聶峰杰, 詹 紅, 張 麗, 宋玉霞*, 鞏 檑,甘曉燕, 陳虞超, 石 磊, 張國輝

(1.寧夏農(nóng)林科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心, 銀川 750002; 2. 寧夏馬鈴薯脫毒種薯繁育中心, 銀川 750024; 3. 寧夏農(nóng)林科學(xué)院固原分院, 固原 756000)

?

RT-PCR技術(shù)對寧夏馬鈴薯脫毒種薯病毒檢測的研究

聶峰杰1, 詹 紅2, 張 麗1, 宋玉霞1*, 鞏 檑1,甘曉燕1, 陳虞超1, 石 磊1, 張國輝3

(1.寧夏農(nóng)林科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心, 銀川 750002; 2. 寧夏馬鈴薯脫毒種薯繁育中心, 銀川 750024; 3. 寧夏農(nóng)林科學(xué)院固原分院, 固原 756000)

病毒病是影響馬鈴薯生產(chǎn)的重要病害,為了解寧夏地區(qū)馬鈴薯種薯生產(chǎn)中的病毒發(fā)生情況,在銀川市、固原市和西吉縣不同種植模式的脫毒種薯生產(chǎn)基地,對不同品種的原原種、原種、一級種在不同生育期隨機采集樣品,利用RT-PCR檢測技術(shù)對4種馬鈴薯主要病毒PVX、PVY、PVS、PLRV和類病毒PSTVd進行檢測。結(jié)果表明:PVX、PVY、PVS、PLRV在3個基地均有不同程度檢出,成熟期病毒檢出率分別為35%、28%、35%和34%,未檢出PSTVd;4種病毒檢出率在馬鈴薯現(xiàn)蕾期以后呈現(xiàn)顯著性增長;病毒檢出率隨著種薯繁育級別增加差異顯著;6個馬鈴薯品種均為感病品種;大田種植種薯的病毒檢出率顯著高于防蟲網(wǎng)室。

馬鈴薯; 病毒檢測; RT-PCR

病毒病是危害馬鈴薯生產(chǎn)的重要病害,在全世界馬鈴薯產(chǎn)區(qū)均有分布。目前,已發(fā)現(xiàn)的馬鈴薯病毒、類病毒有近40種[1],我國常見的有8種,包括馬鈴薯X病毒(PVX)、馬鈴薯Y病毒(PVY)、馬鈴薯S病毒(PVS)、馬鈴薯卷葉病毒(PLRV)、馬鈴薯A病毒(PVA)、馬鈴薯皺縮花葉病毒(PVM)、馬鈴薯古巴花葉病毒(PAMV)和馬鈴薯紡錘形塊莖類病毒(PSTVd)[2-3]。馬鈴薯受病毒侵染后主要表現(xiàn)為花葉、卷葉、植株矮小、葉片失綠、塊莖變小、龜裂、內(nèi)部網(wǎng)狀壞死等,嚴重時種薯失去發(fā)芽能力,病毒逐代積累引起馬鈴薯品種退化, 產(chǎn)量和品質(zhì)下降,一般引起減產(chǎn)20%～30%,如果多種病毒混合侵染可造成減產(chǎn)80%以上[4-5]。目前馬鈴薯病毒病的防治主要包括生產(chǎn)脫毒種薯、抗病毒品種選育和施用抗病毒藥劑,其中生產(chǎn)脫毒種薯是控制馬鈴薯病毒病最有成效的手段[6-7]。但在脫毒種薯生產(chǎn)中,病毒病的發(fā)生與馬鈴薯品種、脫毒種薯級別、種植地區(qū)和生產(chǎn)管理等有很大的相關(guān)性,病毒的種類和生產(chǎn)環(huán)境也密切相關(guān)。馬鈴薯病毒檢測方法主要有血清學(xué)檢測的酶聯(lián)免疫吸附試驗法(ELISA)和分子生物學(xué)的反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)。RT-PCR的靈敏度可達pg級,甚至達fg級[8-9],顯著高于ELISA,因其具有靈敏度高、特異性強、重復(fù)性好的優(yōu)點,已逐漸取代ELISA成為馬鈴薯病毒檢測中應(yīng)用最廣泛的技術(shù)。自二十世紀九十年代起,RT-PCR檢測技術(shù)已在PVX、PVY、PVS、PVA、PLRV、PSTVd等多種馬鈴薯病毒、類病毒的檢測中廣泛應(yīng)用[10-11]。為了提高檢測效率、降低檢測成本,董代幸等[12]、羅文斌等[13]相繼建立了不同馬鈴薯病毒的多重RT-PCR技術(shù)體系,實現(xiàn)了多種病毒同時檢測。

