楊靜慧，王　敏，李 雕，秦艷筠，張偉玉，楊仁杰

（1.天津農(nóng)學(xué)院 園藝園林學(xué)院，天津 300384；2.天津農(nóng)學(xué)院 工程技術(shù)學(xué)院，天津 300384）

鹽脅迫下耐鹽苜蓿突變體的紅外光譜分析

楊靜慧1，王敏1，李 雕2，秦艷筠1，張偉玉2，楊仁杰2

（1.天津農(nóng)學(xué)院 園藝園林學(xué)院，天津 300384；2.天津農(nóng)學(xué)院 工程技術(shù)學(xué)院，天津 300384）

為了研究青睞耐鹽突變體的耐鹽生理機(jī)制，以青睞和青睞耐鹽突變體為試驗(yàn)材料，采用中紅外光譜技術(shù)，結(jié)合二階導(dǎo)數(shù)圖，對(duì)其鹽脅迫條件下官能團(tuán)的變化進(jìn)行了比較。結(jié)果表明：在鹽脅迫條件下，苜蓿比對(duì)照增加了1個(gè)吸收峰（1 862 cm-1波數(shù)），為酸酐類C=O官能團(tuán)；耐鹽苜蓿突變體比對(duì)照增加了1個(gè)吸收峰（1 440 cm-1波數(shù)），對(duì)應(yīng)的官能團(tuán)為C-H，為飽和烴類，包括烷烴、環(huán)烷烴、芳香烴類等，減少了1個(gè)吸收峰（1 640 cm-1波數(shù)），即萘環(huán)C=C官能團(tuán)。在正常生長(zhǎng)條件下，耐鹽突變體比普通苜蓿多了2個(gè)吸收峰（1 589 cm-1和1 640 cm-1），對(duì)應(yīng)的官能團(tuán)是胺類、酰胺類N-H和脂肪酸類C=O；少了1個(gè)吸收峰（1 608 cm-1），對(duì)應(yīng)的官能團(tuán)是芳烴類C=C。總之，分析顯示鹽脅迫變化的敏感特征峰普通苜蓿為1 862 cm-1，耐鹽苜蓿突變體為1 440 cm-1，耐鹽突變體的紅外光譜檢測(cè)發(fā)現(xiàn)了3個(gè)大的差異峰。所以，紅外光譜分析技術(shù)可以用于突變體鑒定。

苜蓿；突變體；鹽脅迫；紅外光譜

苜蓿被譽(yù)為“牧草之王”，也是世界公認(rèn)的健康食品和中草藥[1]。苜蓿是綠肥,是豆科植物，具有固氮作用，在抗旱、抗風(fēng)沙、防止水土流失、改良土壤、保護(hù)生態(tài)環(huán)境等方面也起到積極的作用[2]。但是，苜蓿的耐鹽性還有待提高，以用于鹽堿地的改良[3]。近年來(lái)，苜蓿的耐鹽育種研究逐漸增加，獲得了大量的突變體[4-5]。如何進(jìn)行突變體的快速鑒定是育種研究者急于解決的問(wèn)題。是否能將分析速度快、樣品無(wú)損耗、成本低和無(wú)污染[6-7]的紅外光譜技術(shù)用于苜蓿突變體的篩選和分析突變體變異的主要官能團(tuán)和成分是本研究的主要目的。

1　材料和方法

1.1材料

苜蓿品種為青睞，青睞植株（CK）和青睞突變體的普通愈傷組織和松散型胚性愈傷組織由天津農(nóng)學(xué)院園林植物實(shí)驗(yàn)室提供。其中青睞突變體是在0.3%EMS（誘變劑）和0.6%NaCl濃度的培養(yǎng)基上通過(guò)耐鹽篩選得到耐鹽突變愈傷組織，再經(jīng)過(guò)細(xì)胞再生獲得的突變體。普通愈傷組織和松散型胚型愈傷組織的誘導(dǎo)按照劉艷軍[8]和秦艷筠[9]的方法獲得。

1.2方法

1.2.1樣品耐鹽處理和采集

將不同處理的愈傷組織分別稱取0.5 g，放進(jìn)紗布中，浸入2%鹽水中1 h。對(duì)照為清水浸泡。每處理3次重復(fù)。再將其放進(jìn)烘干箱，先在105 ℃條件下烘干30 min，然后于55 ℃下持續(xù)烘干900 min，至完全干燥。粉碎，過(guò)0.15 mm準(zhǔn)篩。各取1.5 mg，KBr 紅外光譜儀—KBr壓片法制樣，測(cè)定。每處理設(shè)4次重復(fù)。

