周 娟，劉 琛，顧 芳，趙夢(mèng)靜，楊 雪，王 晶，秦宜德

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乳源免疫調(diào)節(jié)肽提高DDP對(duì)卵巢癌細(xì)胞的影響

周 娟1，劉 琛1，顧 芳1，趙夢(mèng)靜1，楊 雪1，王 晶2，秦宜德1

目的 觀察體外實(shí)驗(yàn)中乳源免疫調(diào)節(jié)肽(PGPIPN)與抗癌藥物順鉑(DDP)聯(lián)合用藥對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖和遷移的影響。方法MTS檢測(cè)DDP聯(lián)合PGPIPN對(duì)原代卵巢癌細(xì)胞增殖抑制情況，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DDP聯(lián)合PGPIPN對(duì)原代卵巢癌細(xì)胞凋亡率和周期的影響，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力。結(jié)果MTS實(shí)驗(yàn)表明PGPIPN聯(lián)合DDP處理組對(duì)卵巢癌細(xì)胞抑制率顯著高于單獨(dú)用DDP組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且呈劑量和時(shí)間依賴(lài)性。流式細(xì)胞術(shù)顯示PGPIPN可以協(xié)同DDP促進(jìn)人原代卵巢癌細(xì)胞的凋亡，并使得腫瘤細(xì)胞停滯于G0/G1期。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)顯示聯(lián)合用藥明顯抑制細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力，與單獨(dú)用藥差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論P(yáng)GPIPN可以提高DDP對(duì)原代卵巢癌細(xì)胞的作用。

人原代卵巢癌細(xì)胞；聯(lián)合用藥；免疫調(diào)節(jié)肽；順鉑

卵巢癌是死亡率最高的婦科惡性腫瘤，其發(fā)病率位于女性生殖道惡性腫瘤的前列[1-2]?，F(xiàn)有的治療主要是手術(shù)和化療兩種方式，但化療很容易出現(xiàn)耐藥性，進(jìn)而治療效果逐漸降低，導(dǎo)致患者死亡率增高。如何增強(qiáng)卵巢癌對(duì)化療藥物的敏感性逐漸成為新的研究方向。乳源免疫調(diào)節(jié)肽(Pro-Gly-Pro-Ile-Pro-Asn，PGPIPN)來(lái)源于牛乳β-酪蛋白的 63～68氨基酸殘基上的六肽，是一種典型的免疫調(diào)節(jié)肽。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究[3-4]顯示PGPIPN可以抑制卵巢癌細(xì)胞SKVO3的侵襲和轉(zhuǎn)移，并促進(jìn)其凋亡。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[5-6]顯示PGPIPN具有提高機(jī)體免疫力、促進(jìn)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化、抗氧化等作用。該研究基于前期研究的基礎(chǔ)上，通過(guò)PGPIPN與DDP聯(lián)合用藥對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖和遷移的影響來(lái)觀察PGPIPN是否能改善卵巢癌對(duì)DDP的耐藥性，為臨床提高化療敏感性提供新的研究方向。

1 材料與方法

1.1 人卵巢癌組織 取自安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科手術(shù)室。

1.2 材料 純度為99.6%的PGPIPN由上海生工公司合成；McCoy′s5AMedium培養(yǎng)基(美國(guó)Sigma公司)；小牛血清(杭州四季青公司)；順鉑(江蘇諾欣藥業(yè)公司)；CellTiter96AQueous單溶液細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒(MTS) (普洛麥格北京生物技術(shù)有限公司)；PI單染周期檢測(cè)試劑盒(江蘇碧云天公司)；AnnexinV/PI雙染凋亡試劑盒(上海貝博公司)。

1.3 方法

1.3.1 原代細(xì)胞培養(yǎng) 卵巢癌手術(shù)結(jié)束后盡快用預(yù)冷的含10%血清DMEM培養(yǎng)基運(yùn)送至細(xì)胞房，用預(yù)冷無(wú)菌PBS緩慢沖洗癌組織塊上的血細(xì)胞。無(wú)菌操作下將組織塊用無(wú)菌眼科剪剪成1mm×1mm×1mm左右，無(wú)菌操作下轉(zhuǎn)移至無(wú)菌50ml試管中，加入1.5%的胰蛋白酶，消化40～50min后，800r/min離心5min，棄上清液。將消化結(jié)束后的組織塊用含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基吹打混勻后種于6孔板中放于37 ℃、5%CO2溫箱培養(yǎng)。48h后將未貼壁的組織用PBS沖洗去除，貼壁的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)至匯合率為70%～80%，傳代后進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 免疫熒光法鑒定細(xì)胞 將滅菌后的蓋玻片放在6孔板孔底部，將原代細(xì)胞種于6孔板中制成細(xì)胞爬片，放于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。棄去培養(yǎng)基，PBS洗3次，4%多聚甲醛固定細(xì)胞20min后，PBS洗3次，加入0.7%的Triton-100通透10min后，PBS洗3遍，10%羊血清封閉30min，PBS洗3遍后，加入一抗CK7(1 ∶200)，4 ℃過(guò)夜，PBS洗3遍，加入熒光二抗(1 ∶100) ，37 ℃避光孵育2h，避光下PBS洗3遍，避光下DAPI染10min，PBS洗3遍后將細(xì)胞爬片進(jìn)行封片，立即在熒光顯微鏡下觀察。