馬鈴薯是寧夏種植面積第二大的優(yōu)勢特色產(chǎn)業(yè),脫毒種薯生產(chǎn)初具規(guī)模。由于寧夏馬鈴薯脫毒種薯繁育體系起步晚、底子薄、基礎(chǔ)弱,與國內(nèi)外先進生產(chǎn)單位存在一定差距,制約了種薯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因此,本研究應(yīng)用RT-PCR檢測技術(shù)對寧夏馬鈴薯脫毒種薯繁育基地的脫毒種薯進行了病毒檢測,明確了寧夏主要馬鈴薯病毒種類,分析了不同種植條件、不同品種和各級別脫毒種薯病毒病的發(fā)生情況,探尋馬鈴薯脫毒種薯生產(chǎn)中存在的主要問題,為病毒病的防治和進一步提高脫毒種薯生產(chǎn)質(zhì)量提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

2014年4-9月,在銀川市、固原市及西吉縣馬鈴薯脫毒種薯繁育基地,按照GB18133規(guī)定的取樣規(guī)則,分別于馬鈴薯幼苗期、現(xiàn)蕾期、盛花期、莖葉衰老期和成熟期,隨機采集不同級別種薯(原原種、原種、一級種)植株的幼嫩新鮮葉片,莖葉衰老期和成熟期同時采集新鮮薯塊(每個樣本數(shù)量為30)用于RT-PCR檢測。采樣地概況、采集品種等見表1。

表1 馬鈴薯脫毒種苗樣品采集信息Table 1 Sample information of virus-free seed potatoes

1.2 試劑與設(shè)備

RNA提取試劑盒TransZol UP和TransZol Plant購自Trans公司,反轉(zhuǎn)錄試劑和PCR試劑購自Promage公司。高速冷凍離心機、高速微量離心機、超微量分光光度計、PCR儀及凝膠成像系統(tǒng)均為Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.3 樣品處理

稱取0.5～1.0 g馬鈴薯葉片或薯塊,放入經(jīng)DEPC水處理后的研缽中,加入液氮磨成細粉,迅速轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管中,用于RT-PCR檢測,每個樣品重復(fù)3次。

1.4 馬鈴薯病毒RT-PCR檢測

采用TransZol UP法提取葉片樣本RNA,TransZol Plant法提取薯塊樣本RNA,檢測濃度后將樣品稀釋至500 ng/μL。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Go Script Reverse Transcription System)合成第一鏈cDNA。根據(jù)馬鈴薯肌動蛋白基因(actin),馬鈴薯X病毒(PVX)、馬鈴薯Y病毒(PVY)、馬鈴薯S病毒(PVS)和馬鈴薯卷葉病毒(PLRV)的基因組RNA保守序列設(shè)計特異性引物對(表2)。分別利用內(nèi)參基因actin和病毒基因的上下游引物對合成的cDNA進行一步RT-PCR擴增反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系的總體積為25 μL,包括:10×buffer 2.5 mmol/L,dNTPs 0.2 mmol/L,上游引物和下游引物各0.4 μmol/L,TaqDNA polymerase 0.1 U,補足ddH2O至25 μL。反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性2 min；94℃變性45 s,55℃復(fù)性45 s,72℃延伸1 min,循環(huán)34次;72℃保溫10 min。擴增產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