1.2.2樣品測(cè)定和數(shù)據(jù)分析

采用PerkinElmer公司FT-IR Spectrometer Froniter紅外光譜儀對(duì)上述樣品壓片通過(guò)透射方式進(jìn)行紅外采集，DTGS檢測(cè)器。光譜分辨率4 cm－1，測(cè)量范圍4 000～400 cm-1，OPD速度0.2 cm·s-1,增益為1,每個(gè)樣品累計(jì)掃描16次。掃描時(shí)扣除H2O和 CO2的干擾。光譜采集和一維、二維譜分析均采用Pekin Elmer公司的Spectrum v 5.0.1軟件處理獲得;2維平滑點(diǎn)數(shù)為11。運(yùn)用origin7.5軟件進(jìn)行紅外光譜與二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜分析。

2　結(jié)果與分析

2.1鹽脅迫下普通苜蓿的紅外光譜分析

從圖1中可以看出，對(duì)照CK與鹽脅迫處理后的苜蓿愈傷組織（苜蓿鹽脅迫）的紅外光譜圖無(wú)明顯差異，有5個(gè)波峰，分別是 1 052 cm-1、1 401～1 404 cm-1、1 599～1 608 cm-1、2 933 cm-1、3 348 cm-1，其中在1 052 cm-1波數(shù)上的吸收峰是醇類C-O、醚類 C-O-C (脂肪烴)、胺類C-N（烷基碳）伸縮振動(dòng)吸收。在1 401～1 404 cm-1波數(shù)上吸收峰是酸類O-H面內(nèi)變形振動(dòng)吸收。在1 599～1 608 cm-1波數(shù)上吸收峰是芳烴類C=C苯環(huán)骨架振動(dòng)吸收、胺類N-H變形振動(dòng)吸收、酰胺類N-H（伯酰胺）變形振動(dòng)吸收。在2 933 cm-1波數(shù)上的吸收峰是酸類O-H（二聚體）伸縮振動(dòng)吸收。在3 348 cm-1波數(shù)上的吸收峰是醇類O-H、胺類N-H、酰胺類N-H伸縮振動(dòng)吸收。

圖1　苜蓿與鹽脅迫下苜蓿的紅外光譜圖

2.2鹽脅迫下普通苜蓿的二階導(dǎo)數(shù)分析

從二階導(dǎo)數(shù)圖中可以看出，苜蓿愈傷組織鹽脅迫處理后比對(duì)照增加了1個(gè)特征峰，波數(shù)是1 862 cm-1，對(duì)應(yīng)的官能團(tuán)為酸酐類C=O，該類物質(zhì)為酸類，包括無(wú)機(jī)酸和有機(jī)酸。苜蓿突變體鹽脅迫后酸類物質(zhì)有所增加，這與孫偉澤在NaCl 脅迫對(duì)紫花苜蓿七種生理生化指標(biāo)影響研究一文中提到的植物在鹽脅迫下通過(guò)分泌有機(jī)酸，阻止鹽分進(jìn)入體內(nèi)的內(nèi)容相符合。進(jìn)一步推測(cè)這種酸類物質(zhì)可能是茉莉酸類物質(zhì)（JAS）。

JAS被公認(rèn)為一類新型植物內(nèi)源生長(zhǎng)物質(zhì),這類化合物具有生長(zhǎng)物質(zhì)活性。植物在機(jī)械傷害、病蟲(chóng)害、干旱、鹽脅迫等條件下的抗逆反應(yīng)都與茉莉酸類物質(zhì)的作用密切相關(guān)。在環(huán)境脅迫條件下JAS是驅(qū)動(dòng)植物防御基因表達(dá)過(guò)程中信號(hào)傳遞的必要組成部分。在創(chuàng)傷、水分虧缺和滲透脅迫時(shí)，燕麥、大豆、煙草、擬南芥、大麥和玉米等植物中內(nèi)源 JAS 含量急劇上升[10]。所以，1 862 cm-1吸收峰是苜蓿鹽脅迫反應(yīng)的特征峰。

