母丹丹汝雙燕李 濤趙進(jìn)東
(1. 中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所, 武漢 430072; 2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)
研究簡(jiǎn)報(bào)
銅脅迫對(duì)輪葉黑藻無(wú)菌苗生理代謝的影響
母丹丹1,2汝雙燕1,2李 濤1趙進(jìn)東1
(1. 中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所, 武漢 430072; 2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)
隨著工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展, 向環(huán)境中排放的重金屬日趨增加, 土壤、地表水、地下水受到的污染日趨嚴(yán)重。所謂重金屬是指原子量大于鐵或密度大于5.0 g/cm3的金屬, 如汞、鎘、鉛、銅、鎳、鋅等, 采礦、冶金、化工、石油、電鍍等多種工業(yè)行業(yè)的生產(chǎn)廢水均含有重金屬元素。而重金屬?gòu)U水是對(duì)環(huán)境危害最嚴(yán)重和對(duì)人類危害最大的工業(yè)廢水[1]。銅作為一種重要的高毒性重金屬污染物, 關(guān)于其對(duì)自然水體或模擬的人工水體毒害的研究國(guó)內(nèi)已有一些報(bào)道[2—4]。沉水植物作為水體生態(tài)系統(tǒng)中行駛重要生態(tài)和環(huán)境功能的初級(jí)生產(chǎn)者, 具有很強(qiáng)的修復(fù)重金屬污染水體的潛力[5]。輪葉黑藻是一種廣泛分布于我國(guó)各個(gè)湖泊的沉水植物, 其在改善水質(zhì)、維持水質(zhì)穩(wěn)定以及增加生物多樣性方面具有良好的生態(tài)效益, 水質(zhì)、溫度、溶解氧、營(yíng)養(yǎng)鹽狀況都會(huì)影響黑藻的生長(zhǎng)與存活[6]。銅元素是輪葉黑藻所必需的微量元素, 攝入過(guò)多的銅會(huì)使輪葉黑藻生長(zhǎng)受到抑制甚至死亡。過(guò)量的重金屬離子的吸收和富集對(duì)水生植物產(chǎn)生怎樣的影響?曾阿妍[7]發(fā)現(xiàn)黑藻對(duì)Cu2+有較好的凈化能力, 隨著培養(yǎng)溶液中的銅離子濃度的逐漸增加, 黑藻中的葉綠素含量逐漸降低。周長(zhǎng)芳等[8]在Hoagland培養(yǎng)基中加入CuSO4以模擬水體Cu2+污染環(huán)境, 研究重金屬對(duì)水花生各項(xiàng)生理指標(biāo)的影響, 發(fā)現(xiàn)水花生可溶性蛋白隨Cu2+濃度的升高而直線下降。徐勤松等[9]發(fā)現(xiàn)重金屬Cd、Zn單一及復(fù)合污染都使水車前細(xì)胞內(nèi)的保護(hù)酶SOD、POD和CAT活性比例失調(diào), 植物體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和清除失衡, 這都導(dǎo)致植物的生理代謝紊亂, 從而加速植物的衰老和死亡。
目前已報(bào)道的研究[10—13]所采用的材料大都為自然生長(zhǎng)的植株, 取材受季節(jié)的限制, 實(shí)驗(yàn)結(jié)果在一定程度上會(huì)受到其他生物尤其是水體內(nèi)的微生物的影響。微生物可以調(diào)控植物性狀表達(dá), 影響植物的性能, 進(jìn)而影響各種生態(tài)系統(tǒng)功能[14]。為了消除以上影響, 本文以輪葉黑藻無(wú)菌苗為材料, 研究了Cu2+脅迫條件下輪葉黑藻無(wú)菌苗的光合色素、ATP 酶的活性以及抗氧化系統(tǒng)等生理功能的變化, 為進(jìn)一步研究植物應(yīng)對(duì)重金屬逆境脅迫的響應(yīng)機(jī)制提供參考。
1.1 實(shí)驗(yàn)材料
