生秀梅，陳 龍，王正新

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glipr1基因的原核表達(dá)及多克隆抗體制備

生秀梅1,2，陳 龍1，王正新2

目的 克隆表達(dá)膠質(zhì)瘤致病相關(guān)蛋白1基因(glipr1)并制備多克隆抗體，運(yùn)用該抗體檢測各腫瘤細(xì)胞系中GLIPR1的表達(dá)。方法 通過PCR技術(shù)以含glipr1基因的cDNA克隆質(zhì)粒(pLX304-glipr1)為模板獲得glipr1(M)片段，再將此片段克隆至表達(dá)載體pET-15b上，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21-CodonPlus(DE3)進(jìn)行表達(dá)；Ni柱純化后的GLIPR1(M)蛋白作為抗原免疫家兔，獲得多克隆抗體，Western blot法檢測其特異性，并檢測GLIPR1在A549、PC14、LNCaP、PC3及U87細(xì)胞中的表達(dá)。結(jié)果 成功構(gòu)建了表達(dá)載體pET-15b-glipr1(M)，并獲得了純化的GLIPR1(M)蛋白，成功制備了兔抗GLIPR1多克隆抗體，特異性高，可用于檢測各細(xì)胞系中GLIPR1的表達(dá)，GLIPR1在U87中的表達(dá)最高。結(jié)論 成功表達(dá)了GLIPR1(M)蛋白，并獲得了多克隆抗體，為進(jìn)一步研究GLIPR1的功能和作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

GLIPR1；蛋白表達(dá)；多克隆抗體

膠質(zhì)瘤致病相關(guān)蛋白1基因(glipr1)是從膠質(zhì)細(xì)胞瘤中克隆出來的新基因[1-2]。GLIPR1蛋白有一段信號肽和一段跨膜區(qū)段，在結(jié)構(gòu)上與PR-1(group 1 plant pathogenesis-related proteins)同源[3-4]。研究[1-2，5-6]表明GLIPR1高表達(dá)與髓單核細(xì)胞的分化有關(guān)，神經(jīng)膠質(zhì)瘤和星形細(xì)胞瘤發(fā)病過程中，GLIPR1的表達(dá)顯著增加。亦有報(bào)道[7-9]指出GLIPR1是p53靶基因，其過表達(dá)可誘導(dǎo)前列腺癌、結(jié)腸癌的細(xì)胞凋亡。前期研究[10]顯示GLIPR1高表達(dá)抑制肺癌細(xì)胞的生長，但其機(jī)制尚不明確。該實(shí)驗(yàn)通過原核表達(dá)GLIPR1蛋白的抗原性區(qū)段(去除信號肽及跨膜后區(qū)段)，制備其兔多克隆抗體，為進(jìn)一步研究腫瘤細(xì)胞中GLIPR1的表達(dá)、分布規(guī)律，以及參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞生長的具體機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 原核表達(dá)質(zhì)粒pET-15b、E.coliBL21-CodonPlus(DE3)感受態(tài)細(xì)胞、A549細(xì)胞，LNCaP細(xì)胞、PC14細(xì)胞及U87細(xì)胞由克拉克亞特蘭大學(xué)腫瘤研究與治療發(fā)展中心保存。人glipr1基因cDNA克隆 (HsCD00441029) 購自美國DNASU公司。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的獲得 根據(jù)GenBank注冊的GLIPR1序列(HQ447422)設(shè)計(jì)并合成上下游引物GLIPR1-NOSIG-F和GLIPR1-NOTM-R，分別在上下游引物的5′端加接Nde I和BamHⅠ酶切位點(diǎn)序列， 引物序列為：GLIPR1- NOSIG-F:5′-GGAATTCCATATGGCAAATATTTTGCCAGATATCG-3′(下劃線為Nde I酶切位點(diǎn))，GLIPR1-NOTM-R:5′-CGGGATCCTTATCTGTTACGTGGATATATGGGCC-3′(下劃線為BamHⅠ酶切位點(diǎn))。以含有g(shù)lipr1基因的cDNA克隆質(zhì)粒(pLX304-glipr1)為模板，以GLIPR1-NOSIG-F和GLIPR1-NOTM-R為引物，利用高保真DNA聚合酶pfu對目的基因進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增片段為glipr1基因去除N末端信號肽序列和去除自跨膜區(qū)段開始C末端序列的區(qū)段，即glipr1基因的55～711 bp部分，在上游引物加上起始密碼子ATG，用glipr(M)表示。

