陳澤斌夏體淵王定康徐勝光何 峰任 禛

（1. 昆明學(xué)院農(nóng)學(xué)院， 昆明 650214； 2. 云南省都市特色農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心， 昆明 650214； 3. 昆明學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)系， 昆明 650214； 4. 昆明市滇池生態(tài)研究所， 昆明 650228）

研究簡(jiǎn)報(bào)

滇池沉積物中厭氧氨氧化細(xì)菌分布的時(shí)空差異

陳澤斌1，2夏體淵1王定康3徐勝光1何 峰4任 禛1

（1. 昆明學(xué)院農(nóng)學(xué)院， 昆明 650214； 2. 云南省都市特色農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心， 昆明 650214； 3. 昆明學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)系， 昆明 650214； 4. 昆明市滇池生態(tài)研究所， 昆明 650228）

厭氧氨氧化作用（Anaerobic Ammonia Oxidation，Anammox）是細(xì)菌在厭氧條件下， 以NO2-為電子受體， 以銨離子為電子供體的氧化還原反應(yīng)［1］。厭氧氨氧化細(xì)菌的生長(zhǎng)極為緩慢， 只能在高菌體濃度時(shí)才顯示其氨氧化活性， 且對(duì)氧的存在十分敏感， 所以傳統(tǒng)的微生物純化、分離和培養(yǎng)的方法并不適用于厭氧氨氧化細(xì)菌。由于微生物可培養(yǎng)技術(shù)的局限性， 因此實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)成為定量描述難培養(yǎng)微生物分布和豐度的有力手段［2］。宋亞娜等［3］利用熒光定量PCR方法對(duì)土壤中厭氧氨氧化細(xì)菌進(jìn)行了檢測(cè)， 但對(duì)于高原湖泊底泥中厭氧氨氧化細(xì)菌的時(shí)空分布， 尚未有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。目前對(duì)厭氧氨氧化細(xì)菌的研究只能通過其16S rDNA進(jìn)行， Strous等［4］首先研究了一株厭氧氨氧化細(xì)菌的16S rDNA序列， 表明厭氧氨氧化細(xì)菌是一群分支很深的浮霉?fàn)罹?并將其命名為Candidatus Brocadiaan ammoxidans。目前厭氧氨氧化細(xì)菌共分為5個(gè)屬， 8個(gè)種［5］。Schmidt 等［6］證實(shí)好氧與厭氧氨氧化細(xì)菌可以共處于兼性環(huán)境中。

底泥是支流帶入湖泊的沉積物的匯集， 由于表層水的存在， 加之底泥中含水量較高， 因而具備適合兩種氨氧化細(xì)菌共存的兼性環(huán)境。Thamdrup等［7］和Dalsgaard等［8］的研究均表明在水環(huán)境底泥中， 厭氧氨氧化作用是氮素?fù)p失的主要因素。滇池是云南著名的高原淡水湖泊， 應(yīng)用分子生物學(xué)手段對(duì)滇池底泥中的厭氧氨氧化細(xì)菌的時(shí)空分布進(jìn)行研究， 有助于為高原淡水湖泊中氮素循環(huán)的研究提供依據(jù)。

1 研究區(qū)域概況

滇池位于昆明市西南（24°40′N-25°02′N， 102°02′E-102°47′E）， 面積306.3 km2， 平均水深5.12 m， 最大水深11.3 m， 平均庫(kù)容量為1.57×109m3， 屬于淺水湖泊。湖面平均海拔為1886 m， 屬于典型的高原淡水湖泊。湖體略為弓形， 南北走向， 靠近北部的海埂將滇池分為南北兩部分， 分別稱為草海與外海， 其中外海是滇池的主體， 由20余條支流攜帶泥沙、富營(yíng)養(yǎng)物和污染物匯入。滇池東部與北部與人口密集的生活區(qū)相鄰， 有大量生活污水排入， 為污染較為嚴(yán)重的區(qū)域； 西鄰山脈， 位于西南部的海口鎮(zhèn)螳螂川是滇池唯一天然出水口。昆明市春夏季白晝較長(zhǎng)， 日照強(qiáng)烈， 一日內(nèi)溫差較大， 適合水生植物與微生物的繁殖代謝； 秋冬季白晝變短， 日照充足， 氣溫偏低， 水生植物與微生物的代謝減緩。