輪葉黑藻無(wú)菌苗培養(yǎng)方法[15]: 選取生長(zhǎng)健壯的輪葉黑藻, 用堿性洗滌劑浸泡0.5h, 然后在自來(lái)水沖洗1h, 在無(wú)菌工作間, 取帶腋芽的健壯莖置于培養(yǎng)皿中, 用75%乙醇滅菌30s, 無(wú)菌水反復(fù)沖洗3次, 用0.1%的氯化汞消毒2min, 再用無(wú)菌水反復(fù)沖洗5次。將消毒處理后的輪葉黑藻莖剪成5—10 mm長(zhǎng), 辨認(rèn)形態(tài)學(xué)上端后, 置于MS(Murashige Skoog Medium)固體培養(yǎng)基[含0.5 mg/L的6-氨基嘌呤(6-BA), 0.1 mg/L的萘乙酸(IAA), pH5.8—6.0]誘導(dǎo)芽分化。7d左右莖間側(cè)芽萌發(fā), 15d左右長(zhǎng)至1.0 cm,然后轉(zhuǎn)入1/2MS (NH4NO3、KNO3、CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、KH2PO4減半)液體繼代培養(yǎng)基(含0.5 mg/ L的6-BA, 0.1 mg/L的IAA, pH 5.8—6.0)繼代培養(yǎng)15d后,轉(zhuǎn)入1/2 MS液體繼代培養(yǎng)基(含0.1 mg/L 的IAA, pH 5.8—6.0)進(jìn)行生根培養(yǎng)以得到完整的無(wú)菌苗, 時(shí)長(zhǎng)為7d。整個(gè)組培過(guò)程在培養(yǎng)室進(jìn)行, 培養(yǎng)溫度為(25±2)℃,每天光照12h, 光照強(qiáng)度為40 μe/(m2·s)。
銅標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制[16]: 將3.9 g CuSO4·5H2O溶于少量水中, 滴入少量硫酸, 移入1000 mL容量瓶中, 用水稀釋至刻度, 搖勻, 滅菌保存。此溶液含銅1.0 mg/mL。
1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
選取生長(zhǎng)狀況一致的輪葉黑藻無(wú)菌苗在無(wú)銅1/2MS液體培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)3d, 然后分別加入已滅菌的CuSO4·5H2O(AR)標(biāo)準(zhǔn)液至銅離子濃度為0、0.5、1.0、5.0和10.0 mg/L, 整個(gè)毒害實(shí)驗(yàn)都在全封閉培養(yǎng)箱中完成, 條件同培養(yǎng)黑藻無(wú)菌苗時(shí)一致。第3—4d時(shí), 在相同的時(shí)間段內(nèi)取出無(wú)菌苗, 去離子水洗凈、揩干, 鮮重(FW)下進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定, 實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
1.3 實(shí)驗(yàn)方法
光合特征指標(biāo)的測(cè)定 光合色素含量的測(cè)定采用Lichtenthaler[17]的方法, 通過(guò)紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)量分析。
可溶性蛋白含量的測(cè)定 采用考馬氏亮藍(lán)G-250法[18]進(jìn)行。
Na+K+-ATP酶(Na+K+-ATPase)和Ca2+Mg2+-ATP 酶(Ca2+Mg2+-ATPase)活性測(cè)定 使用南京建成生物工程研究所購(gòu)買的ATP酶試劑盒測(cè)定。
SOD、POD和CAT 活性的測(cè)定 取材置于預(yù)冷的研缽中, 加入0.05 mol/L的磷酸緩沖液(pH7.8), 冰浴,研磨, 10000 r/min, 低溫離心20min, 取上清液。SOD、CAT活性用一般分光光度法; POD活性用愈創(chuàng)木酚法[19]測(cè)定。
數(shù)據(jù)分析 運(yùn)用excel分析各測(cè)定指標(biāo)與處理濃度間的相關(guān)性(r)并繪制圖, 用相關(guān)系數(shù)r表示, 各指標(biāo)與Cu2+濃度進(jìn)行相關(guān)系數(shù)統(tǒng)計(jì); 以 P<0.05為顯著相關(guān),P<0.01為極顯著相關(guān)。由SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)個(gè)數(shù)據(jù)均值進(jìn)行單因素方差分析, 完成數(shù)值間的差異性分析; 以P<0.05為差異顯著, P<0.01為差異極顯著。結(jié)果以“均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。本文圖表中的不同小寫字母表示數(shù)值之間差異顯著(P<0.05), 相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。