2.3鹽脅迫處理下的耐鹽苜蓿突變體的紅外光譜分析

從圖2中可以看出，對(duì)照CK的二階導(dǎo)數(shù)圖有16個(gè)吸收峰，鹽脅迫處理的有17個(gè)吸收峰。其中共同峰是在波數(shù)696～1 812 cm-1范圍內(nèi)，696 cm-1波數(shù)對(duì)應(yīng)的是酰鹵類C=Cl伸縮振動(dòng)、芳烴類C-H（單取代）、C-H（間位雙取代）面外變形振動(dòng)，在767 cm-1波數(shù)對(duì)應(yīng)的是芳烴類C-H（間位雙取代）面外變形振動(dòng)，832～834 cm-1波數(shù)對(duì)應(yīng)的是芳烴類C-H（對(duì)位雙取代）的面外變形振動(dòng)吸收，920～922 cm-1波數(shù)對(duì)應(yīng)的是酸類O-H的面內(nèi)變形振動(dòng)吸收和酸酐類的C-O伸縮振動(dòng)吸收，996～998 cm-1波數(shù)對(duì)應(yīng)的是酸酐類C-O的伸縮振動(dòng)吸收，1 050 cm-1波數(shù)對(duì)應(yīng)的分別是醇類的C-O、醚類的C-O-C（脂肪烴）、酸酐類C-O、胺類的C-N（烷基碳）的伸縮振動(dòng)吸收，1 150 cm-1波數(shù)上對(duì)應(yīng)的分別是醇類的C-O、醚類的C-O-C（脂肪烴）、胺類的C-N（烷基碳）、酮類的C-C的伸縮振動(dòng)吸收，1 240 cm-1波數(shù)對(duì)應(yīng)的分別是醇類C-O、醚類C-O-C（脂肪烴）、酸類C-O-C、酯類C-O-C（乙酸酯）、酮類C-C的伸縮振動(dòng)吸收，1 329 cm-1波數(shù)對(duì)應(yīng)的是胺類C-N(芳基碳)的伸縮振動(dòng)吸收，波數(shù)1 438～1 440 cm-1對(duì)應(yīng)的是酸類O-H面內(nèi)變形振動(dòng)吸收，1 500 cm-1波數(shù)對(duì)應(yīng)的是胺類N-H變形振動(dòng)吸收，1 528～1 529 cm-1波數(shù)對(duì)應(yīng)的是胺類N-H、酰胺類N-H(仲酰胺)變形振動(dòng)吸收，1 600 cm-1波數(shù)對(duì)應(yīng)的是胺類N-H、酰胺類N-H（伯酰胺）變形振動(dòng)吸收，酰胺類C=O伸縮振動(dòng)吸收，1 740 cm-1波數(shù)對(duì)應(yīng)的是酸類C=O、酯類C=O、酸酐類C=O伸縮振動(dòng)吸收，1 812 cm-1波數(shù)對(duì)應(yīng)的是酸酐類C=O伸縮振動(dòng)吸收。

圖2　苜蓿與鹽脅迫下苜蓿的二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜圖

從圖3中可以看出，鹽脅迫下苜蓿突變體與對(duì)照CK的紅外光譜圖大體相似，有6個(gè)波峰。分別在1 049～1 052 cm-1、1 403～1 404 cm-1、1 589～1 596 cm-1、1 640～1 665 cm-1、2 926 cm-1、3 348 cm-1。各吸收峰對(duì)應(yīng)的官能團(tuán)同前2.1。

圖3　鹽脅迫下苜蓿突變體的紅外光譜圖

2.4鹽脅迫下苜蓿突變體的的二階導(dǎo)數(shù)分析

從圖4可以看出，鹽脅迫下的苜蓿突變體與對(duì)照CK的二階導(dǎo)數(shù)圖分別有18、17個(gè)吸收峰。各吸收峰對(duì)應(yīng)的官能團(tuán)同前2.2。在1 401～1 500 cm-1波數(shù)區(qū)間，鹽脅迫使苜蓿突變體比對(duì)照CK增加了1個(gè)特征峰，波數(shù)是1 440 cm-1，對(duì)應(yīng)的官能團(tuán)為C-H，為飽和烴類，對(duì)應(yīng)的物質(zhì)為烷烴、環(huán)烷烴、芳香烴類等。但是，在1 500~1 680 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)，鹽脅迫使苜蓿突變體比對(duì)照CK減少了1個(gè)特征峰，該峰的波數(shù)是1 640 cm-1, 對(duì)應(yīng)的官能團(tuán)為芳烴類C=C。

圖4　鹽脅迫下苜蓿突變體的的二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜圖

2.5普通苜蓿與苜蓿突變體的紅外光譜分析

從圖5中可以看出，普通苜蓿CK與苜蓿突變體在正常生長(zhǎng)條件下的紅外光譜圖有明顯差異，普通苜蓿有5個(gè)波峰，苜蓿耐鹽突變體有6個(gè)波峰。其中二者共同的吸收峰的波數(shù)分別是1 052 cm-1、1 404 cm-1、3 348 cm-1。

在1 404~2 933 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)，苜蓿耐鹽突變體增加了2個(gè)特征峰，波數(shù)分別是1 589 cm-1和1 640 cm-1，減少了1個(gè)特征峰，波數(shù)是1 608 cm-1，三處波峰對(duì)應(yīng)的官能團(tuán)相同，但可以從出現(xiàn)特征峰的位置進(jìn)行區(qū)分。