1.3.3MTS檢測(cè)聯(lián)合用藥對(duì)人原代卵巢癌細(xì)胞增值的影響 原代細(xì)胞消化離心后制備成細(xì)胞懸液按照每孔1 500個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中，培育過(guò)夜。分為5組加藥：正常對(duì)照組、10μg/mlDDP、10μg/mlDDP+10-6mg/mlPGPIPN、10μg/mlDDP+10-4mg/mlPGPIPN、10μg/mlDDP+10-2mg/mlPGPIPN，每組復(fù)孔5個(gè)，分別培養(yǎng)24、48、72h后，每孔加入20μlMTS放于37 ℃溫箱繼續(xù)孵育4h。用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔的490nm的吸光度(opticaldensity，OD)值(OD490nm)，以正常對(duì)照組計(jì)算用藥組的生長(zhǎng)抑制率。計(jì)算公式為：抑制率(%)=(1-OD實(shí)驗(yàn)組/OD正常對(duì)照組)×100%。

1.3.4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 原代細(xì)胞消化離心計(jì)數(shù)后每孔1×106接種于6孔板中，培養(yǎng)至細(xì)胞完全匯合后，用200μl的移液器槍頭在6孔板每孔中央的縱軸和橫軸方向劃一個(gè)十字線。用PBS洗2遍后分為5組加藥：正常對(duì)照組(3%血清培養(yǎng)基)、8μg/mlDDP、8μg/mlDDP+10-6mg/mlPGPIPN、8μg/mlDDP+10-4mg/mlPGPIPN、8μg/mlDDP+10-2mg/mlPGPIPN(藥物均用3%血清培養(yǎng)基稀釋)。在0、12、24、36h分別于倒置顯微鏡下觀察并拍照。用QuantityOne軟件對(duì)細(xì)胞的遷移距離進(jìn)行測(cè)量，分別測(cè)3條線的寬度，取其平均值，計(jì)算遷移距離，其計(jì)算公式為：遷移距離(mm)=0h起始距離-各時(shí)間段的距離。

1.3.5AnnexinV/PI雙染檢測(cè)細(xì)胞的凋亡 原代細(xì)胞消化離心計(jì)數(shù)后每孔1×106接種于6孔板中培養(yǎng)過(guò)夜，分為5組加藥，分組同1.3.3。培養(yǎng)48h后，用不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞后用預(yù)冷的PBS洗滌2次。每管加入300μlBindingBuffer和4μlAnnexinV-FITC懸浮細(xì)胞，4 ℃避光孵育15min后加入 7.5μlPI，5min后在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果用FlowJo7.6.1軟件進(jìn)行分析。

1.3.6PI單染檢測(cè)細(xì)胞的周期原代細(xì)胞消化 離心計(jì)數(shù)后每孔1×106接種于6孔板中培養(yǎng)過(guò)夜，分為5組加藥，分組同1.3.3，用藥48h后收集細(xì)胞。冷PBS洗滌2次后用70%酒精4 ℃固定過(guò)夜。固定結(jié)束后用冷PBS洗滌2次，每管加入16μlPI染色液、6μlRNaseA、300μl染色緩沖液，充分混勻后37 ℃避光孵育30min后在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果用MFLT.32軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞鑒定 組織消化法培養(yǎng)原代卵巢癌細(xì)胞48h，去除未貼壁的組織后，在倒置顯微鏡下的形態(tài)見(jiàn)圖1A。將原代細(xì)胞制備成細(xì)胞爬片后，用特異性抗體CK7、有FITC的二抗鑒定細(xì)胞，細(xì)胞純度通過(guò)以DAPI染色所得細(xì)胞核為準(zhǔn)來(lái)計(jì)算。在熒光顯微鏡下可見(jiàn)：由于卵巢癌細(xì)胞表達(dá)CK7可見(jiàn)綠色熒光，細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光,見(jiàn)圖1。原代組織培養(yǎng)所得的細(xì)胞為卵巢癌細(xì)胞，且純度較高(96.8%)。