2.1 Cu2+對(duì)輪葉黑藻無(wú)菌苗光合色素含量的影響
隨著Cu2+濃度的增加, 各種光合色素的含量均呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)(圖 1)。最高濃度為10 mg/L時(shí), 葉綠素a(Chl.a)、葉綠素b (Chl.b)、類胡蘿卜素(Car)的含量依次降為對(duì)照組的48.1%、80.1%和9.5%??梢?jiàn), Chl.a、Chl.b和Car的含量下降趨勢(shì)整體上保持一致。經(jīng)相關(guān)性及顯著性分析, Chl.a、Car與Cu2+濃度均呈現(xiàn)極顯著負(fù)相關(guān)(相關(guān)系數(shù)分別為r= -0.82, r= -0.90; P<0.01), Chl.b與Cu2+濃度呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)(相關(guān)系數(shù)為r=-0.54;P<0.05)。對(duì)于Chl.a, 對(duì)照組與0.5 mg/L Cu2+處理組無(wú)顯著性差異(P>0.05), 與其他組均有顯著性差異(P<0.05);對(duì)于Chl.b, 對(duì)照組與0.5 和1.0 mg/L Cu2+處理組無(wú)顯著性差異(P>0.05), 與5.0 和10.0 mg/L Cu2+處理組之間有顯著性差異(P<0.05)。對(duì)于Car, 對(duì)照組與0.5 和1.0 mg/L Cu2+處理組無(wú)顯著性差異(P>0.05), 與5.0和10.0 mg/L Cu2+處理組有顯著性差異(P<0.05)。
圖 1 在Cu2+脅迫下輪葉黑藻無(wú)菌苗光合色素的含量變化Fig. 1 Effect of Cu2+stress on photosynthetic pigments contents in sterile seedlings of Hydrilla
2.2 Cu2+對(duì)輪葉黑藻可溶性蛋白含量變化的影響
在Cu2+脅迫下, 可溶性蛋白含量隨著Cu2+濃度的增大呈現(xiàn)下降趨勢(shì)(圖 2), 在1.0 mg/L Cu2+處理時(shí)呈現(xiàn)回升趨勢(shì), 為對(duì)照組的93.7%; 而后隨著處理濃度的加大, 可溶性蛋白含量也呈現(xiàn)驟降的趨勢(shì)。經(jīng)相關(guān)性分析可知,輪葉黑藻無(wú)菌苗可溶性蛋白的含量與Cu2+處理濃度呈極顯著負(fù)相關(guān)(相關(guān)系數(shù)為r= -0.88, P<0.01); 顯著性分析顯示對(duì)照組和0.5、1.0 mg/L Cu2+處理組之間無(wú)顯著性差異(P>0.05), 而與5.0、10.0 mg/L Cu2+處理組之間存在顯著性差異, (P<0.05)。
2.3 Cu2+脅迫下輪葉黑藻無(wú)菌苗Na+K+-ATP酶、Ca2+Mg2+-ATP酶活性的變化
2.4 Cu2+脅迫對(duì)輪葉黑藻無(wú)菌苗SOD、POD和CAT活性的影響
圖 2 Cu2+脅迫下輪葉黑藻無(wú)菌苗可溶性蛋白的含量變化Fig. 2 Effect of Cu2+stress on soluble protein in sterile seedlings of Hydrilla
圖 3 Cu2+對(duì) Na+K+-ATPase和 Ca2+Mg2+-ATPase的影響Fig. 3 Effect of Cu2+stress on Na+K+-ATPase and Ca2+Mg2+-ATPase activity of Hydrilla
圖 4 Cu2+對(duì)輪葉黑藻SOD、POD、CAT活性的影響Fig. 4 Effect of Cu2+stress on SOD, POD, CAT activity of Hydrilla
