織缺血后，缺血區(qū)發(fā)生一系列炎癥反應(yīng)，加重血腦屏障的破壞，促使腦水腫的形成，導(dǎo)致顱內(nèi)壓升高，嚴(yán)重影響患者的預(yù)后。白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)和腫瘤壞死因子α( tumor necrosis factior-α,TNF-α)被認(rèn)為是炎癥反應(yīng)的重要因子?；|(zhì)金屬蛋白酶9( matrix metalloproteinase 9,MMP-9)的增加被認(rèn)為參與了血腦屏障的破壞，加重了腦水腫的形成[2]。研究[3]表明高壓氧預(yù)處理可誘導(dǎo)腦缺血耐受，減少梗死面積，改善神經(jīng)功能缺損癥狀，但具體機(jī)制不明確。該研究擬觀察高壓氧預(yù)處理對(duì)腦梗死后腦水腫的影響及檢測(cè)腦組織IL-1β、TNF-α、MMP-9的變化，探討高壓氧預(yù)處理對(duì)腦梗死后腦水腫的影響及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑 兔抗大鼠MMP-9、兔抗大鼠IL-1β、兔抗大鼠TNF-α(英國(guó)Abcam公司)；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記物山羊抗兔lgG抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；高壓氧艙(武漢船舶設(shè)計(jì)院)；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(北京康為公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 健康雄性SD大鼠，重(250±10) g，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，手術(shù)前后動(dòng)物自由進(jìn)食和進(jìn)水，室溫保持(24±1) ℃。實(shí)驗(yàn)前隨機(jī)將動(dòng)物分為假手術(shù)組(n=32)、模型組(n=32)、高壓氧預(yù)處理組(n=32)。

1.3 高壓氧預(yù)處理方法 高壓氧預(yù)處理組大鼠在大腦中動(dòng)脈栓塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型前放于高壓氧艙內(nèi)連續(xù)預(yù)處理5 d。實(shí)驗(yàn)前利用高濃度氧洗艙，將大鼠放于高壓氧艙內(nèi)，開(kāi)始時(shí)利用15 min勻速加壓至0.1 MPa，高壓持續(xù)60 min，15 min勻速減壓至艙內(nèi)正常壓力，艙內(nèi)溫度保持在(24±1) ℃，1次/d，連續(xù)5 d。末次高壓氧處理后3 h建立MCAO模型。

1.4 MCAO模型建立 采用文獻(xiàn)[4]報(bào)道的線栓法建立MCAO模型，大鼠用100 g/L水合氯醛(400 mg/kg)腹腔注射麻醉，仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，頸部皮膚用碘伏消毒，頸正中線切口2 cm左右，分離兩側(cè)甲狀腺，暴露氣管右側(cè)與胸鎖乳突肌和胸骨舌骨肌間的三角區(qū)，游離右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈，從頸總動(dòng)脈插入多聚左旋賴(lài)氨酸處理過(guò)的直徑為0.26 mm的線栓，插入深度約為18 mm時(shí)產(chǎn)生阻擋感，停止插入。然后結(jié)扎、縫合，缺血120 min后輕柔拔出線栓5 mm并固定于皮下。

1.5 大鼠神經(jīng)功能評(píng)分 采用大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分[5]，在腦梗死后的24、72 h對(duì)各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，包括感覺(jué)、運(yùn)動(dòng)、反射、平衡等方面進(jìn)行。

1.6 腦梗死體積檢測(cè) 大鼠腦梗死72 h后完成神經(jīng)功能評(píng)分，斷頭處死，迅速將取出的腦組織置于-20 ℃冰箱，5 min后置室溫切除嗅球、小腦和低位腦干后，放置于腦槽，切成5個(gè)厚約1.5 mm大腦連續(xù)冠狀切片。然后迅速將腦片置于10 ml、含1% TTC的PBS緩沖溶液中，37 ℃恒溫避光孵育30 min。經(jīng)TTC染色后，正常組織呈玫瑰紅色，梗死組織呈白色。取出腦片多聚甲醛溶液固定過(guò)夜拍照。應(yīng)用IPP 6.0圖像分析系統(tǒng)軟件計(jì)算腦梗死體積，梗死體積百分比(%)=(正常側(cè)大腦半球體積-梗死側(cè)非梗死區(qū)大腦半球體積)/正常側(cè)大腦半球體積×100%，然后Image J軟件進(jìn)行圖片分析。

1.7 腦水腫檢測(cè) 腦梗死后72 h進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分后，每組各取8只大鼠處死。取缺血側(cè)腦組織稱(chēng)濕重，包上錫箔紙，放入100 ℃烤箱中烤48 h，取出腦組織，電子秤測(cè)重量，記為腦組織干重。按照腦組織含水量監(jiān)測(cè)(干濕重法)：(濕重-干重)/濕重×100%。