表2 馬鈴薯內(nèi)參基因及病毒基因引物Table 2 Primers for actin and potato virus genes

1.5 數(shù)據(jù)分析

病毒檢出率為所采集樣品檢出率3次重復(fù)平均值。采用 SPSS (20.0) One-way ANOVA程序?qū)z測結(jié)果進行方差分析和Duncan氏差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬鈴薯脫毒種薯病毒RT-PCR檢測分析

以提取的樣本RNA為模板合成cDNA。以actin基因的上下游引物,對合成的cDNA進行RT-PCR擴增反應(yīng),擴增產(chǎn)物部分結(jié)果見圖1,所有樣本均能擴增得到227 bp的基因片段,表明提取的RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA質(zhì)量良好,可進一步用于后續(xù)檢測。以上述反轉(zhuǎn)錄合成cDNA為模板,以PVX、PVY、PVS、PLRV和PSTVd基因上下游引物分別進行RT-PCR擴增反應(yīng),部分擴增結(jié)果見圖2,在所檢測的樣品中,攜帶PVX、PVY、PVS和PLRV病毒的樣品分別擴增出約為562、447、800和336 bp的基因片段,與預(yù)期4種病毒基因片段大小相符,可分別判定為PVX、PVY、PVS和PLRV帶毒陽性株系,未檢出PSTVd。

2.2 脫毒馬鈴薯不同生育期病毒檢測

對銀川市、固原市及西吉縣3個基地種植的脫毒種薯幼苗期、現(xiàn)蕾期、盛花期、果實膨大期和成熟期的樣品進行了檢測,檢測結(jié)果(圖3)表明,3個基地的脫毒種薯幼苗期PVX、PVY、PVS和PLRV的檢出率分別為1%、1%、2%和1%,未檢出PSTVd;至成熟期4種病毒檢出率分別為35%、28%、35%和34%,未檢出PSTVd。在馬鈴薯整個生育期中病毒的檢出率整體呈現(xiàn)為前期病毒檢出率低,后期病毒檢出率升高的上升趨勢,經(jīng)方差分析,各種病毒檢出率在幼苗期和現(xiàn)蕾期差異不顯著,除PVY以外,其他3種病毒現(xiàn)蕾期以后各時期的檢出率增長具有呈顯著性差異。

圖1 馬鈴薯脫毒種薯內(nèi)參基因的RT-PCR檢測Fig.1 RT-PCR analysis of actin in virus-free seed potatoes

2.3 不同級別脫毒馬鈴薯病毒檢測

對銀川市‘青薯9號’、‘青薯168’的原原種、原種、一級種的成熟期樣本進行病毒檢測,結(jié)果(圖4)表明:‘青薯168’和‘青薯9號’的3個級別種薯均可感染PVX、PVY、PVS和PLRV;經(jīng)方差分析,隨著種薯繁育級別增加4種病毒檢出率也增加,且差異顯著,如‘青薯168’原原種、原種和一級種PVY檢出率分別為2.7%、9.7%和27.7%。

圖2 馬鈴薯脫毒種薯中病毒RT-PCR檢測Fig.2 RT-PCR analysis of virus in virus-free seed potatoes

圖3 馬鈴薯不同生育期病毒檢出率Fig.3 Virus detection rate in potatoes during different growth periods

2.4 不同品種脫毒馬鈴薯病毒檢測

對銀川市、固原市及西吉縣3個基地的6個馬鈴薯主栽品種原原種成熟期樣品的病毒檢測結(jié)果(圖5)表明,‘青薯9號’、‘青薯168’、‘黑美人’、‘費烏瑞它’、‘隴薯3號’、‘大西洋’均為感病品種,都不同程度檢出PVX、PVY、PVS和PLRV;經(jīng)方差分析,PVX、PVY和PVS在6個品種中的檢出率無顯著差異,‘黑美人’中PLRV檢出率與‘青薯168’、‘費烏瑞它’和‘隴薯3號’PLRV檢出率有顯著性差異,檢出率分別為13.7%、8.0%、8.0%和7.0%。

