蔡兆煒，邳學(xué)杰，郭韋韋

（1.天津泰達綠化集團有限公司，天津 300457；2.北京林業(yè)大學(xué)，北京 100083）

試驗研究

國槐爛皮病的病原菌鑒定及其防治措施

蔡兆煒1，邳學(xué)杰1，郭韋韋2

（1.天津泰達綠化集團有限公司，天津 300457；2.北京林業(yè)大學(xué)，北京 100083）

國槐是天津濱海新區(qū)園林綠化的重要樹種。為明確引起國槐爛皮病的病菌種類，對采自濱海新區(qū)范圍內(nèi)的國槐爛皮病病枝進行病菌培養(yǎng)和分離純化，結(jié)合病原菌的形態(tài)特征和致病性，通過rDNA-ITS序列分析和BLAST比對來鑒定病原菌種類，得到兩種不同類別的主要病原菌（GL1、GL2），GL1與Fusarium tricinctum(Corda)Sacc.（登錄號HQ845047.1）的同源性達到了100%，GL2與Tubercularia vulgaris (Tode) Fr.（登錄號HM054135.1）的同源性達到99%。針對國槐爛皮病提出相應(yīng)的防治措施，為濱海新區(qū)綠化養(yǎng)護提供依據(jù)。

國槐；爛皮?。徊≡?；防治措施

國槐爛皮病是腐爛病的一種，是國槐的主要枝干病害，表現(xiàn)為枯梢型和干腐型兩種。該病在中國華北、西北和其他管理水平較低的區(qū)域均有發(fā)生。在天津濱海新區(qū)多發(fā)生于幼樹片林和移栽苗木上，主要表現(xiàn)為較常見的干腐型。發(fā)生初期，病斑表現(xiàn)為黃褐色水漬狀，近圓形，漸次發(fā)展為菱形，病皮組織腐爛、變軟，有酒糟味，木質(zhì)部表面出現(xiàn)褐變，病斑失水后，樹木干皮下陷或開裂；發(fā)生后期，病斑不斷擴大，皮層纖維分離如麻狀，易剝離，直至病斑環(huán)切枝干造成上部死亡。

目前，國內(nèi)外研究者對國槐爛皮病病原菌種類及其歸屬進行了一些研究，發(fā)現(xiàn)Valsa sordida Nit、Cytospora chrysosperma(Pers)Fr、Fusarium sp、Dot-hiorella sp等均可引起國槐爛皮病[1-3]。本試驗對天津濱海新區(qū)經(jīng)濟技術(shù)開發(fā)區(qū)和東疆港區(qū)兩個區(qū)域的國槐爛皮病發(fā)病組織進行抽樣采集，并進行分離培養(yǎng)與純化，根據(jù)病菌形態(tài)和致病性，應(yīng)用基于核糖體RNA基因(即rDNA)內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Internal Transcribed Spacer,ITS)的序列分析(rDNA-ITS序列分析)的方法[4-5]，對該病害的致病菌種類進行鑒定，并從實際應(yīng)用的角度提出園林綠化養(yǎng)護工作中防治國槐爛皮病的具體措施，為濱海新區(qū)的綠化養(yǎng)護生產(chǎn)實踐提供依據(jù)。

1　材料和方法

1.1試驗地概況

試驗樣品采集地點為天津市濱海新區(qū)經(jīng)濟技術(shù)開發(fā)區(qū)和東疆港區(qū)范圍內(nèi)的國槐行道樹和防護林。該區(qū)域?qū)儆谂瘻貛О霛駶櫞箨懠撅L(fēng)型氣候，冬季寒冷干燥，夏季氣溫高、濕度大，全年平均氣溫12.3 ℃，高溫極值40.9 ℃，低溫極值-18.3 ℃。年平均降水量 618 mm，降水隨季節(jié)變化顯著[6]，因地理位置臨近渤海灣，風(fēng)力較強。本地區(qū)原有土壤為濱海鹽堿土，大多質(zhì)地粘重，但含鹽量大，一般在0.6%以上，鹽分組成以氯化物為主，pH值多在8以上，有機質(zhì)在0.39～1.84%之間，全氮含量在0.03%～0.1%之間。地下水位小于1 m，地下水礦化度高達30 mg·L-1[7]。

1.2試驗方法

1.2.1病原菌的分離與純化

根據(jù)國槐爛皮病的病害癥狀特征，在試驗區(qū)內(nèi)抽樣采集發(fā)病枝條樣品帶回實驗室，在顯微鏡下觀察發(fā)病枝條表面癥狀并將其分類，采用常規(guī)組織分離法和單孢分離法分別進行分離純化[8]，獲得純化病原菌GL1、GL2。

