李魯 張春陽 崔陽 (包頭醫(yī)學(xué)院; 包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科, 內(nèi)蒙古 包頭 04000)

未發(fā)育成熟顱骨缺損后不同時(shí)期骨痂組織中骨橋蛋白的表達(dá)變化

李魯1張春陽2*崔陽1
(1包頭醫(yī)學(xué)院;2包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科, 內(nèi)蒙古 包頭 014000)

顱骨缺損; 骨橋蛋白

骨橋蛋白(osteopontin, OPN)是一種分泌型酸化糖蛋白，帶負(fù)電荷，具有親水性，富含唾液酸。人的OPN基因由7個外顯子和6個內(nèi)含子組成，定位于4q13上[1]。不同物種的OPN具有不同的結(jié)構(gòu)序列，但是不同物種的OPN均含有相同的高度保守序列，該序列是促進(jìn)細(xì)胞粘附的蛋白質(zhì)中的特有結(jié)構(gòu)。OPN是重要的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，也是重要的細(xì)胞因子，在介導(dǎo)細(xì)胞擴(kuò)散、轉(zhuǎn)移，與基質(zhì)間的黏附、骨組織礦化和重建、血管形成、抑制凋亡、免疫調(diào)節(jié)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程中發(fā)揮著重要作用[2]。在未發(fā)育成熟顱骨缺損的愈合過程中，骨橋蛋白可能通過促進(jìn)骨基質(zhì)的形成而促進(jìn)顱骨缺損的愈合。本實(shí)驗(yàn)通過研究以未發(fā)育成熟山羊(3個月齡)為研究對象，通過實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction, q-RT-PCR)方法觀察骨橋蛋白信使核糖核酸(messenger ribonucleic acid, mRNA)在顱骨缺損創(chuàng)緣愈合的不同時(shí)期基因表達(dá)情況，進(jìn)而尋找骨橋蛋白在未發(fā)育成熟顱骨缺損愈合過程中發(fā)揮重要作用的證據(jù)，為進(jìn)一步研究骨橋蛋白促進(jìn)未發(fā)育成熟顱骨缺損愈合的作用機(jī)制打下基礎(chǔ)。

一、材料與方法

1.動物模型的建立：3個月齡的母山羊12只，體重(24.6±2.1)kg ，隨機(jī)分實(shí)驗(yàn)組與對照組，各組6只。實(shí)驗(yàn)組頭頂部皮膚脫毛，安爾碘消毒3遍。2%利多卡因5 ml頭皮局部浸潤麻醉。取中線向左側(cè)旁2 cm直切口，切口長約5 cm。依次切開皮膚、皮下組織、骨膜，嚴(yán)密止血，鈍性推開骨膜。骨鉆鉆孔，并擴(kuò)大骨窗至3 cm×3 cm，保留硬腦膜完整(圖1)。生理鹽水沖洗術(shù)腔至沖洗水清亮。逐層縫合皮下組織、皮膚，包扎固定。對照組顱骨不予特殊處理。分別于術(shù)后3 d、7 d、14 d、21 d、30 d對實(shí)驗(yàn)組與對照組顱骨取材。

2.組織處理：脫毛、消毒。切口頭皮。實(shí)驗(yàn)組：咬骨鉗咬取骨緣新生骨痂組織。對照組：咬骨鉗咬取相同部位顱骨組織。每次咬取骨痂部位無重復(fù)。所得骨痂組織、骨組織液氮中保存。