圖5　普通苜蓿與苜蓿耐鹽突變體的紅外光譜圖

2.6普通苜蓿與苜蓿突變體的二階導(dǎo)數(shù)分析

從圖6可以看出，普通苜蓿與苜蓿突變體的二階導(dǎo)數(shù)圖分別有16和17個(gè)吸收峰。在波數(shù)696～1 330 cm-1范圍內(nèi)，共有的峰是696 cm-1、767～768 cm-1、832～836 cm-1、922～924 cm-1、996～998 cm-1、1 050 cm-1、1 150 cm-1、1 240 cm-1、1 329～1 330cm-1波數(shù)。

圖6　普通苜蓿、苜蓿耐鹽突變體的二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜圖

3　結(jié)　論

與普通苜蓿相比，耐鹽突變體在1 329～1 500 cm-1范圍內(nèi)增加的特征峰的波數(shù)是1 410 cm-1，減少的特征峰的波數(shù)是1 440 cm-1，它們對(duì)應(yīng)的官能團(tuán)是酸類O-H。在1 500～1 840 cm-1范圍內(nèi)，耐鹽突變體比普通苜蓿增加1 640 cm-1、1 790 cm-1、1 840 cm-1處的吸收峰，其中1 640 cm-1處對(duì)應(yīng)的官能團(tuán)是芳酮C=O。在1 790 cm-1和1 840 cm-1處對(duì)應(yīng)的官能團(tuán)是環(huán)酸酐C=O。耐鹽突變體比普通苜蓿減少的特征峰的波數(shù)是1 812 cm-1，對(duì)應(yīng)的官能團(tuán)是酰鹵類C=O。

總之，在鹽脅迫條件下，鹽使苜蓿增加了1個(gè)吸收峰1 862 cm-1，為酸酐類C=O；鹽使耐鹽苜蓿突變體增加了1個(gè)1 440 cm-1吸收峰，對(duì)應(yīng)的為飽和烴類C-H，減少了1 640 cm-1吸收峰，即芳烴類萘環(huán)C=C。

在正常生長(zhǎng)條件下，耐鹽突變體與普通苜蓿的差異是，耐鹽突變體增加了2個(gè)特征峰（ 1 589 cm-1和1 640 cm-1），減少了1個(gè)特征峰，波數(shù)是1 608 cm-1，3處波峰對(duì)應(yīng)的官能團(tuán)一樣，但可以從出現(xiàn)特征峰的位置進(jìn)行區(qū)分。

[1]高宇，石杰，王云云，等.苜蓿的藥用功效和開(kāi)發(fā)利用[J].畜牧與飼料科學(xué)，2011，32（12）：25-26.

[2]嚴(yán)衍祿，趙龍蓮，韓東海，等.近紅外光譜分析基礎(chǔ)與應(yīng)用[M].北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社，2005.

[3]胡明貴，張德魁.鹽漬地人工苜蓿草地生產(chǎn)力與土壤改良研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（17）：7421-7422， 7463.

[4]米偉，楊靜慧.鹽脅迫下轉(zhuǎn)過(guò)表達(dá)HS轉(zhuǎn)錄因子苜蓿突變體的生理生化變化[J].分子植物育種，2015，13（3）：658-662.

[5]杜長(zhǎng)城，楊靜慧，任慧朝，等.不同品種紫花苜蓿的耐鹽性篩選試驗(yàn)[J].天津農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，14（5）：14-16. [6]武春霞，楊躍，楊靜慧，等.鹽脅迫下3種耐鹽植物的種子萌發(fā)和生長(zhǎng)及其耐鹽性研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（10）：3968-3969， 3979.

[7]胡妍妍，王穎，楊靜慧，等.不同類型苜蓿愈傷組織細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)比較[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2014，29（5）：130-133.

[8]田瑞娟，楊靜慧，梁國(guó)魯.不同品種紫花苜蓿耐鹽性研究[J].西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2006，28（6）：93-97.

[9]楊靜慧，秦艷筠，劉婷，等.兩種愈傷組織生理生化特性和形態(tài)結(jié)構(gòu)比較[J].天津農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，20（8）：22-24.

[10]李紅利，孫振元，趙梁軍，等.茉莉酸類物質(zhì)對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育及抗性的影響[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2009，25（16）：167-172.

試驗(yàn)研究

S551+.7

A

1002-0659（2016）05-0001-03

2016-03-28

天津市科技成果轉(zhuǎn)化及產(chǎn)業(yè)化推進(jìn)計(jì)劃項(xiàng)目（14ZXNZNC0040）；天津市農(nóng)委項(xiàng)目（201502100）

主要作者簡(jiǎn)介：楊靜慧（1961-），女，教授，博士,主要從事園藝植物栽培、抗逆生理和分子育種研究工作。E-mail: ajinghuiyang2@aliyun.com