1.2.2病原菌的形態(tài)特征觀察

將純化的病原菌接種于無菌PDA平板培養(yǎng)基上，在25 ℃下恒溫培養(yǎng)，7 d后觀察其菌落特征，在顯微鏡下觀察分生孢子形態(tài)。

1.2.3分子生物學(xué)鑒定

采用CTAB法提取病原菌的DNA，通過真菌核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）PCR擴增的通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）對提取的病原菌DNA進行PCR擴增，反應(yīng)條件和反應(yīng)程序參照葉振風(fēng)等[9]的研究。產(chǎn)物由上海英駿生物技術(shù)有限公司進行測序，測序結(jié)果在GenBank網(wǎng)站的數(shù)據(jù)庫中進行比對，并通過Blast工具在線搜索同源性較高的已知序列，以此為基礎(chǔ)鑒定病原菌。

2　結(jié)果與分析

2.1病原菌的分離純化及其形態(tài)特征

通過觀察發(fā)病枝條的表面癥狀，可將致病病原菌大致分為兩類。第一類病斑表現(xiàn)為圓形至菱形，黃褐色（圖1 A、B、C），分生孢子長條形，微曲，有3隔膜(圖1D)，PDA培養(yǎng)基上的菌落前期呈淡綠至黃褐色，氣生菌絲絮狀，致密，后期孢子顏色逐漸加深，菌落變?yōu)榘导t褐色（圖1E），編號為GL1。第二類病斑表現(xiàn)為圓球形至不規(guī)則形，黑褐色（圖2 A、B、C），分生孢子單生，短棒狀（圖2 D），PDA培養(yǎng)基上的菌落為白色的羽毛狀，具少量氣生菌絲（圖2E），編號為GL2。

圖1　病原菌形態(tài)特征及培養(yǎng)形態(tài)（GL1）

A～C被害植物表面癥狀　D分生孢子　E培養(yǎng)形態(tài)（7 d）

2.2病原菌rDNA-ITS分子鑒定

以GL1、GL2菌株的基因組DNA為模版，采用rDNA的ITS區(qū)段通用引物ITS1和ITS4進行PCR擴增，均獲得1條遷移率相同且分子質(zhì)量約500 bp的擴增條帶，進行測序后將結(jié)果與NCBI中已登錄的相似菌株進行同源性BLAST比對，發(fā)現(xiàn)GL1、GL2與已登錄的部分菌株均存在較高的同源性，其中，GL1與Fusarium tricinctum(Corda)Sacc.（登錄號HQ845047.1）[10]的同源性達到了100%（圖3），GL2與10余種已登錄的病原菌的同源性均達到了98%[3,11-12]，但與Tubercularia vulgaris (Tode) Fr.（登錄號HM054135.1）的Max Score和Total Score最高（931）（圖4）。經(jīng)鑒定，引起濱海新區(qū)國槐爛皮病的病原菌GL1、GL2確定為Fusarium tricinctum(Corda)Sacc.和Tubercularia vulgaris (Tode) Fr.。

圖3　ITS序列Blast結(jié)果（GL1）

圖4　ITS序列Blast結(jié)果（GL2）

3　結(jié)論與討論

3.1國槐爛皮病的發(fā)生原因

3.1.1氣候因素導(dǎo)致

爛皮病的發(fā)生，受環(huán)境影響很大。由于大氣環(huán)境的惡化，冬季氣溫上升，造成成片林木中的細菌病毒存活基數(shù)增大，從而加大了控制難度。病害發(fā)生期若空氣濕度大，較易發(fā)生病菌滋生傳播。

3.1.2栽植過程不合理

行道綠化、防護林等主要栽植國槐的地域，其種植品種和結(jié)構(gòu)較為單一，若栽植密度大，則易出現(xiàn)通風(fēng)不良，樹木在新的環(huán)境里適生性能較差，若苗木在出圃前后發(fā)現(xiàn)有蟲傷、機械傷以及斷根和樹皮撕裂，或在運輸過程中受到擠壓傷和碰傷留下機械傷口，都為腐爛病菌侵染提供了有利條件。此外，幼樹栽植過早較易受到凍害、風(fēng)害等自然災(zāi)害的侵襲，從客觀上講為腐爛病菌的侵染提供了誘因，導(dǎo)致感病率高，死亡率高[2]。

3.1.3養(yǎng)護管理不到位

在苗木采購、運輸、檢疫等環(huán)節(jié)中缺乏嚴(yán)格的監(jiān)督和管理機制，苗木質(zhì)量得不到保證，直接影響其生長和抗病能力。重栽輕管現(xiàn)象仍然存在，苗木栽植處土壤孔隙大，蓄水、保水能力差，不及時進行涂白、施肥，微量元素缺乏，導(dǎo)致樹木營養(yǎng)不良，樹勢衰弱，另外，苗木栽后沒有定期開展撫育，長勢差，或撫育過程中造成樹體的機械傷或剪口傷，這些都促使腐爛病菌流行蔓延。此外，濫用農(nóng)藥也會導(dǎo)致病毒細菌的抗藥性愈來愈強，治理起來更困難。