圖4 不同級別馬鈴薯脫毒種薯成熟期病毒檢出率Fig.4 Virus detection rate of seed potatoes with the different seed class during mature period

2.5 不同種植環(huán)境脫毒馬鈴薯病毒檢測

對3個不同種植環(huán)境的馬鈴薯原原種成熟期樣品的檢測結(jié)果(圖6)表明:3個基地的原原種在成熟期均不同程度檢出PVX、PVY、PVS和PLRV;經(jīng)方差分析,西吉縣的大田開放式種植脫毒種薯基地的原原種中PVX、PVY、PVS和PLRV的檢出率分別為50%、41%、45%和61%,顯著高于固原市和銀川市防蟲網(wǎng)棚內(nèi)種植的脫毒種薯。

圖5 不同馬鈴薯品種原原種成熟期病毒檢出率Fig.5 Virus detection rate in pre-elite of the different potato varieties during mature period

圖6 不同種植環(huán)境中馬鈴薯原原種成熟期病毒檢出率Fig.6 Virus detection rate in the pre-elite planted in different environment during mature period

3 結(jié)論與討論

傳統(tǒng)的莖尖分生組織培養(yǎng)法脫除馬鈴薯病毒的難易順序為PVS、PVX、PVM、PVY、PVA和PLRV,以PVS和PVX最難脫除[14]。改進的溫熱療法與莖尖分生組織培養(yǎng)相結(jié)合[15]的脫毒方法、超低溫保存法[16]等,可以成功去除PVX。PSTVd不具有蛋白質(zhì)外殼,僅由RNA組成[17],無法通過莖尖剝離、組織培養(yǎng)除去,必須通過嚴格檢疫去除。我們對不同品種的馬鈴薯脫毒種薯檢測發(fā)現(xiàn),寧夏主栽品種均為感病品種,其中PVX、PVS的檢出率相對較高,未檢出PSTVd。由于寧夏主要采取莖尖剝離、組織培養(yǎng)的方法誘導(dǎo)脫毒試管苗[18],各單位脫毒水平和能力參差不齊,造成種苗脫毒不徹底,為病毒病的發(fā)生和傳播提供了初侵染來源。

對脫毒種薯不同生育期的病毒監(jiān)測發(fā)現(xiàn),病毒檢出率在馬鈴薯現(xiàn)蕾期以前較低,盛花期時病毒病在田間開始出現(xiàn)明顯癥狀,病毒檢出率出現(xiàn)顯著性增長。除了帶毒種薯,田間自生苗和其他寄主植物上也可能攜帶病毒成為初侵染源,在田間病毒主要通過蚜蟲傳播。根據(jù)寧夏六盤山地區(qū)蚜蟲類型及遷飛消長規(guī)律[19],馬鈴薯現(xiàn)蕾期和盛花期與蚜蟲為害和遷飛高峰期一致,由此造成病毒檢出率在馬鈴薯現(xiàn)蕾期后開始顯著增長。另外,馬鈴薯生產(chǎn)中常存在幾種病毒復(fù)合侵染的現(xiàn)象,國內(nèi)外研究表明[20-21],兩種或兩種以上病毒復(fù)合侵染可誘發(fā)比單一病毒更加嚴重的癥狀,因此,脫毒種薯生產(chǎn)過程中要加強多種病毒同時脫除,進而避免病毒復(fù)合侵染帶來更嚴重的損失。由于馬鈴薯病毒種類很多,且一種病毒往往有幾個株系,各株系在馬鈴薯不同品種上的反應(yīng)不同,因而抗病毒育種十分復(fù)雜,很難得到兼抗多種病毒的品種,因此有必要有針對性地對當?shù)刂饕《绢愋瓦M行品種選育工作。