2 材料與方法

2.1 采樣點(diǎn)設(shè)置與樣品處理

根據(jù)滇池的地形， 分別在北部草海、草海與外海交界處、東部生活區(qū)、西部沿山地區(qū)以及西南部出水口等地設(shè)置8個(gè)采樣點(diǎn)， 分別于春夏之交的5月和秋冬之交的11月， 在每個(gè)采樣點(diǎn)首先記錄該位置水溫， 并使用抓斗和管式采集器分別采集淺層底泥（0—10 cm）與深層底泥（40—50 cm）樣品各兩份， 每個(gè)采樣點(diǎn)利用GPS定位系統(tǒng)記錄經(jīng)緯度。采樣點(diǎn)位置與GPS坐標(biāo)見表 1。采集的底泥樣品迅速用密封袋密封， 裝入低溫保存箱中帶回實(shí)驗(yàn)室。一份用于測(cè)定樣品間隙水的溶氧量（DO）、有機(jī)碳（OC）、氨氮總量（NH4+-N）、總磷以及pH等， 另一份等分為3份重復(fù)， 置于-80℃冰箱中， 用于對(duì)厭氧氨氧化細(xì)菌數(shù)量的分析。

表 1 采樣點(diǎn)GPS坐標(biāo)Tab. 1 GPS coordinates of sample points

2.2 樣品理化性質(zhì)測(cè)定

碘量法［9］測(cè)定樣品間隙水中的含氧量（DO）， 重鉻酸鉀氧化-硫酸亞鐵滴定法［10］測(cè)定樣品中OC含量， 靛酚藍(lán)分光光度法［11］測(cè)定樣品中NH4+-N含量， 過硫酸鉀氧化法［12］測(cè)定樣品中總磷含量， 并使用電子pH計(jì)測(cè)定pH。結(jié)合細(xì)菌數(shù)量測(cè)定結(jié)果， 采用SPSS 19.0軟件對(duì)細(xì)菌數(shù)量與樣品中各環(huán)境因子含量相關(guān)性進(jìn)行分析。

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線制作及樣品測(cè)定

用試劑盒提取底泥樣品細(xì)菌總DNA， 采用厭氧氨氧化細(xì)菌特異性的16S rDNA引物［13］進(jìn)行擴(kuò)增， 引物序列為: 上游引物Anammox （Pla46）: 5′-GGATTAGGCAT GCAAGTC-3′， 下游引物Anammox2: 5′-TCTGTATTAC CGCGGCT-3′。反應(yīng)體系為: 上下游引物各0.5 μL，10×buffer 2.5 μL， ExTaq 0.5 μL （5 U/μL）， 總DNA 0.5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL， 用去離子水補(bǔ)至體積25 μL。PCR擴(kuò)增條件為: 95℃預(yù)變性5min； 94℃變性45s， 50℃退火60s， 72℃延伸50s， 30次循環(huán)； 72℃延伸15min。將各采樣點(diǎn)樣品中擴(kuò)增出的產(chǎn)物連接到載體質(zhì)粒上并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH-5α感受態(tài)細(xì)胞中， 篩選陽(yáng)性克隆， 對(duì)插入片段測(cè)序， 并提取質(zhì)粒， 測(cè)定質(zhì)粒DNA濃度， 計(jì)算質(zhì)粒的拷貝數(shù)約為3.28×109cell/μL。從3.28×102—3.28×109cell/μL以每10倍作為梯度稀釋， 制作用于熒光定量PCR檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

對(duì)由上述構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線的重組質(zhì)粒和底泥樣品中的樣本DNA進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。每個(gè)樣本重復(fù)3次。反應(yīng)體系為: FastStart Universal SYBR Green Master（ROX） 25 μL， 上下游引物各0.5 μL， 稀釋10倍的DNA模板5 μL， 去離子水19 μL， 共50 μL。反應(yīng)于Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System（Life Technologies）上進(jìn)行。反應(yīng)條件為: 95℃預(yù)變性5min； 95℃變性45s， 60℃退火1min， 72℃延伸1min， 40次循環(huán)。根據(jù)循環(huán)數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)曲線， 測(cè)定樣品中厭氧氨氧化細(xì)菌的數(shù)量。