3.1.4監(jiān)測防治體系不健全

目前濱海新區(qū)對城市園林植物病害的監(jiān)測體系還不健全，基本由各區(qū)域園林綠化部門分別監(jiān)測，監(jiān)測方法較為粗放單一，大多仍通過人工踏查，個別區(qū)域未配備適用的監(jiān)測儀器，如放大鏡、做標(biāo)本的必備工具等。國槐栽植范圍點多面廣，尚無有效適用的全面監(jiān)測體系是國槐爛皮病發(fā)生的又一重要原因。

3.2防治措施探討

3.2.1適地適樹

堅持適地適樹的原則，選擇在適合國槐生長的立地條件上栽植苗木，盡量營造混交林，若用作行道綠化和防護林，應(yīng)與其他樹種搭配栽植為宜。

3.2.2科學(xué)栽植

明確作業(yè)技術(shù)規(guī)程，嚴(yán)格控制選苗、運苗、栽植等過程，保證運輸過程中做好保護措施，避免機械損傷，做到隨起隨栽，澆足底水，縮短返苗期，增強抗性[1]。栽植前采取浸根24 h以上或蘸泥漿等方法，保證合理的栽植密度，確保通風(fēng)良好。

3.2.3及時涂白

樹干涂白是預(yù)防和治理腐爛病的有效措施，對于幼樹尤為重要。涂白劑采用生石灰：硫磺粉：水= 1：1：3的比例，為增加附著力也可適量加入食鹽?？稍谠绱喊l(fā)病初期涂抹，對病菌有一定的抑制作用，并能促進病斑愈合。在初冬時將樹上的病枝、弱枝、老化枝及時剪除并集中燒毀，然后對樹干進行涂抹[13]。

3.2.4加強養(yǎng)護管理

對國槐苗木進行松土除草、科學(xué)施肥、合理灌溉，增強樹木長勢，提高樹木免疫能力。同時要適時開展整枝修剪、間伐等，防止樹木抽條、干梢，促進林木正常生長。要及時剪除病枝、枯枝，將剪下的枝條及時運走和處理，防止病菌蔓延。

3.2.4化學(xué)防治

感病較輕的植株或林木，在加強養(yǎng)護管理、提高樹木長勢的同時，可用刀片刮除病斑，選用10倍的食用堿水或50%退菌特100倍液等藥劑進行噴干或涂干處理。對嚴(yán)重感染的國槐，應(yīng)及時砍去病株或刮除病部，噴灑或涂抹50%多菌靈、或50%退菌特、或70%甲基托布津等藥劑。

致謝：本試驗在北京林業(yè)大學(xué)省部共建森林培育與保護教育部重點實驗室完成，論文撰寫過程中受到北京林業(yè)大學(xué)森林保護學(xué)范鑫磊博士的幫助和指導(dǎo)，特此感謝。

[1]呂建成,孫玉喜,孫國宏,等.樹木爛皮病的發(fā)生及防治研究[C]//全國園林植保第十三次學(xué)術(shù)討論會論文摘要集.北京：中國風(fēng)景園林學(xué)會，2004:4-5.

[2]吳淑芳，李娟.2006年春季西平縣國槐腐爛病發(fā)生情況及流行原因分析[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2010（19）：167-167，169.

[3]GADGIL P D. Fungi on trees and shrubs in New Zealand[J]. Fungi of New Zealand,2005,4:437.

[4]燕勇，李衛(wèi)平，高雯潔，等.rDNA-ITS序列分析在真菌鑒定中的應(yīng)用[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2008，18（10）：1958-1961.

[5]索相敏，王獻革，李學(xué)營，等.rDNA ITS序列在果樹真菌病害研究中的應(yīng)用[J].江西農(nóng)業(yè)學(xué)報，2015，27（5）：22-24.

[6]丁衛(wèi)東.天津港區(qū)氣候特點對引航的影響[J].港口經(jīng)濟，2010（3）：52-53.

[7]洪雪姣，邳學(xué)杰，崔丙云，等.楊樹爛皮型，水泡型潰瘍病的藥劑防治試驗[J].天津農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，20（6）：118-123.

[8]方中達.植病研究方法[M].3版.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，1998：57-125.

[9]葉振風(fēng)，吳湘琴，呂冠華，等.梨樹腐爛病的病原菌鑒定和化學(xué)藥劑篩選[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2015（2）：49-55.

[10]ZHUANG W Y. Fungi of northwestern China[M]. New York:Ithaca, N Y,2005：430.

[11]CHEN M M. Forest fungi phytogeography: forest fungi phytogeography of China, North America, and Siberia and international quarantine of tree pathogens[M]. Sacramento, California: Pacific Mushroom Research and Education Center, 2002:469.

[12]DUDKA I O, HELUTA V P, TYKHONENKO Y Y, et al. Fungi of the Crimean peninsula[M].Ukrame:Institute of Botany, National Academy of Sciences of Ukraine, 2004:452.

[13]李希喬.防治國槐腐爛病[J].新農(nóng)業(yè)，2007（3）：51.

試驗研究

S792.26

A

1002-0659（2016）05-0010-03

2016-03-02

主要作者簡介：蔡兆煒（1989-），男，碩士，主要從事城市園林綠化養(yǎng)護工作。E-mail：306669971@qq.com