在脫毒種薯的種植過程中嚴格的田間管理也可以有效地防止病毒病的傳播,脫毒種薯應(yīng)該嚴格按照行業(yè)標準規(guī)定在防蟲網(wǎng)室種植,但是我們在調(diào)查過程中發(fā)現(xiàn),有生產(chǎn)單位存在露天大田種植脫毒種薯的現(xiàn)象,這大大增加了種薯帶毒的幾率。世界上最大的種薯出口國荷蘭,建立了龐大的馬鈴薯標準體系,在國家法律、法規(guī)的保護下有效地實施,對馬鈴薯的產(chǎn)業(yè)發(fā)展起到了規(guī)范、監(jiān)督和管理的作用[22]。荷蘭的馬鈴薯生產(chǎn)者和經(jīng)營者必須申請種薯合格證,種薯生產(chǎn)要經(jīng)過嚴格的質(zhì)量檢驗,否則不能進入市場,嚴格的種薯檢測認證體系確保了荷蘭脫毒種薯的質(zhì)量,每年檢測樣品量300多萬份,出口80多個國家。雖然我國馬鈴薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展有國家標準和行業(yè)標準指導(dǎo)生產(chǎn),但是目前這些標準的指導(dǎo)作用和執(zhí)行力度不大,無法達到標準的水平[23],因此,必須借鑒荷蘭等種薯種植先進國家的經(jīng)驗,完善種薯生產(chǎn)體系,加大監(jiān)管力度,制定相關(guān)法律法規(guī),切實提高種薯生產(chǎn)質(zhì)量。

[1] Gebhardt C,Valkonen J P T.Organization of genes controlling disease resistance in potato genome [J]. Annual Review of Phytopathology,2001,39:79-102.

[2] 庫爾斯塔克. 植物病毒比較診斷指南[M]. 裴美云,譯. 北京: 農(nóng)業(yè)出版社, 1991.

[3] 李芝芳. 中國馬鈴薯主要病毒圖鑒[M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2004.

[4] 郭志乾, 董鳳林. 馬鈴薯病毒性退化與防治技術(shù)[J]. 中國馬鈴薯, 2004, 18(1): 48-49.

[5] 黃萍, 何慶才, 顏謙. 馬鈴薯不同級別脫毒種薯病毒再侵染情況及產(chǎn)量變化[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué), 2008, 36(4): 39-40.

[6] 張瓊, 孫永平, 夏明霞, 等. 江蘇丘陵地區(qū)馬鈴薯脫毒種薯栽培試驗研究[J]. 天津農(nóng)業(yè)科學(xué), 2012, 18(6): 129-130.

[7] 董文琦, 戴素英. 高產(chǎn)低耗規(guī)模化生產(chǎn)脫毒馬鈴薯原原種研究[J]. 華北農(nóng)學(xué)報, 2002, 17(Sl): 206-208.

[8] Barker H, McGeachy K D, Toplak N, et al. Comparison of genome sequence of PVY isolates with biological properties[J]. American Journal of Potato Research, 2009, 86(3):227-238.

[9] 程群,朱云芬,沈艷芬,等. 馬鈴薯S病毒RT-PCR檢測技術(shù)的研究[J].氨基酸和生物資源,2010,32(4): 8-11.

[10]閻文昭,蒲志剛,鐘婷婷. 四川省馬鈴薯病毒RT-PCR檢測體系的建立[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報,2010,23(6): 2171-2173.

[11]朱云芬,程群,沈艷芬,等.馬鈴薯X病毒的RT-PCR和IC-RT-PCR檢測[J].中國馬鈴薯,2012,26(6):370-373.

[12]董代幸,張祥林,羅明,等.馬鈴薯病毒一步法多重RT-PCR檢測技術(shù)的構(gòu)建[J].微生物學(xué)通報,2011,38(1):131-137.

[13]羅文彬,李華偉,湯浩,等.馬鈴薯5種病毒多重PCR檢測技術(shù)的建立及應(yīng)用[J].園藝學(xué)報,2015,42(2):280-288.

[14]安穎蔚, 孟令文, 張輝. 馬鈴薯脫毒及微型薯繁育技術(shù)體系的研究與應(yīng)用[J]. 雜糧作物, 2006, 26(3): 197-199.