圖1 原代細(xì)胞鑒定 ×100

A：組織消化法培養(yǎng)原代卵巢癌細(xì)胞(箭頭所指為組織塊)；B：DAPI；C：FITC；D：B和C圖疊加

2.2 聯(lián)合用藥對(duì)人原代卵巢癌細(xì)胞的增殖的影響 實(shí)驗(yàn)通過(guò)不同濃度的PGPIPN與相同濃度的DDP共同作用于人原代卵巢癌細(xì)胞，結(jié)果顯示細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率隨著PGPIPN濃度的遞增而逐漸增高(F=203.84)，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增高(F=4 848.20)。以不加藥的正常對(duì)照組計(jì)算生長(zhǎng)抑制率并繪制曲線圖。聯(lián)合用藥組與DDP單獨(dú)用藥組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 MTS檢測(cè)聯(lián)合用藥對(duì)人原代卵巢癌細(xì)胞的增殖影響

A：10μg/mlDDP；B：10μg/mlDDP+10-6mg/mlPGPIPN；C：10μg/mlDDP+10-4mg/mlPGPIPN；D：10μg/mlDDP+10-2mg/mlPGPIPN；與10μg/mlDDP組比較：*P<0.05,**P<0.01

圖3 不同濃度PGPIPN聯(lián)合的DDP對(duì)人原代卵巢癌細(xì)胞遷移的影響 ×100

A：正常對(duì)照組；B：8μg/mlDDP；C：8μg/mlDDP+10-6mg/mlPGPIPN；D：8μg/mlDDP+10-4mg/mlPGPIPN；E：8μg/mlDDP+10-2mg/mlPGPIPN；1：0h；2：12h；3：24h；4：36h

圖4 人原代卵巢癌細(xì)胞遷移距離與8 μg/ml DDP組比較：*P<0.05,**P<0.01

2.3 聯(lián)合用藥對(duì)細(xì)胞遷移的影響 不同濃度的PGPIPN與相同濃度的DDP共同作用于人原代卵巢癌細(xì)胞，結(jié)果顯示細(xì)胞的遷移距離隨著PGPIPN濃度的遞增而逐漸減低(12h：F=13.35；24h：F=11.64；36h：F=15.30)。顯微鏡下結(jié)果見(jiàn)圖3。以0h為起始距離計(jì)算遷移距離，與8μg/mlDDP組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖4。結(jié)果表明，PGPIPN可以促進(jìn)DDP抑制人原代卵巢癌細(xì)胞遷移。

2.4 聯(lián)合用藥對(duì)細(xì)胞凋亡的影響 實(shí)驗(yàn)通過(guò)不同濃度的PGPIPN與相同濃度的DDP共同作用于人原代卵巢癌細(xì)胞，結(jié)果顯示細(xì)胞的凋亡率隨著PGPIPN濃度的遞增而逐漸增高(F=111.20)，表明PGPIPN有協(xié)同DDP的作用，可以促進(jìn)原代卵巢癌細(xì)胞的凋亡，見(jiàn)圖5。

2.5 聯(lián)合用藥對(duì)細(xì)胞周期的影響 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示，與單獨(dú)DDP組比較，聯(lián)合用藥組隨著PGPIPN(10-6、10-4、10-2mg/ml)的濃度增加，S期逐漸下降，結(jié)果如下：9.21%、5.56%、0，而G1和G2期逐漸增高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PGPIPN與DDP聯(lián)合使用主要是作用在G0/G1期。使得細(xì)胞停滯于G0/G1期，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡并抑制增殖，見(jiàn)圖6。

3 討論

現(xiàn)有主要治療卵巢癌的化療藥物有順鉑、紫杉醇等，但由于卵巢癌耐藥性的出現(xiàn)，使得順鉑的治療效果降低，卵巢癌的死亡率也逐年遞增。因此臨床上急需一種新藥物來(lái)降低卵巢癌對(duì)順鉑的耐藥性，減少藥物用量，降低患者死亡率。

前期研究[6-7]表明，PGPIPN能顯著促進(jìn)腹腔巨噬細(xì)胞吞噬活性，刺激淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化等。實(shí)驗(yàn)[8]表明，PGPIPN也可通過(guò)下調(diào)Bcl2去誘導(dǎo)卵巢癌凋亡。研究[3]表明PGPIPN不能抑制小鼠永生化成纖維細(xì)胞MEFS以及正常人肝細(xì)胞LO2的生長(zhǎng)。