3.提取實(shí)驗(yàn)組骨痂組織與對照組骨組織總核糖核酸(ribonucleic acid, RNA)：取出保存的骨痂組織、骨組織，稱重。置于液氮預(yù)冷后的研缽中研磨成粉末狀。收集骨粉于離心管中，加入1 ml Trizol，搖晃振蕩2 min，室溫靜置5 min。加入氯仿200 μl，搖晃振蕩1 min，靜置5 min。4℃、12 000 r/min，離心15 min。經(jīng)離心管中上層水相移至另一離心管中，加入異丙醇0.5 ml。室溫靜置10 min。4℃、12 000 r/min，離心10 min。棄上清，加入75%的乙醇1 ml，振蕩混勻，20℃靜置15 min。4℃、7 500 r/min，離心5 min，棄上清。自然干燥RNA沉淀30 min。加入200 μl焦碳酸二乙酯(diethy pyrocarbonate, DEPC)水溶解RNA沉淀，振蕩混勻，65℃加熱15 min。所得RNA保存于-20℃冰箱。

4.RNA濃度及純度測定：分別取骨痂組織、骨組織RNA樣品2 μl，加入98 μl體積分?jǐn)?shù)0.1%DEPC水，稀釋50倍后用紫外分光光度計(jì)測量其濃度、A260/A280 值、A260/A230 值。

5.逆轉(zhuǎn)錄生成單鏈脫氧核糖核酸(complementary deoxyribonucleic acid, cDNA)：依據(jù)第一鏈cDNA合成試劑盒(美國賽默飛)操作，依次加入：總RNA 3.024 μg、多聚胸腺嘧啶T重復(fù)寡核苷酸2 μl、脫氧核糖核苷三磷酸(2.5 mM) 2 μl，加入無酶水至14.5 μl，混勻后冰上靜置5 min，依次加入5×反轉(zhuǎn)錄緩沖液4 μl、核糖核酸酶抑制劑0.5 μl、莫洛尼鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶1 μl，加入無酶水至20 μl。42℃、60 min，90℃、5 min終止反應(yīng)。

6.q-RT-PCR：依據(jù)q-RT-PCR試劑盒(美國賽默飛)操作。配制 20 μl q-RT-PCR反應(yīng)體系：2×濃縮的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增預(yù)混液l0 μl，正向引物l ul，反向引物l ul，模板脫氧核糖核酸100 ng，無酶水加至20l μl。q-RT-PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性l0 min；95℃變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個循環(huán)。

7.統(tǒng)計(jì)分析：各時(shí)間點(diǎn)顱骨標(biāo)本q-RT-PCR重復(fù)3次，每時(shí)間點(diǎn)每組3個樣本。應(yīng)用2-ΔΔCt法對q-RT-PCR數(shù)據(jù)進(jìn)行轉(zhuǎn)換。所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，采用雙因素方差分析，P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。利用GraphPad Prism 5繪制圖表(圖2)。

圖1 山羊顱骨缺損模型，大小約3 cm×3 cm(箭頭所示)

圖2 不同時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組與對照組OPN mRNA表達(dá)水平比較

aP<0.001,vs對照組3 d及7 d;bP<0.05,vs對照組 7 d;cP<0.001,vs對照組7 d

Note: C: 對照組; T: 實(shí)驗(yàn)組

二、結(jié)果

山羊顱骨缺損形成14 d后OPN在創(chuàng)緣新生骨痂組織中的mRNA表達(dá)高于正常骨組織(圖2,aP<0.001)。顱骨缺損形成后14 d時(shí)創(chuàng)緣處新生骨痂組織內(nèi)OPN mRNA表達(dá)明顯高于7 d時(shí)(圖2,bP<0.05)，至21 d時(shí)達(dá)最高峰(圖2,aP<0.001)，30 d時(shí)OPN mRNA的表達(dá)較前有所下降，但仍維持在較高水平(圖2,aP<0.001)。