[15]Lozoya-Saldana H, Merlin-Lara O.Thermotherapy and tissue culture for elimination ofPotatovirusX (PVX) in Mexican potato cultivars resistant to late blight [J]. American Potato Journal, 1984, 61(12): 735-739.

[16]白建明, 陳曉玲, 盧新雄, 等. 超低溫保存法去除馬鈴薯X病毒和馬鈴薯紡錘塊莖類病毒[J]. 分子植物育種, 2010, 8(3): 605-611.

[17]Diener T O.Potato spindle tuber " virus ". Ⅳ. A replicating, low molecular weight RNA [J]. Virology, 1971, 45(2): 411-428.

[18]聶峰杰, 張麗, 宋玉霞, 等. 寧夏馬鈴薯脫毒種薯生產(chǎn)及病毒檢測技術(shù)的現(xiàn)狀和發(fā)展途徑[J]. 中國種業(yè), 2014(7): 17-21.

[19]馬全保, 景治忠, 常亮, 等. 涇源縣脫毒馬鈴薯田蚜蟲遷飛消長規(guī)律的研究[J]. 中國馬鈴薯, 2009, 23(6): 347-349.

[20]Singh R P, Boucher A, Wang R G.Detection, distribution and long-term persistence ofPotatospindletuberviroidin true potato seed from Heilongjiang, China [J]. American Potato Journal, 1991, 68(1): 65-74.

[21]劉衛(wèi)平. 馬鈴薯類病毒與馬鈴薯Y病毒的互作及其對馬鈴薯產(chǎn)量的影響[J]. 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報, 2007, 19(1): 40-43.[22]陳曉瑞,趙明.馬鈴薯產(chǎn)業(yè)在寧夏農(nóng)村經(jīng)濟和糧食生產(chǎn)中的地位[M]∥陳伊里.馬鈴薯產(chǎn)業(yè)與糧食安全. 哈爾濱:哈爾濱工程大學(xué)出版社,2009：64-68.

[23]劉衛(wèi)平.黑龍江省馬鈴薯脫毒種薯繁育發(fā)展現(xiàn)狀與對策研究[D].北京:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院,2013.

(責任編輯：楊明麗)

Detection of virus on virus-free potatoes in Ningxia by RT-PCR

Nie Fengjie1, Zhan Hong2, Zhang Li1, Song Yuxia1, Gong Lei1, Gan Xiaoyan1,Chen Yuchao1, Shi Lei1, Zhang Guohui3

(1. Agricultural Biotechnology Centre, Ningxia Academy of Agriculture and Forestry Sciences,Yinchuan 750002, China; 2. Ningxia Propagation Center of Virus-free Seed Potatoes, Yinchuan 750024,China; 3. Ningxia Academy of Agriculture and Forestry Sciences Guyuan Branch, Guyuan 756000, China)

Virus disease is one of the important diseases on potato. Pre-elite, elite and qualifiedⅠ samples of different potato varieties under different growth periods were random collected from three potato reproduction bases in Yinchan, Guyuan and Xiji. PVX, PVY, PVS, PLRV and PSTVd were detected by RT-PCR. The results showed that except PSTVd, the PVX, PVY, PVS and PLRV can be detected during maturation of potatoes from three potato reproduction bases,with detection rate of 35%, 28%, 35% and 34%, respectively. The detection rate increased significantly after the beginning of budding period and showed significant increase with breed grade of seed potatoes. All six potato varieties were susceptible cultivars, and the detection rates of samples planted in the field were much higher than those planted in insect-proof nets chamber.

Solanumtuberosum; virus detection; RT-PCR

2016-01-26

2016-03-01

寧夏自然科學(xué)基金(NZ14210); 寧夏農(nóng)林科學(xué)院科技創(chuàng)新先導(dǎo)資金項目(NKYG-14-05，NKYG-15-06，NKYG-15-36，NKYG-15-32，NKYG-16-12，NKYQ-14-07)

S 435.32

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.05.033

* 通信作者 E-mail:Songyx666@163.com