1.8 Western blot法檢測(cè)腦梗死側(cè)腦組織IL-1β、TNF-α、MMP-9的表達(dá)變化 腦梗死后72 h進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分后，各實(shí)驗(yàn)組分別取8只大鼠腦梗死側(cè)腦組織，加入適量組織裂解液，勻漿后離心(12 000 r/min、10 min)，提取蛋白，進(jìn)行蛋白定量。測(cè)定總蛋白含量，分裝后-20 ℃保存。電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，加入IL-1β、TNF-α、MMP-9一抗，4 ℃孵育過(guò)夜；漂洗3次，每次10 min，分別加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗；室溫孵育1.5 h，PBS漂洗3次，每次5 min；以β-actin作為內(nèi)參照，采用ECL化學(xué)發(fā)光法顯色。最后采用目的蛋白與內(nèi)參灰度比值作為該目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 高壓氧預(yù)處理對(duì)MCAO模型大鼠神經(jīng)功能評(píng)分的影響 與假手術(shù)組比較，模型組和高壓氧預(yù)處理組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分均明顯降低(F=260.54，P<0.05)；高壓氧預(yù)處理組與模型組比較，神經(jīng)功能評(píng)分明顯升高(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 高壓氧預(yù)處理對(duì)腦缺血大鼠神經(jīng)功能評(píng)分的影響

與同一時(shí)間點(diǎn)假手術(shù)組比較：*P<0.05；與同一時(shí)間點(diǎn)模型組比較：#P<0.05

2.2 高壓氧預(yù)處理對(duì)MCAO模型大鼠腦梗死體積的影響 與假手術(shù)組比較，模型組和高壓氧預(yù)處理組大鼠腦梗死體積均明顯升高(F=180.78，P<0.05)；高壓氧預(yù)處理組與模型組比較，大鼠腦梗死體積明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

2.3 高壓氧預(yù)處理對(duì)MCAO模型大鼠腦組織含水量的影響 與假手術(shù)組比較，模型組和高壓氧預(yù)處理組大鼠腦組織含水量均明顯升高(F=126.67，P<0.05)；高壓氧預(yù)處理組與模型組比較，大鼠腦組織含水量明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

2.4 高壓氧預(yù)處理對(duì)MCAO模型大鼠腦組織IL-1β、TNF-α、MMP-9蛋白表達(dá)的影響 與假手術(shù)組比較，模型組和高壓氧預(yù)處理組大鼠腦組織IL-1β、TNF-α、MMP-9表達(dá)均明顯升高(FIL-1=204.06，F(xiàn)TNF-α=235.71，F(xiàn)MMP-9=159.26，P<0.05)；高壓氧預(yù)處理組與模型組比較，大鼠腦組織IL-1β、TNF-α、MMP-9表達(dá)明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

3 討論

高壓氧預(yù)處理是指在高壓的環(huán)境下，提前給予高濃度的氧氣的一種干預(yù)方法。研究[6]證實(shí)高壓氧可減少梗死后缺血、低氧，有神經(jīng)保護(hù)作用。本研究應(yīng)用高壓氧預(yù)處理SD大鼠，建立腦梗死模型后進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，結(jié)果顯示高壓氧預(yù)處理能明顯改善大鼠腦梗死后神經(jīng)功能評(píng)分。TTC染色結(jié)果進(jìn)一步顯示，高壓氧預(yù)處理組腦梗死體積較模型組明顯減少，這與神經(jīng)功能評(píng)分改變的結(jié)果相一致。但高壓氧預(yù)處理保護(hù)神經(jīng)功能的具體機(jī)制仍不明確，可能與抗炎、抗凋亡、抑制氧化應(yīng)激等有關(guān)。

圖2 高壓氧預(yù)處理對(duì)腦缺血大鼠腦梗死體積的影響

與同一時(shí)間點(diǎn)假手術(shù)組比較：*P<0.05；與同一時(shí)間點(diǎn)模型組比較：#P<0.05

圖3 高壓氧預(yù)處理對(duì)腦缺血大鼠腦梗死側(cè)腦水腫的影響

與同一時(shí)間點(diǎn)假手術(shù)組比較：*P<0.05；與同一時(shí)間點(diǎn)模型組比較：#P<0.05

腦水腫是腦梗死最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，可分為細(xì)胞毒性腦水腫和血管源性腦水腫。腦缺血初期主要表現(xiàn)為細(xì)胞毒性腦水腫，隨著病情的發(fā)展，血管內(nèi)皮細(xì)胞功能失調(diào)，血腦屏障破壞，形成血管源性腦水腫。目前臨床上對(duì)腦梗死后腦水腫的治療主要集中于腦水腫形成后的治療，而早期預(yù)防治療研究的較少。本研究應(yīng)用高壓氧預(yù)處理SD大鼠制作腦梗死模型，72 h后利用干濕重法檢測(cè)腦梗死側(cè)腦水腫，結(jié)果顯示高壓氧預(yù)處理可明顯減少腦梗死后腦水腫。