隨著Cu2+濃度升高, SOD和POD的活性表現(xiàn)為上升,在Cu2+濃度為10.0 mg/L 時(shí)達(dá)到最大, 為對(duì)照組的1.1倍和3.6倍(圖 4A、B); CAT的活性隨Cu2+處理濃度升高均表現(xiàn)為先升后降趨勢(shì), 分別在Cu2+濃度為0.5 mg/L時(shí)達(dá)到峰值, 為對(duì)照組的1.2倍, 之后酶活性下降, 降為對(duì)照組21.5% (圖 4C)。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn), SOD和POD活性變化與Cu2+處理濃度呈極顯著正相關(guān)(相關(guān)系數(shù)為rSOD= 0.96, rPOD= 0.98, P<0.01); CAT活性與 Cu2+處理濃度呈極顯著負(fù)相關(guān)(相關(guān)系數(shù)為rCAT= -0.90,P<0.01); 差異性分析顯示, SOD活性對(duì)照組與1 mg/L Cu2+處理組無(wú)顯著性差異(P>0.05), 與0.5、5.0和10.0 mg/ L Cu2+處理組存在顯著性差異(P<0.05, 圖 4)。POD活性對(duì)照組與0.5 mg/L Cu2+處理組無(wú)顯著性差異(P>0.05), 與其他Cu2+處理組均存在顯著性差異(P<0.05, 圖 4B);CAT活性對(duì)照組與0.5、1.0 mg/L Cu2+處理組無(wú)顯著性差異(P>0.05), 與其他Cu2+處理組存在顯著性差異(P<0.05,圖 4C)。
已有的報(bào)道[6—10]使用野外采集的沉水植物作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象, 其實(shí)驗(yàn)結(jié)果會(huì)受到其他因素的干擾。朱丹婷等[6]在研究光強(qiáng)、溫度、總氮濃度對(duì)黑藻生長(zhǎng)的影響時(shí), 也選擇非無(wú)菌的材料, 且未滅菌的營(yíng)養(yǎng)液可能存在其他共生植物; 張飲江等[12]選擇了金魚藻, 伊樂(lè)藻和苦草3種沉水植物研究去除水體中鎘的效果, 實(shí)驗(yàn)所選擇的水體為開(kāi)放水體, 自然光照, 研究對(duì)象可能會(huì)受到不同程度的外界影響。本實(shí)驗(yàn)以輪葉黑藻無(wú)菌苗作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象進(jìn)行重金屬脅迫研究, 盡可能的控制或排除其他不穩(wěn)定因素的影響, 如光照、共生植物、水的運(yùn)動(dòng)以及人為作用等的干擾, 選擇生長(zhǎng)時(shí)間, 狀況一致的無(wú)菌苗作為受試材料,在可控的環(huán)境中進(jìn)行試驗(yàn)。
葉綠素含量與光合速率、營(yíng)養(yǎng)狀況等密切相關(guān), 測(cè)定葉綠素的含量是表征植物生長(zhǎng)狀況重要標(biāo)志[20]。本實(shí)驗(yàn)輪葉黑藻光合色素隨著處理濃度的增加而下降, 這與徐勤松等[9]、曾阿研等[7]的研究結(jié)果一致。輪葉黑藻在Cu2+脅迫下, 0 Cu2+處理組與0.5 mg/L Cu2+處理組植物葉片仍舊鮮綠, 1.0 mg/L處理組植物葉片部分失綠, 而5.0、10.0 mg/L濃度組植物葉片幾乎全部失綠變黑, 甚至死亡。谷巍等[21]用不同濃度的Hg2+和Cd2+溶液處理輪葉狐尾藻, Cd2+脅迫時(shí), 植物葉片和莖出現(xiàn)黑色斑點(diǎn), Hg2+脅迫時(shí)葉片和莖均褪綠, 未出現(xiàn)斑點(diǎn)。電鏡觀察顯示, 葉細(xì)胞受毒害后, 染色質(zhì)呈絮凝狀, 膜系統(tǒng)解體、核糖體消失。由此可見(jiàn), 重金屬離子脅迫后, 沉水植物葉綠體的結(jié)構(gòu)受到破壞, 光合色素含量下降, 進(jìn)而影響植物正常的光合作用, 代謝紊亂。
植物在逆境或者衰老的情況下, 蛋白質(zhì)合成速度減緩, 含量下降[22]。在本實(shí)驗(yàn)中, 可溶性蛋白含量隨著Cu2+濃度的增大呈現(xiàn)下降趨勢(shì), 與賈榮等[23]以菹草無(wú)菌苗為材料在銅脅迫下可溶性蛋白含量的變化所得的結(jié)論基本一致。輪葉黑藻無(wú)菌苗在Cu2+濃度低于1.0 mg/L時(shí),可溶性蛋白含量差異不顯著, 這與植物本身的抗逆性反應(yīng)有關(guān); 而高于1.0 mg/L時(shí), 植物的抗逆程度遭致破壞,無(wú)法正常維持內(nèi)部環(huán)境的穩(wěn)定, 因此無(wú)法滿足自生生存需要, 導(dǎo)致死亡。