2.4 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 19.0與Excel 2010軟件進(jìn)行。

3 結(jié)果

3.1 樣品理化性質(zhì)

相比淺層底泥的理化性質(zhì)， 深層底泥中DO、OC和總磷均較低， NH4+-N和pH則較高； 靠近居民區(qū)的C、E、F等采樣點(diǎn)的DO、NH4+-N和總磷比其他點(diǎn)均較高（表2）。

3.2 厭氧氨氧化細(xì)菌16S rDNA的PCR擴(kuò)增與克隆

利用厭氧氨氧化細(xì)菌16S rRNA基因引物對(duì)其進(jìn)行PCR， 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后顯示（圖 1）， 每個(gè)樣品中均得到目的條帶， 大小約500 bp， 且均為單一條帶。回收PCR產(chǎn)物， 重組至pMD18-T載體上， 提取質(zhì)粒后對(duì)該片段進(jìn)行擴(kuò)增、測(cè)序， 結(jié)果表明擴(kuò)增的條帶大小均為502—510 bp， 與厭氧氨氧化細(xì)菌16S rDNA序列相當(dāng)。經(jīng)Blast比對(duì)， 表明所擴(kuò)增的樣品均與已公布的厭氧氨氧化細(xì)菌同屬浮霉菌類 Planctomyces。以上結(jié)果表明該重組質(zhì)?？梢杂米鲄捬醢毖趸?xì)菌的熒光定量PCR檢測(cè)。

3.3 厭氧氨氧化細(xì)菌的熒光定量PCR檢測(cè)

采用SYBR染料法熒光定量PCR對(duì)滇池底泥樣品中的厭氧氨氧化細(xì)菌數(shù)量進(jìn)行檢測(cè)。圖 2顯示了根據(jù)重組質(zhì)粒DNA所構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線， 其回歸方程為y = -3.32x + 39.74， R2=0.997， 其中y為Ct值， x為log C0。

3.4 厭氧氨氧化細(xì)菌數(shù)量時(shí)間分布

圖 3顯示的是根據(jù)樣品的熒光定量PCR結(jié)果， 繪制了每個(gè)采樣點(diǎn)在不同采樣時(shí)間下的厭氧氨氧化細(xì)菌平均數(shù)量對(duì)比結(jié)果。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果， 厭氧氨氧化細(xì)菌在5月的數(shù)量介于 （2.83—8.64）×107（個(gè)/g樣品）， 而11月的樣品中細(xì)菌數(shù)量為 （1.30—4.50）×107（個(gè)/g樣品）。通過統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.01， 同一深度不同時(shí)期的厭氧氨氧化細(xì)菌數(shù)量具有極顯著性差異； 以不同采樣點(diǎn)進(jìn)行分析， P＞0.05， 不同采樣點(diǎn)的細(xì)菌數(shù)量不具有顯著性差異。

3.5 厭氧氨氧化細(xì)菌數(shù)量空間分布

圖 4顯示了厭氧氨氧化細(xì)菌平均數(shù)量空間分布的對(duì)比結(jié)果。淺層底泥中的厭氧氨氧化數(shù)量為（2.95—6.50）× 107（個(gè)/g樣品）， 而深層底泥細(xì)菌數(shù)量為6.51×107—2.34× 108（個(gè)/g樣品）。深層底泥中的厭氧氨氧化細(xì)菌數(shù)量明顯高于淺層底泥。通過統(tǒng)計(jì)分析， P＜0.01， 同一時(shí)期不同深度的厭氧氨氧化細(xì)菌數(shù)量具有極顯著性差異； 以不同采樣點(diǎn)進(jìn)行分析， P＞0.05， 不同采樣點(diǎn)的細(xì)菌數(shù)量不具有顯著性差異。