1.2.2 重組表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定 膠回收PCR產(chǎn)物和表達(dá)載體pET-15b 經(jīng)Nde I和BamHⅠ雙酶切后，PCR酶切產(chǎn)物經(jīng)酚仿-乙醇法純化后與膠回收的pET-15b載體酶切產(chǎn)物用T4DNA連接酶室溫連接過夜，將連接產(chǎn)物熱激轉(zhuǎn)化入E.coliBL21-CodonPlus (DE3)感受態(tài)細(xì)胞，次日從平板上挑取12個(gè)菌落接種于含氨芐西林的LB平板上，37 ℃培養(yǎng)8 h后，將上述菌體和空載體轉(zhuǎn)化菌體收集于含30 μl蒸餾水的EP管中，再加入等體積的酚/氯仿/異戊醇(25 ∶24 ∶1) 混合液，在振蕩器上劇烈振蕩，離心(12 000 r/min、2 min)后取10 μl上清液，用0.7%瓊脂糖凝膠電泳觀察質(zhì)粒大小，初步篩選陽性克隆質(zhì)粒，提取初篩陽性克隆質(zhì)粒經(jīng)過PCR和雙酶切驗(yàn)證后，通過DNA測序分析最終確認(rèn)。

1.2.3 重組蛋白的表達(dá) 分別挑取含重組質(zhì)粒pET-15b-glipr1(M)和空質(zhì)粒pET-15b的E.coliBL21-CodonPlus(DE3)單菌落于2 ml LB液體培養(yǎng)基中(氨芐西林100 μg/ml)，37 ℃振搖過夜。次日以1 ∶100比例轉(zhuǎn)接入20 ml的LB培養(yǎng)液中，37 ℃振搖至吸光度(optical density，OD)值OD600為0.6，加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，30 ℃振搖4 h，冰浴10 min后收集菌體，洗滌后用500 μl PBS緩沖液重懸菌液，取出100 μl用于全菌蛋白電泳，剩余菌液4 ℃超聲破碎，離心(12 000 r/min、15 min、4 ℃)，取全菌、上清液和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳。

1.2.4 重組蛋白純化 因GLIPR1(M)蛋白主要存在于包涵體，用5 ml 平衡緩沖液(100 mmol/L NaH2PO4、10 mmol/L Tris-Cl、8 mol/L urea， pH 8.0)重懸包涵體，混勻后冰浴30 min。冰浴過程中超聲裂解細(xì)菌(加入蛋白酶抑制劑1 mmol/L PMSF)。4 ℃、12 000 r/min離心20 min，收集上清液。上清液移入塑料離心管中，加入1 ml的NTA-Ni2+柱，不間斷輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)，室溫2 h。將上述混合物轉(zhuǎn)移到5 ml 注射器中，事先用濾紙封住底部。拔掉注射器針頭讓液體可以順利流出。加入洗脫緩沖液 (100 mmol/L NaH2PO4、10 mmol/L Tris-Cl、 8 mol/L urea， pH 6.3)洗滌液，去除雜蛋白，當(dāng)流出洗滌液OD280<0.01時(shí)，向 NTA-Ni2+柱中加入1 ml洗脫液洗脫4～5次，收集洗脫液，測蛋白濃度。SDS-PAGE 檢測純化后蛋白的純度。