三、討論

OPN是一種骨特異性的分泌型蛋白，帶有負(fù)電荷，在各種組織中均有表達(dá)，生理情況下，主要表達(dá)于骨和上皮細(xì)胞表面[3]。在成骨細(xì)胞的增值、分化和骨的重建及礦化過程中發(fā)揮重要作用。顱蓋骨主要為膜形成骨。有原位雜交和免疫組化實(shí)驗(yàn)表明，OPN在鼠顱蓋骨中代表骨形成活動活躍的骨外膜立方形成骨細(xì)胞中有表達(dá)，并且在代表骨重建活躍的骨內(nèi)膜扁平形成骨細(xì)胞中也有表達(dá)[4]。在骨折愈合過程中，表達(dá)OPN的成骨細(xì)胞逐漸增多，骨橋蛋白的表達(dá)與成骨細(xì)胞成熟程度相一致[5]。研究發(fā)現(xiàn)，敲除OPN基因的小鼠骨抵抗損傷的能力明顯下降[6]。不僅如此OPN在骨折的礦化過程中仍發(fā)揮重要作用。OPN含有的RGD序列和多元氨基酸結(jié)構(gòu)域被認(rèn)為與羥基磷灰石的晶核化有關(guān)[7]。在體外實(shí)驗(yàn)表明OPN磷酸化后可抑制羥基磷灰石晶體形成[8]，而體內(nèi)的實(shí)驗(yàn)表明OPN在骨基質(zhì)的礦化過程中，主要通過影響骨基質(zhì)的礦化的速率實(shí)現(xiàn)，而并不影響羥基磷灰石的結(jié)晶生長成核[9]。本實(shí)驗(yàn)通過對山羊顱骨缺損不同時(shí)期顱骨創(chuàng)緣骨痂組織OPN的表達(dá)變化研究，證實(shí)了在顱骨創(chuàng)緣愈合期，創(chuàng)緣新生骨痂組織中OPN的表達(dá)高于正常骨組織。證實(shí)OPN參與了顱骨缺損的自身修復(fù)過程，而對于其作用機(jī)理仍需要進(jìn)一步研究。明確OPN在顱骨缺損創(chuàng)緣骨形成過程中的作用，探明這一過程中OPN的作用機(jī)制，有助于豐富神經(jīng)外科臨床中顱骨缺損修復(fù)的理論，為解決兒童顱骨缺損的修復(fù)提供更多的途徑。

1茅文斌, 邵增務(wù). 骨橋蛋白與骨質(zhì)疏松癥研究進(jìn)展 [J]. 中國骨質(zhì)疏松雜志, 2007, 13(3): 204-207.

3Yokosaki Y, Higashikawa F. Osteopontin receptors and signal transduction [J]. Nihon Rinsho, 2005, 63 (Suppl 10): 613-617.

4Yokosaki Y, Tanaka K, Higashikawa F, et al. Distinct structural requirements for binding of the integrins alphavbeta6, alphavbeta3, alphavbeta5, alpha5beta1 and alpha9beta1 to osteopontin [J]. Matrix Biol, 2005, 24(6): 418-427.

5張偉國, 王英. 鼠顱面部礦化組織發(fā)育中非膠原蛋白的表達(dá) [J]. 口腔頜面外科雜志, 1998, 8(3): 190-194.

6Thurner PJ, Chen CG, Ionova-Martin S, et al. Osteopontin de-ficiency increases bone fragility but preserves bone mass [J]. Bone, 2010, 46(6): 1564-1573.

7Zhang B, Sun Y, Chen L, et al. Expression and distribution of SIBLING proteins in the predentin/dentin and mandible of hyp mice [J]. Oral Dis, 2010, 16(5): 453-464.

8Huang W, Carlsen B, Rudkin G, et al. Osteopontin is a negative regulator of proliferation and differentiation in MC3T3-E1 pre-osteoblastic cells [J]. Bone, 2004, 34(5): 799-808.

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1671-2897(2016)15-171-02

·簡報(bào)·

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李魯，碩士研究生，主治醫(yī)師，E-mail: swdalu@163.com

*通訊作者：張春陽，教授、主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，E-mail: 445843578@qq.com

10.7666/d.y1709707.

2015-11-03；

2015-12-26)