圖4 高壓氧預(yù)處理對(duì)腦缺血大鼠腦梗死側(cè)腦組織IL-1β、TNF-α、MMP-9蛋白表達(dá)的影響

與同一時(shí)間點(diǎn)假手術(shù)組比較：*P<0.05；與同一時(shí)間點(diǎn)模型組比較：#P<0.05

腦梗死發(fā)生后梗死灶周?chē)a(chǎn)生一系列炎癥反應(yīng)[7]，各種炎性因子得以釋放，導(dǎo)致白細(xì)胞在缺血區(qū)聚集，活化的白細(xì)胞可釋放大量的氧自由基、蛋白水解酶等物質(zhì)，此類(lèi)物質(zhì)可進(jìn)一步損傷血管，引起血管通透性升高，加重腦水腫的發(fā)生。在炎性級(jí)聯(lián)反應(yīng)中，IL-1β和TNF-α起重要作用。IL-1β屬于白細(xì)胞介素，可通過(guò)吸引白細(xì)胞，引起炎癥介質(zhì)的釋放，促發(fā)炎癥反應(yīng)。TNF-α是腫瘤壞死因子，其可以促進(jìn)T細(xì)胞產(chǎn)生各種炎癥因子，進(jìn)而促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生。研究[8]顯示，在MCAO模型中，高壓氧預(yù)處理可通過(guò)抑制炎癥因子IL-1β和TNF-α的表達(dá)減輕炎癥反應(yīng)。

MMP是基質(zhì)金屬蛋白酶類(lèi)，其是一類(lèi)鋅依賴(lài)中性蛋白酶家族，有降解細(xì)胞外基質(zhì)作用[9]。MMP-9是MMP家族的主要成員，可由血管內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞合成，并以無(wú)活性酶原形式分泌。MMP-9在腦血管基底膜的降解中起重要作用。腦血管基底膜含有層黏連蛋白、硫酸乙酰肝素等，其大多數(shù)是MMP-9的底物[10]。已有研究[11]利用基因敲除的方法證實(shí)MMP-9基因缺失可引起血腦屏障的破壞。在正常腦組織內(nèi)，MMP-9只有低水平的表達(dá)，在炎性反應(yīng)促發(fā)下，由膠質(zhì)細(xì)胞、白細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等分泌到細(xì)胞外間隙，可由氧自由基、血紅蛋白降解產(chǎn)物等激活，而降解腦血管基底膜成分，導(dǎo)致血腦屏障通透性增加，加重腦水腫。研究[12]證實(shí)，炎癥因子IL-1β和TNF-α的釋放可激活MMP-9，破壞血腦屏障，促使血管通透性升高。

推測(cè)高壓氧預(yù)處理可以通過(guò)抑制炎性介質(zhì)的釋放，降低血腦屏障通透性，減輕腦梗死后的腦水腫。本研究結(jié)果表明，大鼠腦梗死后梗死灶周?chē)鶬L-1β、TNF-α的水平明顯升高，提示腦梗死后其表達(dá)明顯上調(diào)。高壓氧預(yù)處理組與模型組比較，高壓氧預(yù)處理明顯降低了IL-1β、TNF-α、MMP-9的表達(dá)，同時(shí)減輕腦梗死后的腦水腫。推測(cè)高壓氧預(yù)處理可能在一定程度上通過(guò)抑制IL-1β、TNF-α的表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)，進(jìn)而抑制MMP-9的激活，降低血腦屏障的通透性，減輕了腦水腫。

綜上所述，高壓氧預(yù)處理減輕腦梗死后腦水腫的機(jī)制可能與抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)，本研究為臨床上應(yīng)用高壓氧治療腦梗死后腦水腫提供一定的理論依據(jù)。

[1] Campbell B C, Meretoja A, Donnan G A,et al.Twenty-year history of the evolution of stroke thrombolysis with intravenous alteplase to reduce long-term disability[J].Stroke, 2015 ,46(8):2341-6.

[2] Bian H,Hu Q,Ling X,et al.Hyperbaric oxygen preconditioning attenuates hemorrhagic transformation through increasing PPARγ in hyperglycemic MCAO rats[J].Exp Neurol,2015,265:22-9.