1.2.5 GLIPR1(M)的抗原性分析 利用antherprot[11]軟件按照Parker et al[12]報(bào)道的方法對GLIPR1(M)進(jìn)行抗原性分析。

1.2.6 兔抗GLIPR1(M)蛋白多克隆抗體的制備 用純化的GLIPR1(M)蛋白作為免疫原，與等體積的弗氏完全佐劑充分研磨至完全乳化，每只家兔以1 ml乳化的免疫原，背部皮下多點(diǎn)注射法免疫家兔。初次免疫前采集兔耳緣靜脈血液，取血清作陰性對照，第1次免疫后每隔2周免疫家兔，共免疫4次，末次免疫1周后頸動(dòng)脈放血并獲得抗血清，用半飽和硫酸銨鹽析法和透析除鹽法獲得粗提的多克隆抗體，分裝保存于-20 ℃。

1.2.7 Western blot法驗(yàn)證GLIPR1抗體 以每泳道2 μg GLIPR1(M)抗原蛋白進(jìn)行12% SDS-PAGE凝膠電泳，電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，將轉(zhuǎn)膜后的PVDF膜用含3%的脫脂奶粉的TBST封閉1 h后，分別用上述anti-GLIPR1以1 ∶500、1 ∶1 000、1 ∶2 000、1 ∶10 000及購自Abnova 公司(臺(tái)灣)的GLIPR1抗體和對應(yīng)的二抗進(jìn)行免疫標(biāo)記，ECL化學(xué)發(fā)光試劑A、B液1 ∶1混勻，覆蓋于PVDF膜的蛋白面，全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光驗(yàn)證GLIPR1抗體。

1.2.8 Western blot法檢測GLIPR1在各腫瘤細(xì)胞系中的表達(dá) 收集A549、PC14、U87、PC3及LNCaP細(xì)胞，用蛋白裂解液裂解后離心(12 000 r/min、10 min、4 ℃)取上清液，測定濃度后，以各泳道5 μg進(jìn)行12% SDS-PAGE凝膠電泳，用1 ∶2 000 的anti-GLIPR1和對應(yīng)的二抗進(jìn)行免疫標(biāo)記，檢測A549、PC14、U87、PC3及LNCaP細(xì)胞中GLIPR1的表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒pET-15b-glipr1(M)的構(gòu)建 以含有g(shù)lipr1基因的cDNA克隆質(zhì)粒(pLX304-glipr1)為模板，以GLIPR1-NOSIG-F和GLIPR1-NOTM-R為引物，PCR擴(kuò)增獲得約657 bp的DNA片段，該片段為glipr1基因去除N末端信號肽序列和去除自跨膜區(qū)段開始C末端序列的區(qū)段(圖1A)，命名為glipr1(M)。將此片段回收、酶切后插入pET-15b構(gòu)建成表達(dá)載體pET-15b-glipr1(M)，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliBL21-CodonPlus(DE3)，挑取單克隆，提取質(zhì)粒，經(jīng)Nde Ⅰ和BamHⅠ雙酶切驗(yàn)證，證明重組質(zhì)粒pET-15b-glipr1(M)構(gòu)建成功(圖1B)。

圖1 重組表達(dá)質(zhì)粒pET-15b-glipr1(M)的構(gòu)建和鑒定

A：glipr1(M)基因PCR產(chǎn)物；1：PCR產(chǎn)物；M：1 000 bp plus DNA Ladder；B：pET-15b-glipr1(M)重組質(zhì)粒酶切鑒定；M：1 000 bp plus DNA Ladder；1：pET-15b-glipr1(M)酶切結(jié)果

2.2 重組GLIPR1(M)蛋白的表達(dá)與純化 表達(dá)載體pET-15b-glipr1(M)轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主菌E.coliBL21-CodonPlus(DE3)中，37 ℃振搖至OD600為0.6后，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)4 h，超聲裂解細(xì)菌分別制備全菌蛋白、可溶性上清液和沉淀蛋白樣品，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。結(jié)果表明pET-15b-glipr1(M)在大腸埃希菌E.coliBL21-CodonPlus(DE3)中成功表達(dá)，但主要以包涵體形式存在(圖2)。通過利用Ni柱親和純化后，產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳分析表明經(jīng)過純化后的GLIPR1(M)蛋白純度較高，可用于兔抗GLIPR1(M)蛋白的多克隆抗體制備(圖3)。