機(jī)體在缺氧及疲勞等狀態(tài)下, ATP酶受到損傷, 活力
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SOD、POD以及CAT是防御過(guò)氧化系統(tǒng)的重要保護(hù)酶, 能有效消除自由基, 因此SOD、POD和CAT都是反應(yīng)植物的受損程度的逆境生理指標(biāo)[24,25]。本研究發(fā)現(xiàn)SOD、POD的含量隨銅離子濃度上升而上升, CAT的含量在低濃度時(shí)上升, 在高濃度Cu2+脅迫下CAT活性的急劇下降, 可能是由于自由基的積累導(dǎo)致。陳霖等[26]通過(guò)鎳脅迫菹草無(wú)菌苗發(fā)現(xiàn), SOD、POD和CAT的活性隨鎳離子濃度增加, 均表現(xiàn)為先升后降的趨勢(shì)。這與本研究的結(jié)果不一致, 表明不同植物, 不同重金屬離子存在不同的污染機(jī)制, 其原因有待進(jìn)一步探討。
綜上所述, 在Cu2+脅迫下, 葉綠體結(jié)構(gòu)受到破壞, 光合色素含量降低, 植物無(wú)法進(jìn)行正常的光合作用; 可溶性蛋白和ATP酶系統(tǒng)的含量減少表明植物內(nèi)部酶系統(tǒng)受到較大破壞, 無(wú)法維持正常的生理活動(dòng); Cu2+脅迫也可誘導(dǎo)活性氧等在植物體內(nèi)大量積累, 抗氧化酶系統(tǒng)能在一定范圍內(nèi)降低體內(nèi)活性氧的過(guò)量積累, 隨著Cu2+的增加, 活性氧超過(guò)一定范圍, 致使抗氧化酶系統(tǒng)負(fù)荷過(guò)重, 進(jìn)而導(dǎo)致輪葉黑藻的穩(wěn)態(tài)被破壞。1.0 mg/L的Cu2+濃度是本實(shí)驗(yàn)輪葉黑藻的耐受臨界點(diǎn), 超過(guò)這個(gè)界限, 輪葉黑藻的各項(xiàng)生理機(jī)能都遭致嚴(yán)重破壞, 代謝紊亂, 植株不能繼續(xù)生長(zhǎng)。Acta Hydrobiologica Sinica, 2006, 30(1): 107—112 [徐勤松, 施國(guó)新, 王學(xué), 等. 鎘、銅和鋅脅迫下黑藻活性氧的產(chǎn)生及抗氧化酶活性的變化研究. 水生生物學(xué)報(bào),2006, 30(1): 107—112]
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EFFECT OF COPPER STRESS ON PHYSIOLOGICAL METABOLISM IN STERILE SEEDLINGS OF HYDRILLA VERTICILLATA (L. F.) ROYLE
MU Dan-Dan1,2, RU Shuang-Yan1,2, LI Tao1and ZHAO Jin-Dong1
(1. Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Science, Wuhan 430072, China; 2. University of chinese Academy Sciences, Beijing 100049, China)
輪葉黑藻無(wú)菌苗; Cu2+脅迫; 光合色素; 可溶性蛋白; ATP酶; 抗氧化酶系統(tǒng)
Sterile seedlings of Hydrilla verticillata (L. F.); Cu2+stress; Chlorophyll content; Soluble protein; ATPase; Antioxidant enzyme system
10.7541/2016.56
Q948.1
A
1000-3207(2016)02-0419-06
2015-03-05;
2015-07-25
國(guó)家水體污染與治理科技重大專項(xiàng)項(xiàng)目(2012ZX07105004)資助 [Supported by Major Science and Technology Project of Water Pollution control and management in China (2012ZX07105004)]
母丹丹(1990—), 女, 羌族; 四川綿陽(yáng)人; 碩士研究生; 研究方向?yàn)樵孱惢蚪M學(xué)。E-mail: dia_533@163.com
李濤, E-mail: litao@ihb.ac.cn