[3] Mu J, Ostrowski R P, Soejima Y,et al.Delayed hyperbaric oxygen therapy induces cell proliferation through stabilization of cAMP responsive element binding protein in the rat model of MCAo-induced ischemic brain injury [J].Neurobiol Dis,2013,51:133-43.

[4] Hu Q,Ma Q, Zhan Y,et al.Isoflurane enhanced hemorrhagic transformationby impairing antioxidant enzymes in hyperglycemic rats with middle cerebral artery occlusion [J].Stroke,2011,42(6):1750-6.

[5] Chen J，Li Y，Wang L,et a1.Therapeutic benefit of intravenous administration of bone marrow stromal cells after cerebral ischemia in rats[J].Stroke,2001,32(4):1005-11.

[6] 劉 北，李淑云.高壓氧治療急性腦梗死的臨床療效及其腦保護(hù)機(jī)制[J].山東醫(yī)藥，2013,53(41)：62-4.

[7] 陳海波.孕酮對(duì)腦損傷神經(jīng)保護(hù)作用的研究現(xiàn)狀[J].安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2011,46(9)：967-8.

[8] Soejima Y, Ostrowski R P, Manaenko A,et al.Hyperbaric oxygen preconditioning attenuates hyperglycemia enhanced hemorrhagic transformation after transient MCAO in rats[J].Med Gas Res,2012,2(1):9.

[9] 陳玉姣, 歐陽(yáng)晴晴,王 然 ,等.腫瘤壞死因子-α對(duì)骨髓源性肥大細(xì)胞表達(dá)MMP-3、MMP-9、IL-17的影響[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2015,35(11):1633-7.

[10]Yabluchanskiy A,Ma Y,Iyer R P,et al.Matrix metalloproteinase-9: Many shades of function in cardiovascular disease[J].Physiology(Bethesda),2013,28(6):391-403.

[11]Gursoy-Ozdemir Y,Qiu J,Matsuoka N,et a1.Cortical spreading depression activates and upregulates MMP-9[J].J Clin Invest,2004,113(10):1447-55.

[12]Soejima Y,Hu Q,Krafft P R,et al.Hyperbaric oxygen preconditioning attenuates hyperglycemia-enhanced hemorrhagic transformation by inhibiting matrix metalloproteinases in focal cerebral ischemia in rats[J].Exp Neurol,2013, 247:737-43.

Effect and mechanism for hyperbaric oxygen preconditioning to cerebral edema after infarction

Bian Hetao ,Chu Jianfeng

(DeptofNeurology,JiningClinicalCollegeofAnhuiMedicalUniversity,JiningFirstPeople’sHospital,Jining272000)

Objective To observe the effect of hyperbaric oxygen preconditioning to cerebral edema and possibility mechanism. Methods 96 male rats were randomly divided into sham-operated group, model group and hyperbaric oxygen preconditioning group. Focal cerebral ischemia rat models were established by occluding the middle cerebral artery(MCAO). Neurological grades were tested 24 h,72 h after ischemia; infarct size was measured by TTC staining; the brain W/D was detected; expressions of interleukin-1β(IL-1β), tumor necrosis factior-α(TNF-α), matrix metalloproteinase 9(MMP-9) were detected by Western blot. Results As compared with those in the model group, hyperbaric oxygen preconditioning had significantly improved neurological scores at ischemia 24 h and 72 h(P<0.05). After ischemia 72 h, hyperbaric oxygen preconditioning group had significantly reduced brain infarct size and brain water content as compared with the model group(P<0.05). Hyperbaric oxygen preconditioning group had significantly reduced expressions of IL-1β, TNF-α, MMP-9 as compared with the model group(P<0.05). Conclusion Hyperbaric oxygen preconditioning significantly inhibites the expression of IL-1β,TNF-α,MMP-9 and maintains the integrity of blood brain barrier, thus, reduces the brain water content.

cerebral infarction；hyperbaric oxygen；cerebral edema；MMP-9

時(shí)間：2016-8-10 11:04:48

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160810.1104.011.html

2016-05-30接收

國(guó)家自然科學(xué)基金(編號(hào)：81301012)；濟(jì)寧市醫(yī)藥衛(wèi)生科技項(xiàng)目(編號(hào)：2013jnwk26)

安徽醫(yī)科大學(xué)濟(jì)寧臨床學(xué)院(濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院)神經(jīng)內(nèi)科，濟(jì)寧 272000

卞合濤，男，碩士，醫(yī)師；

初建峰，男，碩士，副主任醫(yī)師，責(zé)任作者，E-mail:hetaobian@163.com

R 743.33

A

1000-1492(2016)10-1445-05

10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2016.10.011