圖2 SDS-PAGE鑒定重組GLIPR1(M)蛋白

M：寬范圍彩色預(yù)染蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)；A：空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌全菌蛋白；B：空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌上清液；C：空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌包涵體；D：重組表達(dá)菌全菌蛋白；E：重組表達(dá)菌上清；F：重組表達(dá)菌包涵體

圖3 重組GLIPR1(M)蛋白的純化

M：寬范圍蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)；A：切膠純化后的GLIPR1(M)蛋白；B～G：Ni柱親和純化后的GLIPR1(M)蛋白

2.3 兔抗GLIPR1(M)蛋白的多克隆抗體制備 應(yīng)用antherprot軟件對GLIPR1(M)蛋白進(jìn)行抗原性分析，證明GLIPR1(M)蛋白抗原性預(yù)測值較高，可用于制備抗GLIPR1抗體。將抗GLIPR1蛋白的抗血清以1 ∶500、1 ∶1 000、1 ∶2 000及1 ∶10 000倍比稀釋作為一抗，GLIPR1抗體1 ∶1 000為陽性對照，以純化的GLIPR1(M)蛋白為檢測對象，進(jìn)行Western blot分析。結(jié)果表明抗GLIPR1(M)蛋白的抗血清在24 ku處能檢測到符合預(yù)期大小的條帶，且最低效價(jià)為1 ∶10 000，適宜的Westem blot使用效價(jià)為1 ∶2 000(圖4)。

圖4 Western blot檢測抗GLIPR1抗體的特異性

A：1 ∶10 000；B：1 ∶2 000；C：1 ∶1 000；D：1 ∶500 ；E：1 ∶1 000 GLIPR1抗體與2 μg GLIPR1(M)抗原蛋白

2.4 抗GLIPR1抗體檢測GLIPR1在各細(xì)胞系中的表達(dá) 為了進(jìn)一步考察該多克隆抗體是否可用于檢測細(xì)胞系中GLIPR1的表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)用1 ∶2 000的anti-GLIPR1和對應(yīng)的二抗進(jìn)行免疫標(biāo)記，Western blot法檢測了A549、PC14、U87、PC3及LNCaP細(xì)胞中GLIPR1的表達(dá)。GLIPR1(全長約為30 ku)在人惡性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U87細(xì)胞中表達(dá)最高，前列腺癌PC3中亦有表達(dá)，A549細(xì)胞中只有微量表達(dá)，而PC14和LNCaP細(xì)胞并未檢測到GLIPR1蛋白。表明本實(shí)驗(yàn)制備的抗GLIPR1抗體適用于后期Western blot分析。見圖5。

圖5 GLIPR1在A549、PC14、LNCaP、PC3及U87細(xì)胞中的表達(dá)