3.6 厭氧氨氧化細(xì)菌數(shù)量時(shí)空分布差異

將每個(gè)采樣時(shí)間與深度的樣品結(jié)合對(duì)比， 圖 5顯示了底泥中厭氧氨氧化細(xì)菌數(shù)量的時(shí)空分布。在每個(gè)采樣點(diǎn)， 11月所采的淺層樣品中厭氧氨氧化細(xì)菌數(shù)量相對(duì)最少， 可能的原因是此時(shí)水溫及底泥溫度較低， 同時(shí)由于接近上層水， 該區(qū)域氧含量較高， 因此該空間內(nèi)的厭氧氨氧化細(xì)菌數(shù)量最少； 反之， 5月份的深層樣品中厭氧氨氧化細(xì)菌數(shù)量最多。通過統(tǒng)計(jì)分析， 不同時(shí)期不同深度的厭氧氨氧化細(xì)菌數(shù)量具有極顯著性差異（P＜0.01）； 以不同采樣點(diǎn)進(jìn)行分析， 不同采樣點(diǎn)的細(xì)菌數(shù)量不具有顯著性差異（P＞0.05）。

3.7 厭氧氨氧化細(xì)菌數(shù)量與環(huán)境因子相關(guān)性分析

使用SPSS軟件對(duì)厭氧氨氧化細(xì)菌數(shù)量與底泥樣品中環(huán)境因子的相關(guān)性進(jìn)行分析。表 3-6分別是不同時(shí)空中的典型性相關(guān)分析矩陣。典型性相關(guān)分析矩陣表明， 在不同時(shí)空的底泥中， 厭氧氨氧化細(xì)菌的數(shù)量與水溫、DO和NH4+-N含量均具有相關(guān)性。在淺層底泥中厭氧氨氧化細(xì)菌的數(shù)量與DO的相關(guān)性大于深層底泥， 而深層底泥中其與NH4+-N含量的相關(guān)性大于淺層底泥， 說明在淺層底泥中， 制約厭氧氨氧化細(xì)菌生長(zhǎng)的主要因素是DO， 而在深層底泥中， 該因素主要是NH4+-N含量。

圖 1 厭氧氨氧化細(xì)菌16S rRNA基因PCR結(jié)果Fig. 1 16S rRNA gene PCR results of Anammox bacteria.

圖 2 重組質(zhì)粒實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 2 Real-time fluorescen quantitative PCR standard curve of recombinant plasmids

圖 3 厭氧氨氧化細(xì)菌數(shù)量的時(shí)間分布Fig. 3 Time distribution of numbers of Anammox bacteria

圖 4 厭氧氨氧化細(xì)菌數(shù)量的空間分布Fig. 4 Spatial distribution of number of Anammox bacteria

圖 5 厭氧氨氧化細(xì)菌數(shù)量的時(shí)空分布Fig. 5 Spatial and temporal distribution of number of Anammox bacteria

4 討論

通過對(duì)不同時(shí)間與深度的滇池底泥樣品的分析， 滇池中厭氧氨氧化細(xì)菌數(shù)量可達(dá)1.30×107—2.34×108（個(gè)/ g樣品）， 比土壤中厭氧氨氧化細(xì)菌數(shù)量略少［3］。從時(shí)間上比較， 春夏季底泥中厭氧氨氧化細(xì)菌數(shù)量高于秋冬季， 而從空間上比較， 則深層底泥多于淺層底泥。從時(shí)空上比較， 春夏季深層底泥中細(xì)菌數(shù)量最多， 而秋冬季淺層底泥則最少。同時(shí)研究中發(fā)現(xiàn)， 靠近人類生活區(qū)以及進(jìn)出水口等水流影響較大的位置， 其數(shù)量相對(duì)較少。

從時(shí)間上來看， 由于5月份日照時(shí)間長(zhǎng)， 水溫及底泥溫度都相對(duì)較高， 水中動(dòng)植物以及微生物的代謝強(qiáng)度大，氨氮水平較11月高， 有益于厭氧氨氧化細(xì)菌的繁殖?？傮w比較而言， 處于春夏交接的5月份， 厭氧氨氧化細(xì)菌數(shù)量明顯多于秋冬之交的11月。

從垂直空間分析， 淺層底泥中的氧含量要明顯高于深層， 厭氧氨氧化細(xì)菌對(duì)氧的存在十分敏感， 上層水與底泥的交界處存在大量水生植物， 導(dǎo)致淺層底泥中氧含量較高， 為好氧細(xì)菌主要分布的區(qū)域。而深層底泥中氧含量大幅減少， 同時(shí)由于少量好氧細(xì)菌與兼性細(xì)菌的存在，使得微環(huán)境中的氧分子進(jìn)一步減少， 為厭氧氨氧化細(xì)菌的生存提供了條件?？傮w比較而言， 深層底泥的厭氧氨氧化細(xì)菌數(shù)量高于淺層底泥。