圖5 不同濃度的PGPIPN聯(lián)合DDP對(duì)人原代卵巢癌細(xì)胞凋亡的影響

A：正常對(duì)照組；B：10μg/mlDDP；C：10μg/mlDDP+10-6mg/mlPGPIPN；D：10μg/mlDDP+10-4mg/mlPGPIPN；E：10μg/mlDDP+10-2mg/mlPGPIPN；與10μg/mlDDP組比較：**P<0.01

圖6 不同濃度PGPIPN聯(lián)合DDP對(duì)人原代卵巢癌周期的影響

A：正常對(duì)照組；B：10μg/mlDDP；C：10μg/mlDDP+10-6mg/mlPGPIPN；D：10μg/mlDDP+10-4mg/mlPGPIPN；E：10μg/mlDDP+10-2mg/mlPGPIPN

本研究顯示不同濃度的PGPIPN與相同濃度的DDP共同作用于人原代卵巢癌細(xì)胞后，增殖抑制作用比單獨(dú)用藥強(qiáng)且呈時(shí)間劑量依賴(lài)關(guān)系。細(xì)胞遷移能力也顯著低于單獨(dú)用藥組。細(xì)胞的凋亡率隨著PGPIPN濃度的遞增而逐漸增高，表明PGPIPN有協(xié)同DDP的作用，可以促進(jìn)人原代卵巢癌細(xì)胞的凋亡。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PGPIPN可以增強(qiáng)順鉑對(duì)人原代卵巢癌細(xì)胞作用，增強(qiáng)卵巢癌對(duì)順鉑的敏感性。因此可以降低順鉑的用量，進(jìn)而降低化療藥物的毒副作用。但具體相關(guān)機(jī)制還需進(jìn)一步的研究，其機(jī)制可能與STATs有關(guān)。研究[9-11]已證實(shí)STAT3與卵巢癌、骨髓瘤、乳腺癌以及其它癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力有關(guān)。研究[12]顯示STAT3通過(guò)影響CyclinD1的表達(dá)進(jìn)而對(duì)細(xì)胞G1期進(jìn)入S期產(chǎn)生影響。實(shí)驗(yàn)[13]顯示，阻斷STAT3通路能誘導(dǎo)耐藥腫瘤細(xì)胞凋亡， 其機(jī)制主要是通過(guò)STAT3影響Caspase家族成員的表達(dá)。

由于PGPIPN的低毒副作用并且來(lái)源廣泛，因此，其臨床應(yīng)用前景比較廣闊，同時(shí)也為研發(fā)卵巢癌化療輔助藥物提供新的思路。

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ZhouJuan,LiuChen,GuFang,etal

(Dept of Biochemistry and Molecular Biology, Anhui Medical University,Hefei 230032)

Immunomodulating Peptide enhance the effect of DDP on ovarian cancer cells

Objective To observe the concomitant therapy effect of immunomodulating peptide(PGPIPN) and anti-cancer drug cisplatin(DDP) on the proliferation and migration of ovarian cancer cellsinvitro.Methods The inhibitory action of DDP with PGPIPN on the proliferation of primary ovarian cancer cells were detected by MTS. Apoptotic ratios and cell cycle of primary ovarian cancer cells were measured by flow cytometry. Cell scratch assays were carried out to test cells′migration.Results The result of MTS showed that the inhibition rate of the concomitant group against ovarian cancer cells was significantly higher than the group treated only with DDP. The difference was significant(P<0.05) and in a dose and time dependent manner. Flow cytometry results showed that PGPIPN could promote the apoptosis of human primary ovarian cancer cells by DDP, and the cycle of cells was arrested in G0/G1 phase.Cell scratch assays showed that concomitant therapy significantly inhibited cell movement, of which the difference from the group treated only with DDP of statistical significance(P<0.05).Conclusion PGPIPN can improve the effect of DDP on primary ovarian cancer cells.

human primary ovarian cancer cells; drug combination; PGPIPN; DDP

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160810.1104.010.html

2016-05-19接收

國(guó)家自然科學(xué)基金(編號(hào)：81472448)

1安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，合肥 230032

2安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，合肥 230022

周 娟，女，碩士研究生；

秦宜德，男，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail:yideqin@ahmu.edu.cn

R73-351；R595.479.1；R979.1

A

10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2016.10.010