3 討論

膠質(zhì)瘤致病相關(guān)蛋白1(GLIPR1)又稱為RTVP-1，是富含半胱氨酸分泌蛋白家族CAP的一員[3]。早期作為原癌基因被發(fā)現(xiàn)于人神經(jīng)膠質(zhì)瘤中[1]。星形腦惡性腫瘤中GLIPR1的表達(dá)較高，其表達(dá)水平與星形細(xì)胞腫瘤的惡性程度呈正相關(guān)性[1-2,6]。GLIPR1的高表達(dá)促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的增殖、存活、侵襲及轉(zhuǎn)移[6]。腎母細(xì)胞瘤中GLIPR1亦作為原癌基因發(fā)揮功能[13]。但是，在前列腺癌細(xì)胞中，GLIPR1表達(dá)較低，為p53調(diào)節(jié)基因，GLIPR1的高表達(dá)可產(chǎn)生活性氧，從而導(dǎo)致多種前列腺腫瘤細(xì)胞系的凋亡[14]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究[10]顯示肺癌細(xì)胞中GLIPR1的mRNA水平亦很低，其高表達(dá)會(huì)導(dǎo)致A549細(xì)胞的死亡。GLIPR1在不同細(xì)胞系中的表達(dá)差異和功能差異引起了注意，為進(jìn)一步研究GLIPR1的功能和機(jī)制，本研究克隆表達(dá)了GLIPR1(M)蛋白，并制備了兔抗重組蛋白的多克隆抗體，特異性高。同時(shí)，本研究運(yùn)用該抗體通過Western blot法檢測了A549、PC14、U87、PC3及LNCaP細(xì)胞中GLIPR1的表達(dá)。與前期研究[1-2,6]報(bào)道一致，人惡性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U87細(xì)胞中GLIPR1的表達(dá)最高，前列腺癌PC3中亦有表達(dá)，這與本研究結(jié)果GLIPR1在PC3中執(zhí)行雙重功能一致，即低濃度的GLIPR1有利于PC3的生長，而高濃度的PC3則抑制PC3的增殖。A549、PC14和LNCaP細(xì)胞中GLIPR1的表達(dá)較低，與GLIPR1在這些細(xì)胞中發(fā)揮抑癌功能相符[7-9,14-16]。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)成功制備了高效特異的抗GLIPR1多克隆抗體，為進(jìn)一步研究的功能和機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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Prokaryotic expression and polyclonal antibody preparation ofglipr1 gene

Sheng Xiumei1,2, Chen Long1, Wang Zhengxin2

(1DeptofBiochemistry,SchoolofMedicine,JiangsuUniversity,Zhenjiang212013；2CenterforCancerResearchandTherapeuticDevelopment,DeptofBiologicalSciences,ClarkAtlantaUniversity,Atlanta,GA30314)

ObjectiveTocloneandexpressgliomapathogenesis-relatedprotein1gene,andpreparetheanti-GLIPR1polyclonalantibody.Useanti-GLIPR1tochecktheexpressionofGLIPR1insomecancercelllines.Methods

GLIPR1;protein expression;polyclonal antibody

時(shí)間：2016-8-10 11:04:48

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160810.1104.009.html

2016-06-02接收

江蘇大學(xué)高級專業(yè)人才科研啟動(dòng)基金(編號：11JDG063)；國家博士后科學(xué)基金(編號：2015M571702)

1江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院生化教研室，鎮(zhèn)江 212013

2The Center for Cancer Research and Therapeutic Development, Dept of Biological Sciences, Clark Atlanta University, Atlanta, GA 30314

生秀梅，女，副教授,博士研究生；

王正新，男，教授，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：zwang@cau.edu

R 34；Q 78

A

1000-1492(2016)10-1436-05

10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2016.10.009

cDNA clone plasmids(pLX304-glipr1) were used as template to amplify theglipr1(M) fragment by PCR. The fragment was cloned into the pET-15b vector and expressed inE.coliBL21-CodonPlus(DE3). The GLIPR1(M) protein was purified by Ni affinity chromatography and was used as antigen to prepare polyclonal antibody. Western blot analysis was used to check the specificity of the antibody and detect the expression of GLIPR1 in A549, PC14, LNCaP, PC3 and U87 cells.Results Expression vector pET-15b-glipr1(M) was successfully constructed, and the purified GLIPR1(M) protein was obtained, the polyclonal anti-GLIPR1 antibody was successfully prepared and could be used to check the expression of GLIPR1 in cancer cell lines. GLIPR1 was highly expressed in U87 cells.Conclusion The GLIPR1(M) protein and the polyclonal anti-GLIPR1 antibody are successfully prepared, which lays the foundation for the research of GLIPR1 function mechanism.