表 3 5月淺層底泥典型性相關(guān)分析矩陣Tab. 3 Typical correlation matrix of shallow sediments sample in May

表 4 5月深層底泥典型性相關(guān)分析矩陣Tab. 4 Typical correlation matrix of deep sediments sample in May

表 5 11月淺層底泥典型性相關(guān)分析矩陣Tab. 5 Typical correlation matrix of shallow sediments sample in November

從水平空間分析， 厭氧氨氧化細(xì)菌數(shù)量在不同采樣點(diǎn)之間沒有顯著性差異， 可能的原因是同一深度的底泥成分差異不明顯， 對(duì)其數(shù)量的影響不如時(shí)間與深度的影響顯著。

通過對(duì)厭氧氨氧化細(xì)菌數(shù)量與環(huán)境因子的相關(guān)性分析， 結(jié)果顯示其與水溫、DO和NH4+-N含量均具有相關(guān)性， 在淺層底泥中， 制約厭氧氨氧化細(xì)菌生長(zhǎng)的主要因素是DO， 而深層底泥中， 該因素主要是NH4+-N含量。

表 6 11月深層底泥典型性相關(guān)分析矩陣Tab. 6 Typical correlation matrix of deep sediments sample in November

水環(huán)境中的氮循環(huán)， 很大一部分來自于厭氧氨氧化細(xì)菌的作用。由于國(guó)內(nèi)對(duì)高原淡水湖泊底泥中厭氧氨氧化細(xì)菌的研究較少， 因此對(duì)高原淡水湖泊的典型代表滇池沉積物的厭氧氨氧化細(xì)菌數(shù)量與時(shí)空分布的研究具有代表性的意義， 為將來對(duì)高原淡水湖泊的氮循環(huán)研究提供了一條新的思路。

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SPATIAL AND TEMPORAL DIFFERENCES OF ANAMMOX BACTERIAL DISTRIBUTION IN DIANCHI LAKE SEDIMENTS

CHEN Ze-Bin1，2， XIA Ti-Yuan1， WANG Ding-Kang3， XU Sheng-Guang1， HE Feng4and REN Zhen1
（1. Agriculture College， Kunming University， Kunming 650214， China； 2. Engineering Research Center for Characteristics Agriculture of Yunnan Province， Kunming 650214， China； 3. Life Science and Technology Department， Kunming University， Kunming 650214， China；4. Kunming Institute of Ecology of Dianchi Lake， Kunming 650228， China）

厭氧氨氧化細(xì)菌； 滇池沉積物； 實(shí)時(shí)熒光定量PCR； 季節(jié)變化； 空間分布

Anaerobic ammonia-oxidizing bacteria； Sediments of Dianchi Lake； Real-time fluorescent quantitative PCR； Seasonal changes； Spatial distribution

10.7541/2016.57

Q938.1

A

1000-3207（2016）02-0425-06

2015-03-18；

2015-07-28

云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究項(xiàng)目（2013FD040）； 昆明學(xué)院科學(xué)研究項(xiàng)目（XJL13018）； 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（41361056）； 云南省高校優(yōu)勢(shì)特色重點(diǎn)學(xué)科（生態(tài)學(xué)）建設(shè)項(xiàng)目資助； 昆明學(xué)院人才引進(jìn)項(xiàng)目（YJL14005） ［Supported by Applied Basci Research Projects of Yunnan （2013FD040）； Science Research Project of Kunming University （XJL13018）； National Natural Science Foundation of China（41361056）； Key Disciplines （Ecology） Project of Yunnan Education Department； Talent-Recruiting Program of Kunming University （YJL14005）］

陳澤斌（1985—）， 男， 云南昆明人； 博士， 副教授； 主要從事微生物生態(tài)學(xué)方面的研究。 E-mail: zbchenkmu@163.com

夏體淵（1978—）， E-mail: xiatiyuan@sohu.com